T淋巴细胞中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种单克隆抗体及其应用，特别涉及一种抗鹅CD4胞外区单克隆抗体 及其在检测禽类外周血中CD4+T淋巴细胞中的应用，本发明属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] T淋巴细胞(简称T细胞)是重要的免疫活性细胞，具有直接介导细胞免疫应答和对 机体免疫应答起调节性的关键作用。在T细胞的不同发育阶段，细胞表面表达不同种类的受 体和表面抗原。T细胞根据功能的不同可分为不同的亚群，包括细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell,TC)，辅助性T细胞(helper T cell,ΤΗ)及抑制性T细胞（suppressor T cell,TS) 等。CD4表达于辅助性T细胞的表面。细胞免疫中，T细胞对于抗原的识别需要依赖T细胞抗原 受体（T cell receptor,TCR)和主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex，MHC)分子的相互作用，成熟的T细胞表达CD4分子，其作为标记的表面蛋白参与抗 原的识别过程。
[0003] CD4是一个单链的跨膜糖蛋白，表达在免疫细胞表面，例如辅助性Τ细胞，胸腺细 胞，巨噬细胞，单核细胞和树突状细胞。CD4蛋白包含4个Ig样区(D1-D4)，一个跨膜区和一个 与酪氨酸激酶p561ck相关的胞质尾区，而这个区域与T细胞的活化相关，CD4与MHCII类分子 相互作用是由于D1区域中保守的氨基酸与MHC Π 类分子非多形态的部分结合。
[0004] 禽类⑶4分子的研究远远落后于哺乳类。1999年Koskinen首次克隆了鸡⑶4分子的 cDNA，包含1990个核苷酸，其编码的开放阅读框包括402个氨基酸构成的含有4个Ig样区的 胞外区，24个氨基酸构成的疏水性的跨膜区以及33个氨基酸构成的胞质尾区，这整个cDNA 和人及鼠的序列同源性仅为24%，但在功能方面具有重要作用的氨基酸残基却具有高度保 守性。因此，鸡和哺乳动物的CD4分子在生物化学和功能上的相似性很明显。与猩猩和人的 CD4分子相比，鸡的CD4分子由于存在较多的糖基化位点而导致更显著的糖基化。鸭细胞的 免疫研究是从Wilkinson等用抗人的CD3抗体对鸭T细胞进行鉴定后才开始的。2005年 Kothlow等克隆获得了鸭⑶4基因，鸭⑶4分子的开放阅读框为1446bp，编码481个氨基酸，与 鸡⑶4分子的相似性为60.2%，与人⑶4分子的相似性为19.2%，且对鸭的⑶4进行真核表达 并制备出了单克隆抗体，而且还对鸭脾脏，胸腺，法氏囊及外周血液中的淋巴细胞类型进行 了鉴定，对其功能也做了研究。2013年X.Yan等从四川白鹅胸腺中克隆得到鹅的CD基因，基 因全长1940bp，含有一个1443bp的完整开放阅读框，共编码480个氨基酸。并对鹅的⑶4组织 表达谱进行了研究，以及利用免疫组化通过鼠抗鸭CD4单克隆抗体分析不同日龄鹅免疫组 织中的表达及分布。2013年本实验室魏双施等克隆了东北白鹅CD4基因并制备了抗鹅CD4胞 外区的多克隆抗体。
[0005] 单克隆抗体的研制为基础和临床免疫学研究创造了有利条件。针对CD分子单克隆 抗体可对动物的淋巴细胞进行分选，以研究特定表位、多肽或抗原分子的免疫应答类型及 相应细胞的功能。研究⑶3+、⑶4+、⑶8+T淋巴细胞的含量在临床诊断上有着重要的意义，可 以了解机体细胞免疫状态，免疫机制等。目前鹅CD4单克隆抗体制备的研究尚属空白，这限 制了对于鹅CD4分子功能的进一步探索及鹅免疫机理的研究。
[0006] 本项发明首次利用原核表达系统表达鹅CD4胞外区基因片段，以重组蛋白为免疫 原制备鹅CD4胞外区单克隆抗体，初步建立了可检测鹅CD4+T淋巴细胞的流式细胞术和激光 共聚焦方法，为揭示鹅T淋巴细胞发生、发育的规律、T细胞的信号转导、T细胞亚群的分类、T 细胞的组织分布、动态变化等研究及其在机体免疫防御中的作用，提供理论依据及物质基 础。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题之一是提供一种能够稳定分泌抗鹅CD4胞外区单克隆 抗体的杂交瘤细胞株以及由该杂交瘤细胞株分泌所产生的单克隆抗体。
[0008] 本发明所要解决的技术问题之二是提供所述单克隆抗体在制备检测禽类外周血 中⑶4+T淋巴细胞试剂中的应用。
[0009] 本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：
[0010] 本发明利用本实验室构建好的携带鹅⑶4胞外区的重组原核表达载体pET-30a-CD4ex，采用大肠杆菌Rosetta?(DE3)pLysS表达鹅CD4胞外区基因，得到重组蛋白rGopET-30a-CD4ex。以重组蛋白rGopET-30a-CD4ex为免疫原，正常免疫三次BALB/c小鼠，再加强免 疫一次，取BALB/c小鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选获得1株稳定分泌抗鹅 CD4胞外区单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为5A9,分类命名为抗鹅CD4胞外区单克隆抗体 杂交瘤细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京 市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号是:CGMCC N0.11192,保藏时 间是:2015年9月14日。
[0011] 进一步，本发明还提出了由保藏号为CGMCC N0.11192的杂交瘤细胞株分泌产生的 抗鹅CD4胞外区单克隆抗体。经抗体亚类试剂盒鉴定，杂交瘤细胞株5A9所产生的单克隆抗 体为IgG2a型。间接ELISA结果显示，所述单克隆抗体能与纯化的重组鹅CD4胞外区蛋白 rGopET-30a-CD4ex反应，同时也能够与分离的鹳外周血淋巴细胞发生反应。激光共聚焦及 流式细胞术结果显示该抗鹅CD4胞外区单克隆抗体也可以与鸡、鸭外周血淋巴细胞发生反 应。
[0012] 因此，更进一步的，本发明还提出了所述的抗i|CD4胞外区单克隆抗体在制备检测 禽类外周血中CD4+T淋巴细胞试剂中的应用。其中，优选的，所述禽类包括鹅、鸭以及鸡。
【附图说明】
[0013]图1为重组蛋白鹅CD4胞外区基因的SDS-PAGE鉴定；
[0014] M.蛋白质分子质量标准；1-5.诱导后的pET-30a空载体，rGopET-30a-CD4ex菌体诱 导前、诱导后、超声上清、超声沉淀；
[0015]图 2 为纯化的重组蛋白 rGopET-30a-CD4ex 的 SDS-PAGE;
[0016] M.蛋白质分子质量标准；1.纯化的rGopET-30a-CD4ex重组蛋白；
[0017] 图3为重组蛋白与兔抗鹅CD4胞外区多克隆抗体反应的抗原性鉴定；
[0018] Μ ·蛋白质分子质量标准；1 ·重组蛋白rGopET-30a-CD4ex; 2 ·诱导后pET-30a空载 体；
[0019]图4为细胞株染色体计数；
[0020] A.5A9杂交瘤细胞株;B.SP2/0细胞株；
[0021 ]图5为5A9杂交瘤细胞株分泌抗体稳定性分析；
[0022]图6为5A9杂交瘤细胞株单抗腹水效价的测定；
[0023]图7为5A9单克隆抗体反应性的I-ELISA鉴定；
[0024] 图8为5A9单克隆抗体对鹳⑶4胞外区蛋白的Western blot鉴定；
[0025] Μ ·蛋白质分子质量标准；1 ·重组蛋白rGopET-30a-CD4ex; 2 ·诱导后pET-30a载体；
[0026] 图9为5A9单克隆抗体对鹳外周血T淋巴细胞的Western blot鉴定；
[0027] M.蛋白质分子质量标准；1.鹳外周血T淋巴细胞；
[0028]图10为5A9单克隆抗体的间接免疫荧光鉴定(200X)结果；
[0029] A.质粒pcDNA3.1-⑶4ex转染的鸡胚成纤维细胞与纯化的5A9单克隆抗体的间接免 疫荧光分析;B.空载体pcDNA3.1 ( + )质粒对照；
[0030]图11为5A9单克隆抗体相对亲和常数的测定；
[0031 ]图12激光共聚焦鉴定5A9单克隆抗体的交叉反应性；
[0032] A.PBL DAPI染色；B.PBL FITC染色；C.A和B合并图像；
[0033] 图13流式细胞术分析5A9单克隆抗体的交叉反应性；
[0034] A. 5A9与淋巴细胞反应的流式分析;B.淋巴细胞流式分析的阴性对照。
【具体实施方式】
[0035]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0036]本发明实施例中所涉及的材料与试剂：
[0037] 1试验材料
[0038] 1.1试验动物
[0039] BALB/C小鼠，SPF级6周龄，购自长春亿斯实验动物技术有限责任中心；成年白鹅购 自哈尔滨松北区华宇养殖厂;成年鸭购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所;成年鸡购自 某养殖厂。
[0040] 1.2细胞、菌株及质粒