人Lp-PLA2生物素-链霉亲和素荧光免疫层析检测卡及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明公开了一种检测试剂卡，具体的说是，一种测定人血清、血浆或全血等样本 中的脂蛋白相关磷脂酶A2检测试剂卡，属于荧光免疫层析检测领域。
【背景技术】
[0002] 近年来，随着人们生活水平的提高，心脑血管疾病的发病率和死亡率都呈逐年上 升的趋势。心脑血管报告指出，我国心脑血管病现患人数达2.9亿，每5个成年人就有1人患 心脑血管病，每10秒钟就有1人死于心脑血管病，因此预防治疗心脑血管疾病已经刻不容 缓。
[0003] 心脑血管疾病的基础是动脉粥样硬化，而动脉粥样硬化是一种炎性反应性疾病， 在动脉粥样斑块的形成、进展和破裂的过程中均有炎性反应介质的参与，目前国际上已经 发现了 一种新的炎性标志物，即Lp-PLA2。
[0004] LP-PLA2，属于磷脂酶A2家族，主要由炎症细胞分泌。LP-PLA2是由441个氨基酸组 成的蛋白质，其分子量为45KDa。它能水解低密度脂蛋白上的氧化卵磷脂，生成促炎物质溶 血磷脂酰胆碱和氧化型游离脂肪酸，能促进动脉粥样硬化的形成和发展。
[0005] Lp-PLA2的检测能直接准确的反映血管内炎症的程度，并且可作为一个动态指标， 确定动脉粥样硬化疾病的进程;通过监测Lp-PLA2水平的变化，可以了解发生粥样硬化相关 的心脑血管栓塞性疾病的风险，并及时采取预防和治疗措施。
[0006] 目前，Lp-PLA2的检测方法主要有以下五种方法：
[0007] (1)酶联免疫分析法，该方法的检测灵敏度较高，但是操作过程繁琐，测定时间较 长，不太适合临床应用。
[0008] (2)连续监测法，该方法是根据酶的特性及定量原理，测定酶活力，然而许多因素 会干扰酶促反应过程，如时间、温度、PH、抗凝剂等;此法对配制的底物浓度要求严格，所需 仪器设备昂贵。
[0009] (3)化学发光酶免疫分析法，中国专利申请No.201510225148.X公开了一种基于化 学发光法检测Lp-PLA2试剂盒。该方法灵敏度高，但操作繁琐，需要特殊的发光底物-抗原/ 抗体连接物、容易出现交叉污染、需要大型分析仪器、试剂成本较高等缺点，限制了其大规 模的发展使用。
[0010] (4)胶体金检测法，该方法操作简单，但是灵敏度低，特别是样本中被测物质浓度 过低时很可能会出现漏检的情况，不利于心血管栓塞性疾病的预防。
[0011] (5)普通免疫层析法，中国专利申请No. 201310242801.4公开了一种检测人Lp-PLA2蛋白的荧光免疫层析试纸。该方法操作简单，但是灵敏度低，采用的荧光物质为异硫氰 酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、5-羧基-X-罗丹明。异硫氰酸荧光素的最 大吸收光波长为490~495nm，最大发射光波长为520~530nm，呈现黄绿色焚光;罗丹明最大 吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595~600nm，呈现橘红色荧光。这些荧光物质的荧 光寿命比较短，Stokes位移小，只有几十纳米，激发光谱和发射光谱通常有部分重叠，互相 干扰严重。
【发明内容】
[0012] 针对上述问题，本发明的目的是提供一种人Lp-PLA2生物素-链霉亲和素荧光免疫 层析检测卡，该检测卡能快速结合，而且反应不受外界干扰，具有高度特异性和稳定性。
[0013] 本发明提供的第一个技术方案是这样的：
[0014] -种人Lp-PLA2生物素-链霉亲和素荧光免疫层析检测卡，所述的检测试纸包括底 板，所述的底板上衔接样品垫，第一标记垫、第二标记垫、包被膜和吸收垫，其特征在于，所 述的标记垫包括第一标记垫和第二标记垫，所述的第一标记垫偶联荧光微球的抗Lp-PLA2 单克隆抗体1，所述的第二标记垫偶联生物素抗Lp-PLA2单克隆抗体2;所述的包被膜上设有 一条链霉亲和素检测线T线和一条羊抗鼠多克隆抗体质控线C线，两条线平行排列。
[0015] 为制备上述人Lp-PLA2生物素-链霉亲和素荧光免疫层析检测卡，本发明提供的第 二个技术方案是这样的：
[0016] 在PVC底上依次衔接样品垫，第一标记垫、第二标记垫、包被膜和吸收垫，其特征在 于，所述的第一标记垫的制备方法是将标记好的偶联荧光微球的抗Lp-PLA2抗体1的溶液喷 至第一标记垫;所述的第二标记垫的制备方法是将偶联生物素的抗Lp-PLA2抗体2的溶液喷 至第二标记垫上，放入35-40°C烘箱，干燥2~5小时;所述的包被膜的制备方法是:在硝酸纤 维素膜上缘，用0.01M PH7.4的roS将羊抗鼠多克隆抗体稀释到0.8-1.2mg/mL进行包被划 线;在硝酸纤维素膜下缘，用〇. 01M PH9.5的碳酸盐缓冲液将链霉亲和素稀释到4-6yg/mL进 行包被划线；
[0017] 其中：
[0018] 所述的偶联荧光微球的抗Lp-PLA2抗体1的制备方法依次包括下述步骤： [0019]1)向1!!!1〇.1]\1的2-0-吗啡啉）乙磺酸加入〇.24-〇.3611^〇.3以]\1稀土元素荧光微 球;再加入24-36yL，8-12mg/mL的1-( 3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸溶液和24-36μ L 40-60mg/ml Ν-羟基琥珀酰亚胺，室温震荡反应1~2小时，离心弃上清，收集沉淀，用0.1Μ 的MES缓冲液重悬，超声分散微球；
[0020] 2)取15yg抗LP-PLA2单克隆抗体1加入至步骤1)中，室温震荡反应1~2小时；
[0021 ] 3)按16-25yg/lmL的量，向步骤2)中加入牛血清白蛋白，封闭未偶联抗体的活化羧 基位点，反应30~60min;
[0022] 4)将偶联抗体的荧光微球溶液离心分离后弃去上清，加入500yL抗体保存液；
[0023] 所述的偶联生物素的抗Lp-PLA2抗体2的制备方法依次包括下述步骤：
[0024] 1)用DMS0配制浓度8-12mg/ml N-羟基琥珀酰亚胺生物素溶液；
[0025] 2)用硼酸盐缓冲液配制浓度为1~3mg/ml的抗体溶液；
[0026] 3)向步骤2)的每毫升的抗体溶液中加入80-120yg步骤1)制备N-羟基琥珀酰亚胺 生物素溶液，混合均匀并放入34-40 °C恒温箱中避光温育25-35min，
[0027] 4)向步骤3)每微克N-羟基琥珀酰亚胺生物素溶液加入0.16yL lmol/L的氯化铵， 室温孵育lOmin后，用PBS透析除去未结合的生物素，收集样品；
[0028] 5)将样品上lml的分子筛柱，再加0.2ml硼酸盐缓冲液至分子柱中，吹打，将滤芯倒 转放置于另一个离心管中，离心分离并且收集离心管中的溶液，即为生物素标记的抗体，置 4°C保存。
[0029] 进一步的，上述的一种人Lp-PLA2生物素-链霉亲和素荧光免疫层析检测卡的制备 方法，所述的样品垫的制备方法是将样品垫浸泡在样品垫缓冲液中，1小时之后取出，于室 温干燥16-18小时。
[0030] 进一步的，上述的一种人Lp-PLA2生物素-链霉亲和素荧光免疫层析检测卡的方 法，所述的样品垫缓冲液是含2wt % BSA、0 · 5wt %蔗糖、0 · 5wt % Tween的0 · 01M PB缓冲液。
[0031] 进一步的，上述的一种人Lp-PLA2生物素-链霉亲和素荧光免疫层析检测卡的方 法，所述的偶联荧光微球的抗Lp-PLA2抗体1的溶液和的偶联生物素的抗Lp-PLA2抗体2的溶 液的喷量均为1~5yL/cm 〇
[0032] 进一步的，上述的一种人Lp-PLA2生物素-链霉亲和素荧光免疫层析检测卡的制备 方法，所述的抗Lp-PLA2抗体1源于人Lp-PLA2抗原表位肽（1)，所述的人Lp-PLA2抗原表位肽 (1)的序列氨基酸序列SEQ ID NO. 1所示。
[0033] 进一步的，上述的一种人Lp-PLA2生物素-链霉亲和素荧光免疫层析检测卡的制备 方法，所述的抗Lp-PLA2抗体2来源于人Lp-PLA2抗原表位肽(2):所述的人Lp-PLA2抗原表位 肽（1)的序列氨基酸序列SEQ ID N0.2所示。
[0034] 进一步的，上述的一种人Lp-PLA2生物素-链霉亲和素荧光免疫层析检测卡的制备 方法，所述的质控线C线和检测线T线包被时的划线浓度均为为1 yL/cm，速度100mm/s。
[0035] 进一步的，上的一种人Lp-PLA2生物素-链霉亲和素荧光免疫层析检测卡的方法， 所述的2-(N-吗啡啉）乙磺酸的pH6.5。
[0036] 进一步的，上述的一种人Lp-PLA2生物素-链霉亲和素荧光免疫层析检测卡的制备 方法，所述的抗体保存液为含lwt %BSA，20wt %鹿糖，0. lwt %吐温-20和0. lwt %聚乙稀P比 咯烷酮的0.05M的pH9.0的Tris-HCl缓冲液。
[0037] 与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下有益效果：
[0038] (1)本发明提供的技术方案采用用链霉亲和素替代抗体包被硝酸纤维素膜，可避 免抗体包被硝酸纤维素膜时容易发生失活(或不易保存)的现象。
[0039] (2)本发明提供的技术方案通过生物素将抗体结合于链霉亲和素包被的硝酸纤维 素膜上，可克服传统双抗体夹心法由于包被的抗体结合能力不足产生的钩状效应，使检测 范围增宽。
[0040] 生物素标记捕获抗体、荧光微球标记检测抗体和样品中的抗原三者在标记垫上形 成复合物后，再通过生物素结合于链霉亲和素包被的硝酸纤维素膜上。由于链霉亲和素与 生物素之间亲和力极强，并且具有高度的特异性和稳定性，