用于检测多种呼吸道病原体的pcr引物组、探针组及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于检测多种呼吸道病原体的PCR引物组、探针组及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 呼吸道感染是临床最常见的疾病之一，可由多种病原体引起，其中包括细菌、病 毒、支原体、衣原体等。其中急性呼吸道感染(Acute Respiratory Tract Infection，ARTI) 是世界范围内导致儿童患病和死亡的重要原因。世界卫生组织(WH0)2005年在《柳叶刀》杂 志发表文章报道:在2000-2003年，每年1060万5岁以下死亡儿童中，因传染性疾病死亡占 54 %，其中因肺炎死亡的患儿占19 %。ARTI的严格定义是所有的呼吸道感染，然而，实际上， 在严重呼吸道疾病中急性下呼吸道占据大多数，占世界范围内学龄前儿童死亡总数的 20%，其中90%为肺炎。大量的证据表明，营养不良、低出生体重、被动吸烟、人工喂养、经济 困难、居住环境拥挤、免疫功能缺陷、HIV感染是严重ARTI的危险因素，因此，大多数因急性 呼吸道感染死亡的病例发生在发展中国家。ARTI主要的致病微生物包括细菌和病毒，还包 括一些非典型病原体，如真菌、支原体、衣原体等，根据临床症状和影像报告临床工作者很 难将它们区分，因此病原分析对于临床诊断和治疗至关重要。
[0003] 传统检测呼吸道病原体的方法主要有培养方法、生化方法和免疫方法等，培养法 操作复杂，检测周期长、费用高，不适合作为临床样品的常规检测。生化检测方法操作简单、 快速，费用低，是目前门诊检验的常规检测方法;但该方法灵敏度和特异性不高，影响因素 多，不能区分病原体的具体种类。免疫检测方法快速简便;但一个检测只能针对其中一种病 原体。
[0004] 随着医疗水平的发展，用上述传统的方法已经不能满足对呼吸道病原体的检测， 临床上需要一种能够灵敏、特异，并且快速、简便的呼吸道多病原体鉴定检测方法，以便能 够更好的做到个体化的治疗、并满足对卫生防疫和疫情控制、进行传染病流行病学研究的 需求。
【发明内容】
[0005] 本发明的主要目的在于提出一种准确、快速、灵敏的用于检测多种呼吸道病原体 的PCR引物组、探针组、PCR反应液及试剂盒。
[0006] 其中，所述PCR引物组包括以下至少两对引物对：
[0007] 由序列表中SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0.2所示的两条序列组成的针对腺病毒的引 物对；
[0008] 由序列表中SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的两条序列组成的针对博卡病毒的 引物对；
[0009] 由序列表中SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示的两条序列组成的针对嗜肺军团菌 的引物对；
[0010]由序列表中SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示的两条序列组成的针对百日咳博德 特氏菌的引物对；
[0011]由序列表中SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示的两条序列组成的针对肺炎衣原体 的引物对；
[0012]由序列表中SEQ ID N0.11和SEQ ID N0.12所示的两条序列组成的针对肺炎支原 体的引物对。
[0013]所述探针组包括以下至少两条分子信标探针：
[0014]由序列表中SEQ ID N0.13所示的序列或其反向互补序列组成的针对腺病毒的分 子信标探针；
[0015] 由序列表中SEQ ID N0.14所示的序列或其反向互补序列组成的针对博卡病毒的 分子信标探针；
[0016] 由序列表中SEQ ID N0.15所示的序列或其反向互补序列组成的针对嗜肺军团菌 的分子信标探针；
[0017] 由序列表中SEQ ID N0.16所示的序列或其反向互补序列组成的针对百日咳博德 特氏菌的分子信标探针；
[0018] 由序列表中SEQ ID N0.17所示的序列或其反向互补序列组成的针对肺炎衣原体 的分子信标探针；
[0019] 由序列表中SEQ ID N0.18所示的序列或其反向互补序列组成的针对肺炎支原体 的分子信标探针；
[0020] 每一条分子信标探针的两端分别带有荧光基团和淬灭基团。
[0021] 优选地，每一条所述分子信标探针的整体为茎环结构，两端为互补的茎结构，中间 为与对应呼吸道病原体扩增产物特异杂交的环状结构。
[0022]优选地，每一条所述分子信标探针的熔解温度范围在55°C~80°C，至少两条所述 分子信标探针中若具有相同的荧光基团，则具有相同荧光基团标记的分子信标探针的Tm设 计成一定的梯度，差异在2°C以上。
[0023] 优选地，所述荧光基团选自FAM、HEX和TAMRA，所述淬灭基团为Dabcy 1。
[0024] 其中，所述PCR反应液，包含所述的PCR引物组和所述的探针组
[0025] 所述的试剂盒包括至少一人份所述的PCR反应液。
[0026] 本发明的有益效果包括：
[0027] 采用本发明的技术方案，可以检测并鉴别多种呼吸道病原体，而且该方法操作简 便、检测准确、灵敏、快速，4小时内可出结果。本发明利用多重PCR荧光分子信标熔解曲线技 术，PCR扩增后直接对产物进行熔解曲线分析，无需开盖分析，可有效避免产物污染;多色荧 光和熔解曲线相结合，保证了检测的足够通量，可进行多病原体的分型检测，应用分子信标 探针技术，检测的特异性高，成本较低，适合在临床大量推广使用。
【附图说明】
[0028]图1为本发明【具体实施方式】中的腺病毒(AdV)、博卡病毒(HBoV)的荧光熔解曲线 图；
[0029]图2为本发明【具体实施方式】中的嗜肺军团菌(LP)、百日咳博德特氏菌(BP)的荧光 熔解曲线图；
[0030] 图3为本发明【具体实施方式】中的肺炎衣原体(CP)、肺炎支原体(MP)的荧光熔解曲 线图。
【具体实施方式】
[0031] 本发明涉及对多种呼吸道病原体分型检测的PCR引物组、探针组、PCR反应液及试 剂盒。下面结合【具体实施方式】及附图对本发明作进一步详细说明。应该强调的是，下述说明 仅仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。
[0032] 根据本发明的实施例，对多种呼吸道病原体检测的PCR引物组、探针组、PCR反应液 及试剂盒将用于以下6种呼吸道病原体中的至少2种的分型检测，分别为：腺病毒、博卡病 毒、嗜肺军团菌、百日咳博德特氏菌、肺炎衣原体和肺炎支原体。
[0033] 在一些实施例中，可以通过PCR扩增待检者的鼻咽拭子呼吸道病原体的保守基因 片段，其中PCR引物序列优选为以下表1中的至少一对：
[0034] 表 1
[0035]
[0036] 其中，"F"表示上游引物，"R"表示下游引物。
[0037] 在一些实施例中，采用如下6条针对呼吸道病原体的分子信标探针中的至少两条， 分子信标探针的两端分别标记荧光基团和淬灭基团，探针序列如下表2:
[0038] 表2
[0039]
[00411其中FAM、HEX、TAMRA为荧光基团，Dabcyl为淬灭基团。每一条分子信标探针的熔解 温度范围在55°C~80°C，具有相同的荧光基团的分子信标探针的Tm设计成一定的梯度，即 差异在2°C以上。
[0042] 当然，在其他实施例中，每一条分子信标探针的荧光基团可以相同也可以不同，各 序列对应的荧光基团和淬灭基团不限于上述特定类型，且荧光基团和淬灭基团的位置也可 以互换。
[0043] 在其他实施例中，除了上述表2中的序列之外，本发明的分子信标探针的序列还可 以是对应于上述各序列的反向互补序列。
[00