一株低毒力重组猪脑心肌炎病毒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物动物疫苗技术领域，尤其涉及一株低毒力重组猪源脑心肌炎病 毒，还涉及所述低毒力重组猪源脑心肌炎病毒的应用。
【背景技术】
[0002] 脑心肌炎病毒（Encepha 1 omyocardi t i s virus，EMCV)属于微RNA病毒科 (Picornaviridae)成员。EMCV对啮齿类、猪、老虎、牛、大象、以及人在内的多种灵长类动物， 致病性差异较大。某些EMCV分离株感染仔猪可引发急性致死性心肌炎，而感染母猪则会导 致流产、死胎等繁殖障碍。该病毒已成世界性分布，阻碍了养殖业的发展，也对人类的健康 造成影响。目前，全世界大概有40个毒株，从2005年至今，我国已分离到大约15个EMCV毒株， 为该病毒深入研究提供丰富的材料。
[0003] EMCV为单股正链RNA病毒，全长为7.8kb，包括5 ' UTR、3 ' UTR和中间一个较大的开放 阅读框(0RF)。该阅读框编码11个蛋白，包括4个结构蛋白￥?1、￥?2、￥?3、￥?4和7个非结构蛋 白2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D以及L蛋白。其中VP1的变异性最大，是EMCV重要的保护性抗原。随 着RNA病毒全长cDNA感染性克隆技术的建立，研究者可以有效体外转录出感染性RNA，以拯 救RNA病毒。目前，RNA病毒拯救系统至少有4种。先前报道的EMCV感染性克隆的构建都是将 全长病毒的cDNA置于T7/SP6启动子的控制下，利用外源T7/SP6RNA聚合酶在体外转录RNA基 因组，再转染易感细胞来拯救病毒，也有相关技术申请过专利。已有文献报道可以将体外转 录过程转移到细胞体内进行，将病毒全长cDNA置于真核启动子CMV控制下，利用细胞内的 RNA聚合酶I和RNA聚合酶II转录成RNA拯救病毒，该种方法产生的病毒量大约是前者的100 倍。现有技术中，还没有使用此种方法拯救猪脑心肌炎病毒的报道。
【发明内容】
[0004] 为了解决以上RNA病毒拯救中拯救猪脑心肌炎病毒方法方面存在的空白，本申请 公开了一株低毒力猪源脑心肌炎病毒。
[0005] 本申请还公开了上述一株低毒力猪源脑心肌炎病毒的应用。
[0006] 本申请是通过以下措施实现的：
[0007] -株低毒力重组猪源脑心肌炎病毒，是通过以下步骤构建得到的：
[0008] (1)提取猪源脑心肌炎病毒株总RNA，RT_PCT扩增目的基因片段，扩增用引物如下
[0009] AF 5-GCGTTAATTAAACCGTCTTGAAAGCCGGGGGTGGGAGATC-3
[0010] AR 5-TCAGCTAGCAATGGAAGCATATTAG-3
[0011] BiF 5-GCGTTAATTAACATTGCTAGCTGATCAAAATACAGAAG-3
[0012] BiR 5-CACAAAGTCAGCAGTTGCGTCTGCGT-3
[0013] B2F 5-GAAAACGCAGACGCAACTGCTGACTTTGTG-3
[0014] B2R 5-TCTCTCGAGAGCACCCTGTGGCTCAAAG-3
[0015] CRi 5-TTCGGCTTGGGATTTAAATATGCATTTTTTTTTTTTTTT-3
[0016] CR2 5-CTCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGTAATTCGGCTTGGGATTT-3
[0017] 以猪源脑心肌炎病毒总RNA作为模板，以六1?、811?、821?、以及0?1为特异性下游引物， 构建反应体系获得的A、、B 2、C片段的cDNA，分别以AF/AR，BiFMR，B2F/B2R，CF/CR 2为引物， 相应的cDNA为模板进行PCR反应，获得A、Bi、B2、C四个片段，然后利用MVB2R为引物，将也和 B2片段进行融合反应，获得B片段；
[0018] (2)将A、B、C片段分别与pEasy-simple Blunt克隆载体进行连接，转化感受态细 胞，培养，提取阳性重组质粒，分别得到重组质粒pEasy-A、pEasy_B和pEasy-C;
[0019] (3)利用双酶切的方法将C、B、A片段依次克隆至载体中，构建病毒全长cDNA克隆， 得重组质粒PCMV-NJ08;
[0020] (4)将重组质粒PCMV-NJ08转染BHK-21细胞，经过培养得到猪源脑心肌炎病毒株感 染性克隆rNJ08。
[0021] 所述的低毒力猪源脑心肌炎病毒，优选rNJ08接种BHK-21细胞，连续传代，第3、5、 10 代拯救病毒的 TCID50 为 107·66 ~108'5TCID5〇/mL〇
[0022] 所述的低毒力猪源脑心肌炎病毒，优选步骤(3)中利用双酶切的方法将C、B、A片段 依次克隆至载体中步骤如下：
[0023] pEasy-C质粒用PacI和Spel双酶切，构建连接体系利用T4连接酶将片段C克隆至用 同样酶切处理的的载体CMV-β，22 °C连接5h，转化Transl-Tl感受态细胞，获得的阳性质粒命 名为pCMV-C;然后pEasy-B质粒经PacI和Xhol双酶切，将酶切纯化后的B片段与PacI和Xhol 双酶切后的pCMV-C载体连接，获得阳性质粒命名为pCMV-BC;pEasy-A质粒用PacI和Nhel双 酶切，酶切纯化后的A片段与PacI和Nhel双酶切后的pCMV-BC载体连接，将A片段连入pCMV-BC载体中，获得阳性质粒命名为pCMV-NJ08。
[0024]所述的低毒力猪源脑心肌炎病毒，优选第6243位的T变成A，作为感染性克隆的遗 传标记。
[0025]所述的低毒力猪源脑心肌炎病毒，优选猪源脑心肌炎病毒为猪脑心肌炎病毒NJ08 株。
[0026] 所述的低毒力猪源脑心肌炎病毒在病毒拯救、病毒致弱机理及利用该病毒的cDNA 感染性克隆为载体插入不同病毒保护抗原基因、构建不同病毒的嵌合病毒来表达外源蛋白 以及由此开发出单价、双价或多价疫苗中的应用。
[0027]将灭活的低毒力猪源脑心肌炎病毒使用ISA15A和ISA206佐剂分别配制成灭活疫 苗。
[0028] ISA15A佐剂与抗原体积比为1:4，ISA206佐剂与抗原体积比为1: 1。
[0029] 所述的应用，优选使用BEI浓度0.002mol/L、28°C作用24h进行灭活。
[0030] 本研究采用体内转录的方法成功构建了B1CV反向遗传操作系统，拯救获得低毒力 重组病毒株rNJ08。将重组病毒进行灭活处理，加入ISA15A和ISA206佐剂分别配制成灭活疫 苗，接种小鼠后，均能有效地刺激机体产生较好的免疫反应，并能产生中和抗体。ISA15A和 ISA206佐剂对EMCV灭活抗原具有较好的佐剂作用，研制的EMCV灭活疫苗小鼠免疫保护率分 别为80 %和100 %。为该病毒致病机制及疫苗研制奠定了重要基础。
[0031] 本发明的有益效果：
[0032] 1、本申请克服现有技术的不足，首次将猪脑心肌炎病毒NJ08毒株的全长cDNA置于 CMV启动子控制下，采用DNA转染系统拯救病毒，获得重组病毒，方法简便易行，转染效率也 大大提尚并且更加稳定，广生的病毒量大；
[0033] 2、本申请采用DNA转染系统，获得猪源EMCV NJ08毒株的重组病毒，成功建立该病 毒cDNA感染性克隆，拯救获得病毒，体外复制特性与原始病毒相似，但对小鼠致病性明显减 弱，为该病毒致病机制及疫苗研制奠定了重要基础；
[0034] 3、本申请得到的低毒力猪源脑心肌炎病毒经灭活后制备成疫苗，保护率达到90% 以上，是一种安全且保护率高的灭活疫苗。
【附图说明】
[0035] 图1为EMCV NJ08株基因组全长cDNA克隆构建示意图；
[0036] 图2为EMCV NJ08cDNA的扩增，M:DNA分子质量标准；1:A片段;2:B片段;3:C片段；
[0037] 图3为重组质粒pCMV-NJ08酶切，M: DNA分子质量标准；1: pCMV-NJ08质粒；2: pCMV- NJ08质粒酶切产物；
[0038]图4为拯救病毒和亲本病毒在BHK-21细胞上产生的细胞病变；
[0039] 图5为拯救病毒rNJ08遗传标记的酶切鉴定，M:DNA分子质量；1 :rNJ08RT-PCR产物； 2: rNJ08RT-PCR 产物经 EcoI?酶切，3: NJ08RT-PCR 产物；4: NJ08RT-PCR 产物经 EcoR 頂每切； [0040]图6为拯救病毒和亲本病毒感染BHK-21细胞的间接免疫荧光；
[0041 ] 图7为rNJ08和NJ08在BHK-21细胞上的增殖曲线；
[0042]图8为拯救病毒与亲本病毒在BHK-21细胞上的蚀斑形成；
[0043]图9为同剂量（107TCID5Q)rNJ08和NJ08接种小鼠后的存活曲线；
[0044] 图10为小鼠脑组织免疫组织化学分析；
[0045] 图11为拯救病毒组与亲本病毒组相对于对照组小鼠脑组织病毒的含量；
[0046]图12为首免后3周小鼠 ELISA抗体滴度(p〈0.05);
[0047] 图13为二免后3周小鼠 ELISA抗体滴度(p〈0.05);
[0048] 图14为加强免疫后中和抗体水平(p〈0.05);
[0049] 图15为淋巴细胞增值转化试验(p〈0.05);
[0050] 图16不同佐剂灭活疫苗小鼠攻毒保护实验存活率数据；
[0051]图17不同抗原含量疫苗小鼠攻毒保护实验存活率数据；
[0052]图18攻毒后小鼠脑组织病理变化，A和C为发病小鼠脑组织，B和D为存活小鼠脑组 织；
[0053]图19攻毒后小鼠心脏病理变化，A为发病小鼠心脏，B为存活小鼠心脏。
【具体实施方式】
[0054]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步说明。
[0055] 1 材料
[0056] 1.1病毒与细胞
[0057] EMCV NJ08株由本实验室分离并保存；幼仓鼠肾细胞(BHK-21)由本实验室保存； ICR小鼠购自扬州大学实验动物中心。
[0058] 1.2主要试剂
[0059] Dulbecco ' s Modified Eagle Medium 购自 Gibico 公司；Pfu ULtra? II Fusion HS