以市售的酸性木聚糖酶制备烟草加工的辅助酶制剂及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于烟草复烤前添加的可提高烟草品级的酶制剂。 技术背景
[0002] 木聚糖酶(xylanase)是专一降解半纤维素木聚糖为低聚木糖和木糖的一组酶的 总称，主要有:① β-l，4-D-木聚糖内切酶(EC3.2.1.8)，简称木聚糖酶，功能是水解木聚糖主 链内部的1，4_糖苷键作用于木聚糖无侧枝区产生低聚糖和有侧枝的寡聚糖，水解产物主要 是木二糖和木寡糖，可使木聚糖溶液的粘度迅速下降。②β-l，4-D-外切木聚糖酶 (EC3.2.1.92 )，从木聚糖的非还原性末端，以单个木糖单位(糖基)为切割单位，水解将木糖 残基(糖基)使之成为木糖，使反应体系因木糖量的增加而还原性也增加。③β-D-木糖苷酶 (EC3.2.1.37)为外切酶，是木聚糖类半纤维素彻底降解为单糖的关键酶之一，从木聚糖水 解后的产物低聚木糖和木二糖的非还原性末端逐一水解切下木糖苷单位形成木糖。该酶能 够水解对-硝基苯-β-D-木糖基(PNPX)等人工底物。因 β-l，4_木聚糖外切酶(EC3.2.1.92)也 能水解低聚木糖和木二糖使木聚糖彻底降解为木糖，在这点上与β-木糖苷酶(EC3.2.1.37) 同属外切酶的功能相同。在多数资料中未将两种酶分列说明，仅少数资料明确木糖苷酶 (EC3.2.1.37)是水解低聚木糖和木二糖的。木糖苷酶存在于细菌和真菌中，一般不分泌到 细胞外为胞内酶（刘士清，张无敌，尹芳，等。沼气发酵实验教程。北京：化学工业出版社， 2013，ρ114-126,127-138)。大多数微生物产生的木聚糖酶的最适作用pH值在6~7,其中一 些微生物能够产生在较低pH条件下保持较高酶活力和稳定性的耐酸或酸性木聚糖酶，即酸 性木聚糖酶，这些微生物的木聚糖酶显示的酸稳定性，提供了以工业化生产的微生物酸性 木聚糖酶市售商品的来源（田永，等，酸性木聚糖酶的应用研究进展，粮油加工，2008，（5): 110 ~113)〇
[0003] 相关专利文献中，"一种复合酶制剂及将该复合酶制剂用于烟梗生产的工艺"（戴 丽君等，ZL2005101044436)研究了淀粉酶、果胶酶和木聚糖酶复合酶制剂，经复合酶处理后 的烟梗、梗膏和再造烟叶的水溶性糖含量有较大的变化。但不是单一的酸性木聚糖酶制品。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在提供以商品化的酶源制备单一的酸性木聚糖酶，用于新鲜烟草烘烤 后，对复烤前的片烟用水稀释替代片烟复烤的自然陈化时原有的第二润叶用水的烟草活性 添加剂，更好地降解烟草中的半纤维素，达到提高烟草品质的作用。
[0005] 本发明上述目的通过以下方法实现： (一)以市售的酸性木聚糖酶制备烟草加工的辅助酶制剂 该制剂酸性木聚糖酶的酶活力在50°C和pH4.5下为3000~4000U/mL。
[0006] 优选的，所述的酶制剂的酸性木聚糖酶的最佳酶活力为3500U/mL。
[0007] (二)制备本发明辅助酶制剂的方法 包括以下步骤： (1) 用pH4.5缓冲液溶解蛋白酶活性抑制剂PMSF，PMSF在缓冲液中的浓度为0.0 lmo 1/L， 再按缓冲液与水的体积比1:4稀释缓冲液;将市售的酸性木聚糖酶固体物酶源与稀释缓冲 液该两者按重量体积比1 g: 10~20mL混匀得混合液，加入NaCl搅拌溶解，混合液与NaCl的 重量体积比为〇. 75g /L;过滤，收集滤液作为待精制处理的粗酶液，静置。
[0008] 上述缓冲液为Britton-Robinsion缓冲液； 上述在市售的酸性木聚糖酶固体物酶源中加入PH4.5的稀释缓冲液的量与酶源的原始 酶活力呈正相关； (2) 步骤（1)静置lh的粗酶液，加入(NH4)2S〇4，（NH4)2S〇4浓度为25 %，缓慢搅拌溶解，静 置2h;继续按上清液体积加入(NH4)2S〇4浓度为至80%，静置过夜。离心要沉淀。收集的上清液 中补加 l〇%(NH4)2S〇4,再过夜，重复离心得二次沉淀，合并两次沉淀； 所述(NH4)2S〇4浓度为重量体积比； (3) 配制浓度为0.1%的EDTA溶液，该溶液与沉淀的体积比为1:2; 将步骤(2)收集的沉淀与pH4.5的稀释缓冲液按体积比2:1混匀后加入以上EDTA溶液， 静置，离心，得到去除金属离子的酶上清液； (4) 往酶上清液加入浓度为0.01%的蔗糖低聚物，酶上清液与蔗糖低聚物的体积比为 100:1，作为初制品，-8 °C冷冻干燥浓缩至初制品的1/8~1/10倍，得酶活力为3000~4000U/ mL浓缩的酸性木聚糖酶原液制剂，其中，浓缩的酸性木聚糖酶原液制剂的最佳酶活力为 3500U/mL； 所述蔗糖低聚物浓度为重量体积比。
[0009] 所述步骤（1)中的酶源原始酶活力5，000U/g，酸性木聚糖酶固体物与pH4.5的稀释 缓冲液该两者按重量体积比1 g: 10mL:酶源的原始酶活力10，000U/g，酸性木聚糖酶固体物 与pH4.5的稀释缓冲液该两者按重量体积比1 g: 20mL。
[0010]所述步骤(4)中可以浓度为0.01%的β-环糊精替代蔗糖低聚物，酶上清液与β-环糊 精的体积比为100:1，作为初制品，-8°c冷冻干燥浓缩至初制品的1/8~1/10倍，得酶活力为 3000~4000U/mL浓缩的酸性木聚糖酶原液制剂。
[0011 ]进一步，其中原液制剂的酶活力是以PH4.5的稀释缓冲液中加有Ca(N〇3)2、MgS〇4、 ZnS〇4和FeS〇4,其中，Ca(N03)2、MgS〇4、ZnS〇4和FeS〇4分别与缓冲液的重量体积比为0.3g / 100mL，以恢复酸性木聚糖酶酶活力，及在50°C下所测定的酶活力。
[0012] (三)应用酸性木聚糖酶作为烟草加工辅助添加的酶制剂的方法 该酶制剂以戊聚糖含量在11%~19%的烟草作为适宜的处理对象。
[0013] 所述的应用方法是:将酶活力为3000~4000U/mL的浓缩的酸性木聚糖酶制剂稀释 250倍作为片烟复烤前的第二次润叶用水，其使用的酶活力范围为12~16U/mL。
[0014] 优选的，所述的应用方法是:将酶活力为3500U/mL的浓缩的酸性木聚糖酶制剂稀 释250倍作为片烟复烤前的第二次润叶用水，其最佳酸性木聚糖酶酶活力为14U/mL。
[0015] 本发明的进步及意义是： 本发明中所用的起始酶源主要来源于市售的酸性木聚糖酶商品，该商品的酶活力为 5000U/g或10000U/mL，价格低，来源广。本发明产品为单一的酸性木聚糖酶产品，质量有保 障、应用易控制，效果稳定和良好。
[0016] 本发明以商品酶生产酸性木聚糖酶，商品酶源中有调制稳定其质量的填充物等； 酶源中还存在的金属离子、酶及蛋白质等杂物，这些杂物破坏了酸性木聚糖酶的产品质量 及处理烟草的效果，本发明通过纯化、浓缩的精制工艺尽可能地除去杂物，作为用于烟叶烘 烤后，在复烤前的加工过程中辅助添加的酶制剂。
[0017] 本发明烟草活性添加剂为一种能破坏烟叶中细胞壁，降解半纤维素，改善与提高 烟草品质的单一酸性木聚糖酶，酸性木聚糖酶的酶活力在3000~4000U/mL，最佳酶活力为 3500U/mL，性状为浓缩液酶制剂，适用于处理烟叶中戊聚糖(半纤维素)含量在11%~19%范 围内不同等级和不同产地的大多数品种烟草。
[0018] 本发明使用时将产品用水稀释250倍，代替片烟复烤时的第二次润叶用水，极其简 易，改善烟叶内在品质，提尚烟叶品级。
[0019] 本发明也可用于自然陈化但结果不理想的烟草，以及用于烟支制成前的改善。按 照本发明控制测定方法，酸性木聚糖酶产品具有2年以上稳定的商品特性。
[0020] 本发明在过氧化物相关的系列酶类并形成稳定产品的基础上，进行着水解酶类的 研究和开发，提高和改善了烟草品质，具有广泛应用前景。
[0021] 以下结合实施例及附图对本发明做进一步说明。
【附图说明】
[0022] 图1为酶源粗品酶而进行精制的具体制备方法。
【具体实施方式】
[0023] ( - )用市售的酸性木聚糖酶固体物生产酸性木聚糖酶发酵液 实施例1: (1)将原始酶活力为10,000U/g的酸性木聚糖酶固体粗制品按粗酶重50g与PH4.5的缓 冲液lOOOmL混勾得混合液;所述缓冲液是按1^;[1:1:011-1?013；[118；[011缓冲液2001111^与水8001111^稀 释的缓冲液，即二者体积比为1: 4。在混合液中按重量体积比为0.7 5 g / L加入0.7 8 7 5 g NaCl，搅拌充分溶解，过滤，收集滤液，静置lh待后续处理。
[0024]或者，将原始酶活力为5，000U/g的酸性木聚糖酶固体粗制品按粗酶重100g与 pH4.5的缓冲液1000mL混勾得混合液;所述缓冲液是按Britton-Robinsion缓冲液200mL与 水800mL稀释的缓冲液，即二者体积比为1:4。在混合液中按重量体积比为0.7