一种饲用蚕丝抗菌肽制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物饲料添加剂技术领域，具体涉及一种饲用蚕丝抗菌肽制剂及其制 备方法。
【背景技术】
[0002] 新华网在2015年11月23日报道，最近在牲畜和人身上发现了一种能对抗强效抗生 素的"超级细菌"基因，这意味着人类所用抗生素中的"最后一道防线"有被攻破的风险。研 究人员分析猪肉、鸡肉以及人类患者身上采集的细菌样本发现，存在一种特殊基因 MCR-1， 携带该基因的细菌对多粘菌素表现出强耐药性，并且这种耐药性还能够快速转移至其他菌 株。
[0003] 中国由于滥用各种抗生素、激素和违禁药品饲喂畜禽，而导致食品安全事件频发， 畜禽肉制品对外出口连年下降，我国猪肉、禽肉、禽蛋、肉类总产量均占世界首位，而出口总 量仅占世界肉类出口总量3.6%，由于动物饲养方面仍然存在卫生安全问题，欧盟、美国、日 本等发达国家至今未解除对我国动物源型食品进口限制。可见开发高效优质的生物饲料产 品替代抗生素、激素，生产绿色无公害、有机肉、蛋、奶是国家和全民食品安全需要的民生问 题。
[0004] 近几年来，人们研究开发出了饲用酶制剂、饲用微生物制剂、酸化剂、抗菌肽、寡聚 糖、大蒜素、中草药以及有机金属微量元素等抗生素替代品，这些绿色饲料添加剂得到了人 们的青睐，都是基于抑制有害菌增殖、促进有益菌增殖、改善肠道微环境的基础上进行研究 的，但总体来说，这些抗生素替代产品相对于抗生素而言，其作用效果仍有一定的差距。
[0005] 各种动物及家禽自幼小个体发育开始，体内就建立起平衡的微生物菌群，并有其 维持自身菌群稳态的机制，例如抗氧化因子、激素、蛋白、小肽等是维持机体微环境稳定的 重要因子。
[0006] 抗菌肽是1980年由瑞典科学家G. Boman等人在蚕丝中分离得到的一类具有抗菌活 性的碱性多肽物质，分子量在2000~7000左右，由20~60个氨基酸残基组成。这类活性多肽多 数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。本发明以天然蚕丝为原料，通过先进的工艺 设计保证了抗菌肽的活性及稳定性，项目最终获得具有抗细菌、抗霉菌、抗氧化等活性的绿 色、健康、无耐药性、环境友好、可代替饲料用抗生素的产品，从而达到更好的预防和治疗畜 禽疾病的目的。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种简便的蚕丝抗菌肽的制备工艺，客服现有霉菌毒素吸附 剂效果片面吸附霉菌毒素以及因使用抗生素带来的抗生素污染问题。
[0008] 为了上述目的，本发明实施的技术方案如下： 所述可以产生抗菌效果的抗菌肽，是由从桑蚕养殖户收购的废蚕丝作为抗菌肽制备的 原料。
[0009] 所述抗菌肽制备工艺方法如下： (1) 废蚕丝的预处理，称取一定量废蚕丝，利用碳酸钠溶液对蚕丝进行脱胶处理，以碳 酸钠溶液浓度、固液比和精炼时间作为废蚕丝预处理的影响因素，以脱胶率作为实验的考 察指标。
[0010] 所述步骤（1)碳酸钠溶液浓度为〇 · 2%-0 · 6%，固液比为1:30-1:70(g/mL)，脱胶时间 30-60min〇
[0011] 所述步骤（1)脱胶率，计算方法以采用烘干称重法测定处理前后试样的质量，分 别将未脱胶和已脱胶的丝素样品放入烘箱中，以（65±1) °C的温度将其烘至恒重，并放入 干燥器中进行冷却，在室温下稳定12 h后用电子天平分别称质量，即得脱胶蚕丝和未脱胶 蚕丝的干重，分别以施和此表示。脱胶率公式如下：
式中:Mi表示脱胶蚕丝干重，112未脱胶蚕丝干重 (2) 将步骤（1)所得到的脱胶蚕丝，采用氯化钙溶液溶解，溶解后的蚕丝采用超滤膜对 其进行超滤脱盐处理。
[0012 ] 所述步骤(2冲氯化钙溶液浓度为20%、30%、40%、50%，所使用的超滤膜为MWC01000 超滤膜。
[0013] (3)对步骤(2)分离得到的脱盐处理的脱胶蚕丝，采用碱性蛋白酶(Alcalase2.4L) 和风味蛋白酶(Flavorzyme)进行水解。
[0014] 所述步骤(3)中使用的复合蛋白酶配比为1:1 -1: 3，控制底物浓度3%_5%、加酶量 1%-2.5%、pH8-9、反应温度45 °C-65 °C、酶解时间2.5h-6.5h。本发明采用半微量凯氏定氮法 与甲醛法滴定氨基态氮联合测定蚕丝抗菌肽的得率。
[0015] (4)对步骤(3)经过酶水解得到的蚕丝抗菌肽溶液进行分离纯化，将蚕丝酶解液置 于的透析袋中对纯水透析，主要是利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开，透析 结束后，再用聚乙二醇6000浓缩至原体积的1/5，收集备用，即为蚕丝中的多肽物质。
[0016] (5)采用饱和的硫酸铵溶液沉淀步骤(4)制备的蚕丝多肽物质，得到蚕丝抗菌肽沉 淀。
[0017] (6)采用氯化钙溶解蚕丝抗菌肽沉淀，采用超滤膜过滤脱盐浓缩蚕丝抗菌肽。
[0018]所述步骤(6)使用的超滤膜为MWC01000膜。
[0019] (7)经浓缩过的蚕丝抗菌肽用离子交换层析和葡聚糖凝胶层析进行分离纯化，采 用考马斯亮蓝比色法进行跟踪检测，收集洗脱液。
[0020] 所述步骤（7)采用DEAE-52纤维素对蚕丝抗菌肽进行初步的分离纯化，采用 Sephadex -G25凝胶柱层析进行进一步的纯化处理， (8)合并步骤(7)收集的洗脱峰洗脱液，并按照洗脱峰的顺序依次编号，预冻处理后，采 用真空冷冻干燥机干燥，即得蚕丝抗菌肽粉末。
[0021 ] 所述步骤(8)洗脱液厚度液位高度控制在0.5-1 cm，洗脱液预冻温度为(-15°〇-(_ 18°C )，真空干燥机真空度为0.05MPa-0.08MPa，按照0°C-50°C程序降温，干燥时间12-24h。 [0022] (9)本发明提供了一种蚕丝抗菌肽制剂的分离制备方法，工艺采用酶法水解脱胶 蚕丝，制备过程环境温和，分离过程绿色环保，减少了因是由有机试剂带来的环境污染和能 源动力消耗，采用本工艺分离制备的蚕丝抗菌肽可以应用到饲料行业，因蚕丝抗菌肽具有 抗菌性能，所以可以在作为抗菌成分替代饲料添加剂中抗生素成分，所以本发明提供的蚕 丝抗菌肽产品的制备工艺将具有良好的发展前景。
【附图说明】
[0023]图1是本发明蚕丝抗菌肽制备工艺流程图。
[0024]图2是本发明DEAE-52离子交换层析柱层析梯度洗脱曲线图（柱子规格：20mm* 65cm)
[0025] 图3是本发明SAP-1组分Sephadex G-25葡聚糖凝胶柱层析洗脱曲线图（柱子规格 规格：l6mm*100cm)
[0026] 图4是本发明蚕丝抗菌肽Sephadex G-25葡聚糖凝胶纯度鉴定图谱（柱子规格规 格：16mm*100cm)
【具体实施方式】
[0027] 以下通过实施形式对本发明上述说明内容进行进一步的说明，一种饲用蚕丝抗菌 肽制剂及其制备方法，包括如下步骤： (1)分析天平称取l〇〇〇g废蚕丝，添加浓度〇. 5%的碳酸钠溶液300mL，提取40min，即得脱 胶蚕丝，以未脱胶蚕丝作为对照试验。
[0028] (2)将步骤（1)得到的未脱胶和已脱胶的丝素样品放入烘箱中，以（65±1) °C的温 度将其烘至恒重，并放入干燥器中进行冷却，在室温下稳定12 h后用电子天平分别称质量， 即得脱胶蚕丝和未脱胶蚕丝的干重，分别以施和此表示，计算脱胶率。
[0029] (3)利用40%的氯化钙溶液溶