]和0.41]的1]!11'脱脂乳。
[0059] 2)脂肪酶酶活检测步骤
[0060] a、将 50μ1 试剂1 分别和?ομL 脂肪酶酶活为 0.01U、(h05U、0.10U、0.2U、0.3U、(h4l^9 UHT脱脂乳加入96孔酶标板孔中，震荡混合，45°C下孵育5分钟；
[0061] b、分别向酶标板孔中加入?ομL试剂2,震荡混合，45°C下反应20分钟；
[0062] c、分别向酶标板孔中加入50μ1试剂3，震荡混合，45 °C下放置5分钟，终止反应并澄 清体系；
[0063] d、405nm波长下，测量吸光值，空白对照以蒸馏水或者去离子水代替UHT脱脂乳，其 吸光值计为A?，其余UHT脱脂乳的吸光值计为Α?隹。
[0064]以Afi稚与Α?的差值作为纵坐标y，以UHT脱脂乳中脂肪酶的酶活性作为横坐标X，制 作标准曲线，如图1所示，线性关系式为:y = 0.01002+0.99328x，R2 = 0.9893。
[0065] 所述酶活性的单位定义为:脂肪酶水解对硝基苯酯，每分钟释放Ιμπιο?对硝基苯酚 的酶量，表示为U/mL。
[0066] (3)利用标准曲线检测UHT脱脂乳中脂肪酶的酶活性
[0067] a、取三个UHT脱脂乳，分别编号为USMUUSM2和USM3,酶活性分别为0.30U/mL、 0.15U/mUP0.25U/mL;
[0068] b、将50μ1试剂1分别和三种10μ1未知脂肪酶酶活的UHT脱脂乳加入96孔酶标板孔 中，震荡混合，45 °C下孵育5分钟；
[0069] c、向酶标板孔中分别加入10yl试剂2,震荡混合，45°C下反应20分钟；
[0070] d、分别向酶标板孔中分别加入50μ1试剂3，震荡混合，45 °C下放置5分钟，终止反应 并澄清体系；
[0071] e、405nm波长下，测量反应后体系的吸光值Aim，根据图1所示的标准曲线即得到待 测UHT脱脂乳中脂肪酶的酶活性，结果如表1中所示，USM1、USM2和USM3的脂肪酶酶活分别为 0.310U/mL、0.157U/mL和0.255U/mL，检测误差小于0.6%，可见本发明检测方法具有较高的 准确性。
[0072]表1待测UHT脱脂乳脂肪酶活
[0073]
[0074] 实施例2、UHT全脂乳脂肪酶酶活检测 [0075] (1)检测脂肪酶酶活性的试剂盒 [0076] 组成同实施例1中。
[0077] (2)脂肪酶酶活性标准曲线
[0078] 1)不同脂肪酶酶活的UHT全脂乳的配制
[0079]分别配制脂肪酶酶活为 01]、0.011]、0.051]、0.101]、0.21]、0.31]和0.41]的1]!11'全脂乳。
[0080] 2)脂肪酶酶活检测步骤
[0081 ] a、将 50μ1 试剂 1 分别和 10μ1 脂肪酶酶活为 0.01U、0.05U、0.10U、0.2U、0.3U、0.4l^9 UHT全脂乳加入96孔酶标板孔中，震荡混合，45°C下孵育5分钟；
[0082] b、分别向酶标板孔中加入10μ1试剂2,震荡混合，45°C下反应20分钟；
[0083] c、分别向酶标板孔中加入50μ1试剂3，震荡混合，45 °C下放置5分钟，终止反应并澄 清体系；
[0084] d、405nm波长下，测量吸光值，空白对照以蒸馏水或者去离子水代替UHT全脂乳，其 吸光值计为Α?，其余UHT全脂乳的吸光值计为Α?隹。
[0085]以Afi稚与Α?的差值作为纵坐标y，以UHT全脂乳中脂肪酶的酶活性作为横坐标X，制 作标准曲线，如图2所示，线性关系式为:y = 0.08652+0.83572x.R2 = 0.97585。
[0086] 所述酶活性的单位定义为:脂肪酶水解对硝基苯酯，每分钟释放Ιμπιο?对硝基苯酚 的酶量，表示为U/mL。
[0087] (3)未知脂肪酶活UHT脱脂乳酶活检测
[0088] a、取UHT全脂乳，分别编号为UWM1、UWM2和UWM3，酶活性分别为0.45U/mL、0.20U/mL 和0.35U/mL;
[0089] b、将50μ1试剂1分别和三种10μ1未知脂肪酶酶活的UHT全脂乳加入96孔酶标板孔 中，震荡混合，45 °C下孵育5分钟；
[0090] C、向酶标板孔中分别加入1〇μ1试剂2,震荡混合，45°C下反应20分钟；
[0091 ] d、分别向酶标板孔中分别加入50μ1试剂3，震荡混合，45 °C下放置5分钟，终止反应 并澄清体系；
[0092] e、405nm波长下，测量吸光值Aim，根据图2所示的标准曲线即得到待测UHT脱脂乳 中脂肪酶的酶活性，结果如表2中所示，UWM1、UWM2和UWM3的脂肪酶酶活性分别为0.482U/ mL、0.027U/mL和0.257U/mL，检测误差小于0.6%，可见本发明检测方法具有较高的准确性。
[0093] 表2待测UHT全脂乳脂肪酶活
[0094]
【主权项】
1. 一种检测液态乳制品中脂肪酶酶活性的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包括独立 包装的试剂1和试剂2; 所述试剂1为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，所述试剂1的pH值为8.0~10.0; 所述试剂2为对硝基苯酯的乙腈溶液。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中，甘氨酸 的摩尔浓度为100~200mM，氢氧化钠的摩尔浓度为38~76mM; 所述甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的pH值为9.40。3. 根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂2中，所述对硝基苯酯的摩 尔浓度为40~60mM。4. 根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其特征在于:所述对硝基苯酯为对硝基苯 棕榈酸酯。5. 根据权利要求1-4中任一项所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括终止液； 所述终止液为乳品澄清剂。6. 权利要求1-5中任一项所述试剂盒在检测液态乳制品中脂肪酶酶活性或制备检测液 态乳制品中脂肪酶酶活性中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述液态乳制品为生鲜乳、巴氏奶、UHT乳 或复原乳。8. -种液态乳制品中脂肪酶酶活性的检测方法，包括如下步骤： (1) 配制至少5种标准液态乳制品，空白对照以蒸馏水或去离子水代替液态乳制品； (2) 将所述标准液态乳制品分别与权利要求1-5中任一项所述试剂盒中的所述试剂1于 酶标板中进行混合并孵育； (3) 向所述标准液态乳制品与所述试剂1的混合液中加入所述试剂2，进行反应;所述反 应结束后加入所述终止液进行终止反应;检测所述终止反应后的体系在发射波长为400~ 420nm下的吸光值，其中所述空白对照品的吸光值计为A?，脂肪酶的酶活不为零的所述标 准液态乳制品的吸光值计为稚，以所述标准液态乳制品的脂肪酶的酶活为横坐标，以Α?隹 与Α?的差值作为纵坐标，制作标准曲线； (4) 将待测液态乳制品与所述试剂1进行混合并孵育，然后重复步骤(3)，得到体系在发 射波长为400~420nm下的吸光值Aim;根据所述标准曲线和Affia，即得到待测液态乳制品中 脂肪酶的酶活性； 所述酶活性的单位定义为:脂肪酶水解对硝基苯酯，每分钟释放lymol对硝基苯酚的酶 量，表示为U/mL。9. 根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于:所述标准液态乳制品中脂肪酶的酶活 性为0~10U; 所述酶标板为96孔酶标板； 步骤(2)和(4)中，所述标准液态乳制品或所述待测液态乳制品与所述试剂1的体积比 为1:2~10; 步骤(2)和(4)中，所述孵育的温度为40~50°C，所述孵育的时间为3~10分钟； 步骤(3)中，所述试剂2与所述标准液态乳制品的体积比为1:0.5~1.5,所述反应的温 度为40~50°C，所述反应的时间为15~30分钟； 所述终止液与所述标准液态乳制品的体积比4~6:1，所述终止反应的温度为40~50 °C，所述终止反应的时间为3~10分钟； 步骤(3)和(4)中，检测体系在发射波长为405~412nm下的吸光值。10.根据权利要求8或9所述的检测方法，其特征在于:所述液态乳制品为生鲜乳、巴氏 奶、UHT乳或复原乳。
【专利摘要】本发明公开了一种高通量检测液态乳制品中脂肪酶酶活性的方法及其试剂盒。本发明提供的检测液态乳制品中脂肪酶酶活性的试剂盒，包括独立包装的试剂1和试剂2；所述试剂1为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，所述试剂1的pH值为8.0～10.0；所述试剂2为对硝基苯酯的乙腈溶液。本发明提供了利用所述试剂盒检测液态乳制品中脂肪酶酶活性的方法，为原料乳的分级提供了理论依据，同时可以制定适于生产加工各种液态奶的生鲜乳质量控制指标，如预测UHT乳货架期，科学指导UHT产品的分区销售，降低因残留脂肪酶酶活导致产品变质、维护企业利益和消费者健康等。本发明检测方法灵敏度高，脂肪酶的检测阈值低。
【IPC分类】G01N21/31
【公开号】CN105651715
【申请号】
【发明人】吕加平, 张维清, 逄晓阳, 刘鹭, 张书文, 芦晶
【申请人】中国农业科学院农产品加工研究所
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年1月25日