赤魟软骨蛋白抗氧化肽的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种动物软骨蛋白的制备方法，具体涉及一种赤魟软骨蛋白抗氧化肽的制备方法。
【背景技术】
[0002]赤魟(Dasyatis akajei)，属软骨鱼纲，下孔总目，鲼形目，魟科，魟属。赤魟为常见软骨鱼类，分布于我国沿海，也见于西江，直至广西南宁、龙州、桂平，以及日本、朝鲜半岛。
[0003]赤魟为我国常用海洋药物，本草中习称海鹞鱼，始载于《本草拾遗》。赤魟全身是宝，其肉、牙齿、尾刺等均可入药。赤魟肉具有滋阴补血，益肾通淋。主治小便不利，涩痛，男子白池霄淋，小儿府积。赤缸牙齿具有杀虫，截症，解毒等功效，能够治疗捧虐，痛捧症等疾病。赤魟肝具有养肝明目，滋补强壮，壮骨等功效。赤魟尾刺有毒，具有清热解毒，止痛，软坚散结等功效。赤魟鱼油有小毒，具有滋补强壮，活血降脂等功效。而现代药理也证明赤魟具有多种显著的药理活性，赤魟软骨黏多糖具有良好的抗凝血活性及降血脂作用，与现用抗凝血药物活性相当；赤魟尾刺20 %乙醇提取物可以抑制小鼠S180肉瘤的生长，赤魟软骨提取的多肽可以显著减少肝癌H22的毛细血管的数目和鸡胚绒毛尿囊膜新生血管的数目。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状提供一种能够清除自由基和抑制脂质过氧化作用的赤魟软骨蛋白抗氧化肽的制备方法。
[0005]本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为:一种赤魟软骨蛋白抗氧化肽的制备方法，其包括以下步骤:
I)赤魟软骨总蛋白粗提物的制备:称取孔鳐软骨切成小碎块，加入适量蒸馏水，在高速组织捣碎机中匀浆至糊状，将糊状的赤魟软骨浸于4?6倍体积的1.0 mol/L盐酸胍溶液中(含0.02 mol/L MES和0.02 mol/L EDTA，pH 7?8)，于4 °C下搅拌抽提36?48 h。提取液在4 °C下以4000?6000 r/min离心15?25 min，弃残渣收集上清液；上清液继续在4 °C、10000?12000 r/min离心15?25 min，取上清液用0.22 μπι微孔滤膜过滤除去不溶性杂质。将滤液装入分子截留量为8 000的透析袋中，用Tris-HCKpH 7.6)缓冲液于4 °C下透析24?48 h，透析袋内溶液即为赤魟软骨总蛋白粗提物。
[0006])赤魟软骨丙酮分级沉淀蛋白的制备:取赤魟软骨总蛋白粗提物在冰浴下缓慢加入预冷丙酮至丙酮浓度为30%，在-20 °C下静置4?6 h后，于4 °C、10000?12000 r/min高速离心20 min，取上清液，加入预冷丙酮至溶液最终丙酮浓度为60%，获得赤魟软骨60%丙酮沉淀蛋白，冻干，即为60%丙酮分级沉淀蛋白。
[0007])赤魟软骨丙酮分级沉淀蛋白的酶解:取赤魟软骨60%丙酮分级沉淀蛋白按照料液比Ig: 3?5 mL溶于Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L，pH 7.5?8.5)，按照60%丙酮分级沉淀蛋白重量的2.0?3.0%加入胰蛋白酶(1.9X 14 U/g)，于40 °C酶解3?5 h，然后于90 °C、10 min灭酶活，酶解液于4 °C、10000?12000 r/min离心15?25 min，弃残渣收集上清液，得软骨蛋白酶解液。
[0008])赤魟软骨蛋白抗氧化肽的制备:将上述酶解液采用3kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，冻干，得超滤酶解物;将超滤酶解物次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，得抗氧化肽。
[0009]作为优选，所述的步骤I)中的赤魟为赤魟(Dasyatis akajei)。
[0010]作为优选，所述步骤4)的离子交换树脂层析、凝胶柱层析和RP-HPLC纯化的具体过程为:
离子交换树脂层析:将上述超滤酶解物溶于双蒸水配成浓度为45?55 mg/mL的溶液，经过DEAE-52离子交换树脂层析柱，用水、0.1 mol/L、0.5 mol/I^Pl.0 mol/L NaCl溶液进行洗脱，流速为0.6?0.8 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于280 nm检测，按峰合并试管内溶液，比较各峰的DPPH自由基和羟基自由基的清除活性，选择活性最强组分冻干，即为离子交换层析酶解物；
凝胶柱层析:将上述离子交换层析酶解物溶于双蒸水配成浓度为45?55 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶Sephadex G_15柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，流速为0.6?0.8 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于280 nm检测，按峰合并试管内溶液，比较各峰的DPPH自由基和羟基自由基的清除活性，选择活性最强组分冻干，即为凝胶层析酶解物；
RP-HPLC纯化:将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80?100 yg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对DPPH自由基和羟基自由基的清除活性得I个高活性抗氧化肽Ile-Glu-Pro-His (IEPH)，ESI_MS测定分子量为494.55 Da。
[0011]再优选，所述RP-HPLC条件为:进样量10?15 yL;色谱柱Zorbax SB- Cis(250 mmX4.6 mm,5 μπι)；流动相:水-乙腈梯度洗脱(O?32min乙腈浓度由O匀速升至50%);洗脱速度0.6~1.0 mL/min;紫外检测波长280 nm。
[0012]与现有技术相比，本发明所提供的赤魟软骨蛋白抗氧化肽对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时，Ile-Glu-Pr0-His (IEPH)亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用；Ile-Glu-Pro-His (ΙΕΡΗ)具有安全无毒副作用、抗氧化活性强和易于消化吸收等优点，可以作为药品、保健食品和食品的添加剂。
【附图说明】
[0013]图1是本发明的DEAE-52离子交换树脂层析图。
[0014]图2是本发明的葡聚糖凝胶SephadexG_15层析图。
[0015]图3葡聚糖凝胶SephadexG-15制备酶解物的RP-HPLC^H
[0016]图4Ile-Glu-Pro-His (IEPH)的质谱图。
[0017]图5Ile-Glu-Pro-His (IEPH)的抗脂质氧化能力。
【具体实施方式】
[0018]以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0019]实施例:
赤魟软骨蛋白抗氧化肽的制备方法，制备工艺流程如下:赤魟软骨〃软骨总蛋白〃软骨60%丙酮沉淀蛋白〃胰蛋白酶酶解〃酶解物〃超滤〃离子交换层析〃凝胶过滤层析〃高效液相色谱制备"抗氧化肽。
[0020])赤魟软骨总蛋白粗提物的制备:称取孔鳐软骨切成小碎块，加入适量蒸馏水，在高速组织捣碎机中匀浆至糊状，将糊状的赤魟软骨浸于5倍体积的1.0 mol/L盐酸胍溶液中(含0.02 mol/L MES和0.02 mol/L EDTA，pH 7.0)，于4 °C下搅拌抽提48 h。提取液在4 °C下以4500 r/min离心20 min，弃残渣收集上清液;上清液继续在4 °C ^ 12000 r/min离心2011^11，取上清液用0.22 Mi微孔滤膜过滤除去不溶性杂质。将滤液装入分子截留量为8 000的透析袋中，用Tris-HCl(pH 7.6)缓冲液于4 °C下透析48 h，透析袋内溶液即为赤魟软骨总蛋白粗提物。
[0021])赤魟软骨丙酮分级沉淀蛋白的制备:取赤魟软骨总蛋白粗提物，在冰浴下缓慢加入预冷丙酮至丙酮浓度为30%，在-20 °C下静置5 h后，于4 0Ca2000 r/min高速离心20min，取上清液，加入预冷丙酮至溶液最终丙酮浓度为60%，获得赤魟软骨60%丙酮沉淀蛋白，冻干，得60%丙酮分级沉淀蛋白。
[0022])赤魟软骨丙酮分级沉淀蛋白的酶解:取赤魟软骨60%丙酮分级沉淀蛋白按照料液比Ig:4mL溶于Tris-盐酸缓冲液(0.05mol/L,pH 8.0)，按照60%丙酮分级沉淀蛋白重量的2.5%加入胰蛋白酶(1.9XlO4 U/g)，于40 °C酶解4 h，然后于90 °C、10 min灭酶活，酶解液于4 0