了新的等温聚合反应模式。
[0074] 实验原理如图1所示，金基底上发夹结构的检测探针既含有溶菌酶的适体序列，又 具有剪切酶的识别序列。当在反应系统中加入溶菌酶时，通过溶菌酶与发夹探针上的适体 序列的特异性结合，发夹探针被打开，探针上的3'暴露出来，这样，纳米金上的引物探针就 能够与打开的发夹探针互补杂交。随后，以发夹探针为模板链，在聚合酶和dNTPs的作用下 从模板链的3'开始聚合生长。双链扩增产物的形成使发夹探针完全伸展，而且随着聚合反 应的进行将靶蛋白质-溶菌酶从适体链上替换下来，从而与其他的发夹探针结合，引发新的 等温聚合反应。这样就形成了基于靶蛋白质结合/替换循环的聚合反应模式。同时，由于发 夹结构的检测探针上还具有核酸内切酶的识别序列，核酸内切酶识别双链但仅切割单链， 当引物沿模板链聚合生长形成双链结构时，在内切酶的作用下，在双链的识别位点处会在 模板链对应的互补序列上形成缺口，随后再在聚合酶的作用下，引物链从缺口处继续沿模 板链聚合生长，将形成缺口的另一段单链替换下来，释放出的单链DNA由于具有较多与模板 链互补的序列，也能够和其他的发夹探针互补杂交，将发夹打开，从而引发新的等温DNA链 聚合剪切反应，结合靶分子的聚合替换循环放大，形成了双重循环放大体系。在整个循环体 系中，发夹结构的检测探针既作为识别元素，又作为聚合反应的模板，而靶蛋白质充当循环 聚合反应的引发器。由于靶分子和聚合剪切释放出的单链DNA都能够通过聚合反应被替换 下来从而引发循环的聚合反应，因此能够实现靶分析物的放大检测，即使样品中少量的靶 分子也能够产生明显的检测信号。因此，以DNA功能化的量子点为信号标记，通过监测共振 角的变化，实现靶分子的高灵敏检测。
[0075] 2.2金纳米粒子的表征
[0076] 利用透射电子显微镜（TEM)对合成的金纳米粒子(Au NPs)进行表征。如图2所示， Au NPs分散性良好，颗粒均匀，粒径约为41.5nm。
[0077] 2.3DNA功能化的金纳米粒子的紫外光谱表征
[0078]图3为DNA功能化的金纳米粒子的紫外-可见吸收光谱图，图中曲线a，b分别为DNA S2和S3的紫外吸收光谱图，在260nm左右处均有DNA的特征吸收峰，曲线c为金纳米粒子的紫 外吸收光谱，在大约530nm处出现了金纳米粒子的特征吸收峰，曲线d中可以同时观察到DNA 和金纳米粒子的两个特征吸收峰，表明DNA已成功的连接到了金纳米粒子上。
[0079] 2.4可行性研究
[0080]为了证明这一靶向激活循环放大SPR检测体系的可行性，我们在相同的实验条件 下进行了一系列对照实验。如图4所示，在没有聚合酶的情况下，聚合替换反应无法进行，靶 分子在与适体链结合打开发夹探针后，无法被释放出来引发循环的聚合替换反应，同样聚 合剪切放大也无法进行，无法进行信号放大，得到的共振角实时检测曲线如曲线b所示，与 空白溶液（曲线a)相近。在向反应体系中加入聚合酶，但是没有剪切酶时，只能发生靶分子 的聚合替换反应，DNA链的聚合剪切反应无法进行，检测信号有所增大。而当把靶分子聚合 替换和靶分子引发的聚合剪切放大协同引入反应体系时，与空白溶液的检测信号（曲线a) 相比，在溶菌酶存在的条件下，共振角显著增大（曲线d)。实验结果表明，基于适体识别的靶 向激活的循环放大体系能够充分地放大溶菌酶的SPR检测信号。
[0081 ] 2.5实验条件的优化
[0082]反应体系中，实验条件的选择对检测的灵敏度及选择性具有重要的意义，为了增 强整个反应体系的放大效率，提高检测灵敏度，减小非特异性吸附，我们对一系列反应条件 进行了优化，包括反应体系中反应温度、缓冲溶液的pH值、反应时间、固定在金基底上的发 夹DNA的浓度、纳米金生物条码探针中不同DNA的比例、酶的用量。具体的优化结果如下： [0083] 2.5.1缓冲溶液pH值的优化
[0084]反应体系缓冲液的性能对DNA的杂交效率，酶的反应活性以及识别探针与靶蛋白 质之间的反应有着较大的影响。因此我们考察了缓冲液的pH值对检测信号的影响。如图5所 示，缓冲液的pH值在6.5到7.4的变化范围内，SPR响应信号随着pH值的增长，pH值为7.4时达 到最大值，当pH值大于7.4时，检测信号逐渐下降。因此，我们选择7.4作为缓冲液的最佳pH 值。
[0085] 2.5.2反应温度的优化
[0086]循环反应中酶的活性以及DNA的杂交效率同样受到温度的影响，本实验在溶菌酶 的浓度为l.〇Xl〇_12M的条件下，对反应体系的温度进行了优化。如图6所示，在体系反应温 度从20°C到50°C的过程中，检测信号先增大后减小，当反应温度达到37°C时，获得最大的响 应信号。这可能是因为当温度低于37°C时，随着温度的升高，酶的活性相应提高，响应信号 不断增强，而当体系的反应温度大于37°C时，较高的温度能够使酶失活，从而影响反应动 力，抑制循环反应的进行。因此，我们选择37°C作为酶循环反应的最佳温度，这一温度也与 酶的最优反应活性温度相吻合。
[0087] 2.5.3捕获探针浓度的优化
[0088]固定在金基底上的发夹探针既含有溶菌酶的适体序列又具有剪切酶的识别序列， 因此在循环反应中，这一发夹探针一方面作为捕获探针将纳米金生物条码探针捕获，另一 方面以纳米金生物条码上的S2链为引物链，自身作为放大反应的模板，发生靶分子的聚合 替换反应以及靶分子引发的DNA链聚合剪切循环放大，从而放大反应效率。因此，综合考虑 反应体系的选择性和放大效率，发夹探针的浓度是一个重要的影响因素。高浓度的发夹结 构探针会增加杂交反应以及靶分子与适体识别反应的空间位阻，降低检测信号，另一方面 由于发夹探针还作为放大反应的模板，如果探针浓度过低，无法提供足够的模板与纳米金 生物条码上的S2链杂交，从而减少了纳米金探针的捕获，使检测信号降低。图7是扣除空白 后共振角检测信号强度随发夹探针浓度变化的关系图。在1.0 Χ10-12Μ溶菌酶存在的条件 下，在探针浓度从5.0 X 10_8Μ至1」5.0 X 10_7Μ的变化区间内，共振角的响应信号随着探针浓度 的增大而逐渐增强，在5.0 X 10_7M浓度处，能够获得最大的信号响应，当探针浓度大于5.0 X 10_7Μ时，随着探针浓度的增加，检测信号降低。实验证明，在探针浓度为5.0 X 10-7Μ时，能够 实现反应体系空间位阻和放大效率的平衡，获得最大的信号值。实验中我们选择5.0Χ10- 7Μ 作为基底上发夹探针的浓度。
[0089] 2.5.4纳米金生物条码探针比例的优化
[0090] 纳米金粒子上组装了两种不同功能的DNA分子，分别是捕获量子点信号探针的捕 获链DNAS3和能够与打开的发夹杂交互补，充当聚合反应前体的DNA S2APR响应信号的强 度受纳米金上这两种DNA分子比例的影响。捕获量子点的捕获探针比例大，纳米金颗粒上负 载的DNA量多，量子点的结合率高，SPR信号强度会相应增强，但是在纳米金粒子有限的负载 能力下，捕获探针的比例过大会造成空间位阻，一方面影响量子点上的DNA与捕获探针杂 交，另一方面也会抑制引物DNA S2与基底上发夹探针S1的杂交效率，从而降低金纳米粒子 在金基底上的结合效率，影响反应信号。反之，如果捕获探针比例过小，结合在纳米金上的 数量太少，无法提供足够的探针捕获量子点，同样也会降低SPR检测信号。因此，为了提高 SPR检测溶菌酶的灵敏度，我们对纳米金粒子上捕获探针DNA S3与聚合反应前体链DNAS2的 比例（1:1，5:1，10:1，20:1，30 :1，40:1，50:1)进行了优化。图8显示了3?财言号强度随条码比 例变化的关系曲线，从图中可以看出，条码比例在1:1至20:1的范围内，检测信号随着比例 的增加而增大，在20:1处达到最大值，随后SPR响应信号的强度随条码比例的增大而逐渐减 小。因此，我们选用20:1作为靶DNASPR检测中条码的最佳比例。
[0091] 2.5.5循环反应时间的优化
[0092] 孵育时间决定着循环放大SPR检测溶菌酶的响应信号大小，因为反应时间的长短 直接影响着DNA的杂交及随后的循环放大反应完成效率。因此，为了获得令人满意的分析性 能，我们对反应时间进行了优化，实验结果如图9所示，随着反应时间的增加，循环反应不断 进行，信号急剧增大，然后逐渐趋于平稳，当反应时间超过90分钟时，随着时间的延长，信号 变化趋势不明显，当反应时间增大，但信号出现平台时，说明反应达到饱和点，对应的时间 为反应的饱和时间。因此，综合考虑时间的损耗和放大效率的影响，我们选择90分钟作为最 优反应时间。
[0093] 2.5.6酶的用量优化