一种山核桃嫁接过程中小rna测序分析方法
【专利说明】一种山核桃嫁接过程中小RNA测序分析方法 【技术领域】
[0001] 本发明涉及山核桃无性繁殖栽培技术的领域，特别涉及一种山核桃嫁接过程中小 RNA测序分析方法。 【【背景技术】】
[0002] 山核桃是胡桃科山核桃属的一种油料木本树种，主要生长于浙西，是该地区的一 种具有特色的干果，它的经济价值比较高，由于山核桃具有童期较长，不容易采收以及园艺 栽培困难等问题，阻碍了山核桃的产业发展。但是植物嫁接手段无性繁殖里面比较重要阻 碍了山核桃的产业发展。但是植物嫁接手段无性繁殖里面比较重要栽培技术，是解决山核 桃采收困难和园艺化栽培的重要手段。
[0003] 小RNA是一种长度大约为21-24nt的非编码RNA分子，以往的研究表明小RNA在基因 表达、基因组表观遗传修饰等方面起着十分重要的调控作用。一般来说，小RNA分子是由双 链RNA或者分子内双链RNA这两种形式的转录前体产生的。目前已知的小RNA主要分为两大 类，也就是 mi RNA (mi croRNA)和siRNA( small interfering RNA)，这些小 RNA 对植物的生长 发育，维持基因组的稳定性以及适应外界环境的各种胁迫等方面都有着至关重要的作用。
[0004] 在植物中miRNA的靶基因是可以编码调控蛋白的一种转录因子，我们由此可知在 植物中miRNA主要是一种调控因子，对基因表达调控中起着重要作用。根据目前已有的研 究，miRNA在植物信号转导、器官的形态建成、生长发育及外界环境胁迫应答等生物学过程 都起着重要的作用。因此，分析小RNA的组成以及分布情况在山核桃嫁接过程中所起的功能 作用具有重要意义，为了提高山核桃在嫁接过程中的嫁接成功率，有必要提出一种山核桃 嫁接过程中小RNA测序分析方法。 【
【发明内容】
】
[0005] 本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种山核桃嫁接过程中小RNA 测序分析方法，其旨在解决现有技术中对小RNA的组成以及分布情况在山核桃嫁接过程中 所起的功能作用探索和分析较少的技术问题。
[0006] 为实现上述目的，本发明提出了一种山核桃嫁接过程中小RNA测序分析方法，包括 如下步骤：
[0007] 步骤一、材料准备:选取山核桃的嫁接枝条，选取砧木为两年生的实生苗，而接穗 则是留有一个健壮芽的大概约9cm左右长的一年生的苗，采取后迅速用锡箱纸包好放入液 氮罐，存放_70°C环境中备用；
[0008] 步骤二、枝条嫁接:将经过步骤一选取的山核桃站木和接穗进行嫁接；
[0009] 步骤三、提取总RNA:山核桃完成嫁接后，在0、7、14天对山核桃茎进行采样，将采集 的样品迅速用锡箱纸包好放入液氮罐，存放-70°C环境中备用，并提取样品的总RNA，总RNA 的提取步骤如下：
[0010] 1)在l〇ml离心管里面加入〇. 2ml的β-疏基乙醇和4mlCTAB，然后放入65°C的水浴锅 中预热；
[0011] 2)在样品中加入适量的PVP然后用预冷好的研棒磨细，分装在已经预热的离心管 里面，每一管大约4药匙然后利用涡旋仪混匀，然后将离心管放入65°C水浴锅中加热，期间 不时上下颠倒混匀加热30min，混合均匀后4°C，12000rpm，离心10min;
[0012] 3)将离心后的上清液转入新的10ml离心管里面，再加入等体积的24:1的氯仿：异 戊醇上下颠倒混勾后4°C，12000rpm，离心10min;
[0013] 4)重复第三步，直至中间层消失；
[0014] 5)将离心后的上清液转入新的10ml离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混 匀后在-20°C冰箱中静置30min~lh;
[0015] 6)将冷冻的离心管在4°C，12000rpm，离心10min，离心完成后将液体倒掉；
[0016] 7)在沉淀中加入600ul裂解液RTL Plus，4°C，13000rpm，离心30s，收集上清液，然 后加入0.5倍体积的无水乙醇，吹打混匀；
[0017] 8)将混合物加入到吸附柱RA中，4°C，13000rpm，离心30s，将废液倒掉；
[0018] 9)在吸附柱中加入750ul的去蛋白液RW1，在室温下放置lmin，13000rpm离心30s， 将废液倒掉；
[0019] 10)加入600ul的漂洗液RW，13000rpm，离心30s，将废液倒掉，重复一遍；
[0020] 11)将吸附柱RA放回到一个新的收集管里面，13000rpm，离心2min，尽可能的去除 漂洗液；
[0021] 12)将吸附柱AP放到一个干净灭菌离心管里面，并在吸附膜的中间部位加40ul ddH20,室温下放置lmin，12000rpm，离心lmin，获得溶解好的RNA;
[0022]步骤四、miRNA文库构建:将经过步骤三提取的三个时期的总RNA样本分别标记为 60、67、614,60设为对照组，11^1?嫩文库的构建具体过程如下
[0023] 1)先用1%琼脂糖的凝胶电泳与紫外分光光度计来检测RNA质量，用Aligent 2100RNA 6000Nano Kit来检测RNA整齐度；
[0024] 2)接着用15%的聚丙烯酰胺的变性凝胶来分离开小分子RNA，再用小片段RNA回收 的试剂盒来回收并且纯化长度为18~30bp之间的RNA，连接5'和3'接头来进行反转录合成； [0025] 3)最终进行PCR扩增，并且构建这些小分子RNA的cDNA文库；
[0026] 步骤五、小RNA Solexa测序分析：用Illumina HiSeqTM 2000平台来进行测序分 析，预测分析包括保守miRNA和新的miRNA序列预测及分析、山核桃miRNA差异表达分析和 miRNA与靶基因 qRT-PCR检测。
[0027]作为优选，所述的步骤三的2)中利用涡旋仪混匀的混匀时间为lmin，上下颠倒混 匀间隔时间为l〇min。
[0028] 作为优选，所述的步骤四的2)中5 ' 为5 ' -RACE-Ready cDNA，3 ' 为3 ' -RACE-Ready cDNA〇
[0029] 作为优选，所述的步骤五中保守miRNA和新的miRNA序列预测及分析方法为:将所 有数据合并过滤后将小RNA序列比对到该基因组，允许一个mismatch，采用比对软件SOAP。 为了更好的配对和后续的数据分析，将3个样本中的c 1 ean reads分别比对到NCBI和Rfam数 据库并允许一个错配。然后过滤掉rRNAs(核糖体RNA)，tRNAs(转运RNA)，scRNAs(细胞质内 小RNA)，snRNAs(核内小RNA)和snoRNAs(核仁小分子RNA)，将3个样本的数据合并比对到所 有植物非冗余成熟miRNA序列中，允许两个错配。将获得的序列使用RNAfold software来预 测其二级结构来确定是否保守，来获得保守miRNA的数目及家族分布。而剩余的miRNA，我们 将用Mireap软件进行新的miRNA预测。
[0030]作为优选，所述的NCBI数据库网址为http://www.ncbi .nlm.nih.gov/blast/Blas t · cgi，所述的Rfam数据库网址为http: //www. sanger .ac .uk/Sof tware/Rfam。
[0031]作为优选，所述的步骤五中山核桃miRNA差异表达分析的方法为:计算GO，G7和G14 这三个小RNA文库中miRNA的表达量，所述的miRNA表达量通过RPM值来计算，基于卡方检验 分别筛选3样本中的每2个样本之间的差异表达miRNA，筛选条件为P value < 0.05且差异倍 数在两倍以上的基因。
[0032] 作为优选，所述的RPM即每百万reads中来自于某基因的reads，所述的RPM值的计 算公式为：RPM=mapped reads X1000000/total reads，所述的Mapped reads为比对上的 reads数，所述的total reads为统计得到的总reads数。
[0033] 作为优选，所述的步骤五中miRNA与靶基因 qRT-PCR检测方法为：用5.8s rRNA作为 内参基因，qRT-PCR利用SYBR Green Real-Time PCR Master Mix和ABI Prism 7000 Sequence Detector试剂盒来检测miRNA的转录表达水平，PCR反应条件为94°C5min; 94°C 15s，60 °C 30s，共 40 个循环。
[0034] 本发明的有益效果:与现有技术相比，本发明提供的一种山核桃嫁接过程中小RNA 测序分析方法，通过对山核桃中三个小RNA文库的数据进行生物信息学分析能够确认21个 保守miRNA是属于13个miRNA家族，而10个新miRNA和8个潜在的新miRNA是属于15个miRNA家 族。在这些miRNAs中，选取12个保守miRNA进行表达分析，发现在山核桃嫁接过程中都具有 明显的差异性，并且2/3都是下调的。同样利用qRT-PCR对14个miRNA进行表达分析，发现表 达的趋势与Solexa测序数据分析结果相吻合。另外还预测了保守miRNA基因的89个靶基因 和新的miRNA基因的26个靶基因，对山核桃的嫁接理论知识有进一步的指导作用，也可以更 好的在山核桃高产、高效、生态和安全实践中指导生产实际。
[0035] 本发明的特征及优点将通过实施例结合附图进行详细说明。 【【附图说明】】
[0036] 图1是在山核桃中G0，G7以及G14三个sRNA文库中的不同种类sRNA reads的分布情 况图；
[0037] 图2是山核桃sRNA reads的大小分布情况图；
[0038]图3是山核桃嫁接0、7、14天后砧木和接穗中miRNA表达量分析及其qRT-PCR验证分 析图。 【【具体实施方式】】
[0039] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过