具有增强的甲硫氨酸流出的用于甲硫氨酸生产的微生物的制作方法
【专利说明】具有増强的甲硫氨酸流出的用于甲硫氨酸生产的微生物 发明领域
[00011本发明涉及可用于生产L-甲硫氨酸和/或其衍生物的重组微生物和用于制备L-甲 硫氨酸的方法。本发明的微生物以下述方式修饰，使得通过将L-甲硫氨酸摄取系统的减弱 与特定的输出系统的过表达组合而提高甲硫氨酸/碳源得率。具体地，在重组微生物中，操 纵子metNIQ是缺失的，并且基因 ygaZ和ygaH或其同源基因是过表达。
【背景技术】
[0002] 含硫化合物（如半胱氨酸、高半胱氨酸、甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸)对于细胞代 谢是至关重要的。特别地，L-甲硫氨酸(一种必需氨基酸，其不能由动物合成)在许多身体功 能中发挥重要的作用。产业生产的大部分甲硫氨酸广泛用作动物饲料和食物添加剂。
[0003] 随着由于BSE和禽流感所致的动物来源蛋白质的使用减少，纯甲硫氨酸的需要已 经增加。通常，D，L_甲硫氨酸自丙烯醛、甲基硫醇和氢氰酸化学合成。然而，外消旋混合物性 能不像纯L-甲硫氨酸一样好(Saunderson，1985)。另外，虽然可以自外消旋甲硫氨酸生成纯 L-甲硫氨酸，例如经由N-乙酰基-D，L-甲硫氨酸的酰基酶(acylase)处理，但是这明显增加 生产成本。因而，与环境关切偶联在一起的纯L-甲硫氨酸的需要增加使甲硫氨酸的微生物 生产成为一种有吸引力的预期。
[0004] 其它重要的氨基酸(如赖氨酸、苏氨酸和色氨酸)经由发酵生产以在动物饲料中使 用。因此，可以使用葡萄糖和其它可再生资源作为起始材料来生产这些氨基酸。经由发酵工 业生产L-甲硫氨酸尚未获得成功，但是技术的开发在进行中。
[0005] 先前已经描述了用于优化微生物中的L-甲硫氨酸生成的不同办法(见例如专利或 专利申请US 7,790,424、US 7,611，873、W0 2002/10209、W0 2005/059093和W0 2006/ 008097);然而，从微生物中产业生产L-甲硫氨酸需要进一步改善。
[0006] 当L-甲硫氨酸以某个水平以上合成时，它经由反馈回路抑制其自身进一步生成， 并且破坏细胞的生理学。因此，这些改善之一是通过在重组L-甲硫氨酸过度生成者中降低 微生物的L-甲硫氨酸输入能力同时增强L-甲硫氨酸流出而降低L-甲硫氨酸在微生物中的 积累以确保有效生成。
[0007] 早期生物化学和动力学研究证明了大肠杆菌(Escherichia coli)中的甲硫氨酸 摄取牵涉至少两种特定的转运蛋白：高亲和力MetD和低亲和力MetP转运系统（Jones& George，1999;Kadner，1974)。这两者都受到内部甲硫氨酸池大小调节，并且对于MetD，已经 推断出Met J介导的阻抑（Kadner, 1975 ;Kadner&Winkler, 1975) JetD甲硫氨酸摄取系统表 征为ABC转运蛋白。在2002年，Merlin等报告了基因 abc、yaeC和yaeE构成（comprise)metD， 即编码甲硫氨酸摄取系统的基因座。他们提出分别将abc、yaeE和yaeC重命名为metN、metI 和metQ〇
[0008] 甲硫氨酸输出在大肠杆菌中由复合物YgaZH及在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中由同源复合物BrnFE介导（Tl?Scliel等，2005) JgaZ是负责输出L-结|氨酸和 L-甲硫氨酸的支链氨基酸输出蛋白（exporter) (LIV-E)家族的成员。YgaZ与YgaH(-种预测 的内膜蛋白）形成复合物以在其水平会对细胞有毒性的条件下输出氨基酸。
[0009] 专利申请W0 2002/097096和W0 2005/085463涉及通过减弱MetD2甲硫氨酸摄取系 统，尤其通过缺失基因 yaeC、abc和yaeE中的一个或多个降低棒杆菌属(Coynebacterium)中 的L-甲硫氨酸摄取。在棒杆菌属中，MetD2甲硫氨酸摄取系统的减弱导致改善的甲硫氨酸生 成。由metN、metI和metQ基因编码的同源MetD甲硫氨酸摄取系统也已经在大肠杆菌中得到 表征（Jones&George, 1999;Kadner 1974，Merlin等，2002)。专利申请W0 2008/127240公开 了在大肠杆菌中与在棒杆菌属中一样，当减弱MetD甲硫氨酸摄取系统时，甲硫氨酸生成是 增加的。
[0010] 专利申请EP 1239041和W0 2008/082211描述了在大肠杆菌中过表达负责输出L-缬氨酸和L-甲硫氨酸的支链氨基酸输出蛋白（YgaZH)。此过表达导致大肠杆菌中改善的甲 硫氨酸生成。
[0011] Ti-0tschel等在谷氨酸棒杆菌中过表达编码BrnFE甲硫氨酸输出蛋白的brnF和 brnE基因并且同时缺失metD系统（TrotSChe丨等，2005)。虽然如此，在谷氨酸棒杆菌中和在 大肠杆菌中都尚未发表这些修饰对甲硫氨酸生成的影响的任何证据。
[0012] 与关于谷氨酸棒杆菌和关于大肠杆菌的现有技术不同，发明人已经显示了在大肠 杆菌中仅缺失metD(通过从操纵子metNIQ中缺失一种基因或者通过缺失整个操纵子实现， 缺失此操纵子的任何单一基因导致高亲和力甲硫氨酸摄取的消除)不足以改善甲硫氨酸生 产性能。必须将此修饰与L-甲硫氨酸输出系统的过表达组合。
[0013] 于是，这是第一次显示了 L-甲硫氨酸摄取系统的缺失与L-甲硫氨酸输出的过表达 的组合对于甲硫氨酸生成是有益的。
[0014] 发明概述
[0015] 本发明涉及用于优化甲硫氨酸和/或其衍生物生产的重组大肠杆菌菌株和方法， 其中甲硫氨酸输入是减弱的，并且甲硫氨酸流出是增强的。在重组微生物中，通过减弱至少 一种选自metN、metI或metQ的基因的表达或者缺失至少一种选自metN、metI或metQ的基因 而减弱甲硫氨酸输入，而通过过表达基因 ygaZH或其同源基因而增强甲硫氨酸流出。
[0016] 重组微生物还可包含其它遗传修饰，如：
[0017] -至少一种下述基因的增加的表达：ptsG、pyc、pntAB、cysP、cysU、cysW、cysA、 cysM、cysJ、cysI、cysH、gcvT、gcvH、gcvP、lpd、serA、serB、serC、cysE、metF、metH、fIdA、 fpr、metA、编码对S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸具有降低的反馈敏感性的酶的metA*等位 基因、thrA、或编码对苏氨酸具有降低的反馈抑制的酶的thrA*等位基因和/或
[0018] -下述基因之一的减弱的表达：metJ、pykA、pykF、purU、ybdL、udhA、dgsA、metE 或 yncA〇
[0019] 在一个具体的实施方案中，本发明涉及重组微生物，其中：a)基因 metN、metI和 metQ是缺失的，而基因 ygaZ和ygaH或它们源自克氏梓檬酸杆菌(Citrobacter koseri)、弗 氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)、肠 杆菌属菌种(Enterobacter sp.)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia ente:rocolitica)、发 光光杆状菌（Photorhabdus luminescens)、杨氏梓檬酸杆菌（Citrobacter youngae)或弗 氏梓檬酸杆菌（Citrobacter freundii)的同源基因是过表达的，和b)基因 metA*、metH、 cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF、serA、serB、serC、cysE、thrA* 和 pyc 的表达是增强的；和c) 基因 metJ、pykA、pykF、purU、ybdL、yncA、dgsA、metE和udhA的表达是减弱的。
[0020] 发明详述
[0021] 在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于具体例示的方法，并且当然可以有 所变化。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述本发明的具体实施方案，而并不意图为 限制性的，其仅会以所附权利要求限定。
[0022] 本文中（无论在上文还是在下文）引用的所有出版物、专利和专利申请在此通过提 述以它们的整体并入。
[0023] 此外，除非另有指示，本发明的实践采用本领域技术内的常规微生物学和分子生 物学技术。此类技术是技术人员公知的，并且在文献中完整解释。
[0024] 必须注意到，如本文中及所附权利要求中使用的，单数形式"一个"、"一种"和"该/ 所述"包括复数指称，除非上下文另有明确规定。如此，例如提及"微生物"包括复数的此类 微生物，并且提及"内源基因"是指一个/种或多个/种内源基因，等等。除非另有定义，本文 中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的 意义。虽然与本文中描述的材料和方法相似或等同的任何材料和方法可以用于实施或测试 本发明，但是现在描述优选的材料和方法。
[0025] 在所附权利要求中及在本发明的连续描述中，除了上下文由于表达文字或必要含 意而另有要求的情况外，词语"包含"、"含有"、"牵涉"、或"包括"或变型以包括在内的意义 使用，即，以详明所述特征的存在，而不是排除本发明的多个实施方案中的其它特征的存在 或添加。
[0026] 术语"甲硫氨酸"和"L-甲硫氨酸"指具有化学式H02CCH(NH2)CH2CH 2SCH3和用于特定 L-异构体的CAS编号59-51-8或63-68-3的必需含硫氨基酸。
[0027] "甲硫氨酸的衍生物"指呈现相同化学主链但是与甲硫氨酸相差至少一个化学基 团的类似甲硫氨酸的分子。在本发明中，优选的甲硫氨酸衍生物是N-乙酰基甲硫氨酸 (NAM)、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和羟基-甲硫氨酸(或甲硫氨酸羟基类似物或MHA)。
[0028] 如本文中使用的，术语"微生物"指没有人工修饰的细菌、酵母或真菌。优选地，微 生物选自下组:肠杆菌科(￡]1〖61'0&&(^61^&〇6&6)、芽抱杆菌科(13&(3；[11&06&6)、链霉菌科 (Streptomycetaceae)和棒杆菌科(Corynebacteriaceae)。更优选地，微生物是埃希氏菌属 (Escherichia)、克雷伯氏菌属（Klebsiella)、泛菌属（Pantoea)、沙门氏菌属 (Salmonella)、或棒杆菌属(Corynebacterium)的菌种。甚至更优选地，本发明的微生物是 菌种大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。
[0029] 如本文中使用的，术语"重组微生物"或"经遗传修饰的微生物"指在自然界中找不 到，并且与其在自然界中找到的等同物有遗传差异的细菌、酵母或真菌。这意味着它通过导 入或者通过缺失或者通过修饰遗传元件来修饰。它也可以通过将定向诱变和特定选择压力 下的进化组合，从而迫使新代谢途径的形成和进化来转化（见例如W0 2004/076659或W0 2007/011939)。
[0030] 若外源基因与容许它们在宿主微生物中表达的所有元件一起导入微生物中，则微 生物可以修饰为表达这些基因。用外源DNA修饰或"转化"微生物对于本领域技术人员是常 规任务。
[0031] 微生物可经修饰以调控内源基因的表达水平。
[0032] 术语"内源基因"意指基因在任何遗传修饰前存在于微生物中。可通过在内源调节 元件外引入异源序列或者