SEQ ID NO: 1，相应的氨基 酸序列为序列表中的SEQ ID NO:2。
[0048] 实施例2
[0049] 肌酸激酶突变体的制备
[0050] 以质粒p R S E T - c k m (见实施例1 )为模板，设计引物对1 0 0 Y F : 5 ' AGAGATGTATAATAGGAAAGAATATTCAGGAAC 3 ' 和 100YR: 5 ' TTCCTATTATACATCTCTGGCCTTTTTACCTCATA3 '。
[0051 ] 用引物对ckm-F和100YR扩增F-YR片段，用引物对100YF和ckm-R扩增YF-R片段。扩 增反应条件为：20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2S〇4,2mM MgS〇4,0.1% Triton X-100,50mM dATP，50mM dTTP，50mM dCTP，50mM dGTP，1.5U Pfu DNA聚合酶 (Promega，USA)，20ng pRSET-ckm，以及400nM引物ckm-F和400nM引物 100YR(或者，400nM引 物100YF和400nM引物ckm-R)，用无菌水调反应体积至50微升。
[0052] PCR扩增反应程序为:95°C3分钟，35圈循环:95°C50秒、52°C30秒和72°C3分钟，最 后72°C5分钟。经1%琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收，分别得到F-YR片段和YF-R片 段。
[0053] 然后扩增全长基因，扩增反应条件为：20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM (NH4)2S〇4,2mM MgS〇4,0.1%Triton X-100,50mM dATP，50mM dTTP，50mM dCTP，50mM dGTP， 400nM引物ckm-F和400nM ckm-R，1.5U Pfu DNA聚合酶，20ng F-YR片段与20ng YF-R片段， 用无菌水调反应体积至50微升。
[0054] PCR扩增反应程序为:95°C3分钟，35圈循环:95°C50秒、52°C30秒和72°C3分钟，最 后72°C 5分钟。经1%琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收，得到全长突变基因 F100Y。 [0055] 将F100Y片段回收并经限制性内切酶Ndel和BamHI酶切后与经同样限制性内切酶 Ndel和BamHI酶切的载体pRSET-A连接，得质粒pRSET-F100Y。将质粒pRSET-F100Y转入感受 态细菌细胞E.coli BL21，经DNA测序确定F100Y的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID N0:3所 不。
[0056] 实施例3
[0057]酶的提取与纯化
[0058]将含肌酸激酶亲本基因的质粒pRSET-ckm以及含肌酸激酶突变体基因的质粒 PRSET-F100Y分别转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡 那霉素)上37°C培养24小时。接种单个克隆于5毫升LB液体培养基(含50mg/L卡那霉素）中于 30°(：培养20-24小时。离心收集菌体，并悬浮于1毫升10011^1^ 8盐酸缓冲液(？!17.5)中。然 后用超声波裂解细菌细胞。离心（1〇°(：，17,80(^，10分钟)并收集上清液，即分别得肌酸激酶 亲本以及肌酸激酶突变体的粗提蛋白（或称粗提物）。
[0059]将上述得到的肌酸激酶亲本粗提蛋白以及肌酸激酶突变体粗提蛋白分别进行聚 丙烯酰胺凝胶电泳测试，其结果见附图1所示，图中，从左至右的三条泳道依次为蛋白分子 量标准、肌酸激酶亲本粗提蛋白（A)、肌酸激酶突变体粗提蛋白（B)，箭头所指示为目的酶的 位置。结果表明肌酸激酶亲本以及肌酸激酶突变体（目标带大小约为42kD)在大肠杆菌BL21 中均有表达，肌酸激酶突变体有较高的表达水平。
[0060] 实施例4
[0061] 酶活性的测定
[0062] 配制底物溶液：含100mM的肌酸（Creatine)、5mM的ATP、20mM的MgCl2、40mM三聚磷 酸钠和100mM Tris-HCl缓冲液，调pH至7.5。取底物溶液400微升，然后分别加入100微升的 肌酸激酶亲本以及100微升的肌酸激酶突变体于37 °C进行10分钟反应。离心（10 °C，17， 800g，15分钟）并收集上清液，通过高压液相色谱(HPLC)测定所得上清液中磷酸肌酸的含 量。一单位酶比活性定义为在上述条件下每分钟转化一微摩尔肌酸为磷酸肌酸所需之酶 量。测定结果为:肌酸激酶亲本的特异性活力为3.5U/mg，肌酸激酶突变体的特异性活力为 7.4U/mg。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定酶蛋白浓度，测定结果为:肌酸激酶亲本的酶比活 性为100,肌酸激酶突变体的酶比活性为211。
[0063] 实施例5
[0064] 固定化肌酸激酶突变体的制备
[0065] 取肌酸激酶突变体粗酶，用洗酶缓冲液(0.02M Tris-HCl/0.001M EDTA，pH7.0溶 液)稀释至蛋白含量为5-10mg/ml。将酶稀释液与PB溶液(2.0mol/L磷酸二氢钾，pH7.5)等体 积混合，加入酶固定化载体LX-3000 (10毫克酶/克载体），于摇床(转速lOOrprn)中25°C反应 20小时。反应完成后用滤袋过滤，用洗酶缓冲液清洗5-6次，得到固定化肌酸激酶突变体。
[0066] 实施例6
[0067] 用固定化肌酸激酶突变体制备磷酸肌酸
[0068] 配制底物溶液：含l〇〇mM的肌酸（Creatine)、5mM的ATP、20mM的MgCl2、40mM三聚磷 酸钠和100mM Tris-HCl缓冲液，调pH至7.5。取底物溶液1毫升，然后加入0.05克固定化肌酸 激酶突变体。于37°C进行反应2-20小时。离心（10°(：，17,80(^，15分钟）并收集上清液。通过 高压液相色谱(HPLC)测定所得上清液中磷酸肌酸的含量。结果表明：肌酸转化为磷酸肌酸 的转化率超过85 %。
【主权项】
1. 生物催化生产磷酸肌酸的方法，其特征在于：以肌酸和三磷酸腺苷为底物，在肌酸激 酶突变体的催化作用下生产磷酸肌酸，所述肌酸激酶突变体具有如SEQ ID N0:3所示的氨 基酸序列。2. 根据权利要求1所述的生物催化生产磷酸肌酸的方法，其特征在于:所述肌酸与所述 三磷酸腺苷的摩尔比为20:1。3. 根据权利要求1所述的生物催化生产磷酸肌酸的方法，其特征在于:所述催化过程还 需加入MgCl2和三聚磷酸钠。4. 根据权利要求1所述的生物催化生产磷酸肌酸的方法，其特征在于:所述催化过程是 在pH值为7~8的缓冲溶液中进行。5. 根据权利要求4所述的生物催化生产磷酸肌酸的方法，其特征在于:所述缓冲溶液为 Tris-HCl缓冲溶液。6. 根据权利要求1所述的生物催化生产磷酸肌酸的方法，其特征在于:所述肌酸激酶突 变体为固定在酶固定化载体上的固定化肌酸激酶突变体。7. 根据权利要求6所述的生物催化生产磷酸肌酸的方法，其特征在于:所述酶固定化载 体为环氧型LX-3000、二氧化硅、活性炭、玻璃珠或者大孔型聚N-氨乙基丙烯酰胺-聚乙烯。8. 根据权利要求6所述的生物催化生产磷酸肌酸的方法，其特征在于，所述固定化肌酸 激酶突变体的加入量为〇. 01-0.5g/ml缓冲溶液。9. 根据权利要求6所述的生物催化生产磷酸肌酸的方法，其特征在于，所述固定化肌酸 激酶突变体的制备方法包括以下步骤： (1) 制备洗酶缓冲液:〇.02M Tris-HCl和0.001M EDTA的混合溶液，pH值为7.0; (2) 制备PB溶液:2 · Omol/L磷酸二氢钾，pH值为7 · 5; (3) 用步骤（1)制备的洗酶缓冲液将所述肌酸激酶突变体稀释至5-10mg/ml，并将得到 的酶稀释液与步骤(2)制备的PB溶液等体积混合，再加入所述酶固定化载体，于摇床中反 应，所述酶固定化载体的加入量为10毫克酶/克载体； (4) 待步骤(3)反应完全后将所得反应液过滤，并用步骤（1)制备的洗酶缓冲液清洗，即 得固定化肌酸激酶突变体。10. 根据权利要求1至9任意一项所述的生物催化生产磷酸肌酸的方法，其特征在于，所 述肌酸激酶突变体的制备方法包括以下步骤： (1) PCR扩增具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的肌酸激酶亲本，扩增引物对如下 ckm-F:5 ' GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT 3 '， ckm-R:5 ' GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT 3 '； (2) 步骤(1)扩增的产物经限制性内切酶酶切后与载体连接，得质粒A; (3) 以步骤(2)得到的质粒A为模板，PCR扩增得F-YR片段，扩增引物对如下 ckm-F:5 ' GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT 3 '， 100YR:5 ' TTCCTATTATACATCTCTGGCCTTTTTACCTCATA 3 '； (4) 以步骤(2)得到的质粒A为模板，PCR扩增得YF-R片段，扩增引物对如下 100YF:5 ' AGAGATGTATAATAGGAAAGAATATTCAGGAAC 3 '， ckm-R:5 ' GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT 3 '； (5) 以步骤(3)得到的F-YR片段以及步骤(4)得到的YF-R片段 为模板，PCR扩增得全长突变体基因 F100Y，扩增引物对如下 ckm-F:5 ' GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT 3 '， ckm-R:5 ' GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT 3 '； (6) 步骤(5)得到的F100Y经限制性内切酶酶切后与载体连接，得质粒B; (7) 将步骤(6)得到的质粒B转化感受态细菌细胞中，对转化细菌进行增殖培养并诱导 表达，然后进行细胞破碎处理，提取即得肌酸激酶突变体。
【专利摘要】生物催化生产磷酸肌酸的方法，涉及磷酸肌酸的制备方法的技术领域。本发明提供的方法主要解决磷酸肌酸现有的生物催化生产方法产率低、成本高的技术问题，该方法具体为以肌酸和三磷酸腺苷为底物，在肌酸激酶突变体的催化作用下生产磷酸肌酸，所述肌酸激酶突变体具有如SEQ？ID？NO：3所示的氨基酸序列，该氨基酸序列的特点是将肌酸激酶亲本的氨基酸序列中第100位点的Phe突变为Tyr。该肌酸激酶突变体的比活性较肌酸激酶亲本高出111%，该方法使肌酸转化为磷酸肌酸的转化率超过85%，适于大规模工业化生产。
【IPC分类】C12P13/00
【公开号】CN105647986
【申请号】
【发明人】傅荣昭, 张琦
【申请人】邦泰生物工程(深圳)有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月8日