一种蜜蜂肽表达载体及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种表达载体的构建方法，特别是涉及一种蜜蜂肤表达载体及其构建 方法和应用。
【背景技术】
[0002] 蜜蜂肤（apidaecin，简称A巧是一类来源于膜翅目昆虫的富脯氨酸的多肤，最早 从蜜蜂的淋己液中分离得到，一般含有16~18个氨基酸残基，其对多种革兰氏阴性菌，特 别是肠杆菌科，具有很强的伤杀作用，而对包括乳酸乳球菌在内的革兰氏阳性菌不起作用， 并且对真核细胞没有毒性作用，因此在食品和饲料添加剂、医药工业和植物抗细菌病基因 工程上有着广阔的应用前景。
[0003] 由于蜜蜂肤在昆虫中的含量较少，直接从昆虫淋己中纯化蛋白成本较高，不利于 工业化生产，因此人们日渐尝试在不同的表达系统中对蜜蜂肤进行表达，例如大肠杆菌和 酵母等表达系统。然而，抗菌肤在外源基因表达中存在基因表达量低、表达产物易降解、表 达产物活性低、抗菌肤易对宿主菌产生毒害等问题。
[0004] 近年来，随着泛素融合技术在多种外源基因表达中的应用，也有将泛素基因与蜜 蜂肤融合后在乳酸乳球菌中进行表达的相关报道。然而，该表达系统表达量较低，表达产物 的最高产量仅为宿主菌可溶性蛋白的10% W下；此外，该表达系统需要裂解细胞来释放蜜 蜂肤，提取工艺操作相对复杂，不利于蜜蜂肤的大规模制备。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种蜜蜂肤表达载体及其构建方法和应用，用于解决现有技术的蜜蜂 肤表达系统表达量低、蜜蜂肤提取工艺操作复杂等技术缺陷。
[0006] 本发明提供的一种蜜蜂肤表达载体的构建方法，包括如下步骤：
[0007] 1)合成含编码TEV蛋白酶的表达操纵子基因；
[0008] 2)合成含编码木聚糖酶与蜜蜂肤的融合蛋白表达操纵子基因；
[0009] 3)分别对所述步骤1)和步骤2)的表达操纵子基因进行双酶切，然后构建入载体 pBluescriptll SK(+)，得到重组质粒；
[0010] 4)提取枯草芽抱杆菌168的基因组DNA，扩增其启动子p43,采用T载体克隆得到 含启动子基因质粒，构建入质粒PGJ103,得到质粒PGJ284 ;通过反向PCR得到含p43启动子 部分基因序列的高效启动子序列基因，构建入质粒PGJ284,得到质粒PGJ288 ;
[0011] 5)分别对所述步骤3)的重组质粒和步骤4)的质粒PGJ288进行双酶切，回收酶切 产物后采用T4DNA连接酶连接，得到蜜蜂肤表达载体。
[0012] 本发明人经大量研究发现；采用蜜蜂肤AP与枯草芽抱杆菌宿主同源表达的木聚 糖酶融合表达体系，可W使枯草芽抱杆菌高效并且大量分泌蜜蜂肤AP ;同时，由木聚糖酶 与蜜蜂肤AP融合表达得到的AP融合体不具有抗菌肤活性，其不会对宿主菌产生毒害作用， 因此能够保证宿主菌持续且大量地表达AP融合体，而该AP融合体在TEV蛋白酶的作用下 可产生具有活性的蜜蜂肤AP，因此可W实现蜜蜂肤AP在枯草芽抱杆菌中的高效分泌表达。
[0013] 并且，鉴于TEV蛋白酶较为昂贵，因此本发明采用使宿主菌产生TEV蛋白酶的双顺 反子表达体系，含有蜜蜂肤表达载体的基因工程菌在发酵培养一段时间后，调整至TEV蛋 白酶水解所需的适宜条件，即可大量产生具有活性的蜜蜂肤AP。
[0014] 进一步地，所述步骤1)的表达操纵子基因的核巧酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0015] 进一步地，所述步骤2)的表达操纵子基因的核巧酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0016] 进一步地，所述步骤4)中反向PCR采用的上游引物的核巧酸序列如SEQ ID NO: 3 所示，下游引物的核巧酸序列如SEQ ID N0:4所示
[0017] 本发明提供的一种蜜蜂肤表达载体的构建方法，还包括对所述蜜蜂肤表达载体进 行PCR鉴定，所述PCR鉴定采用的上游引物的核巧酸序列如SEQ ID N0:5所示，下游引物的 核巧酸序列如SEQ ID N0:6所示。
[0018] 本发明还提供一种蜜蜂肤表达载体，通过上述任一所述的构建方法构建得到。
[0019] 本发明还提供一种重组枯草芽抱杆菌，含有上述的蜜蜂肤表达载体。该重组枯 草芽抱杆菌可W通过将上述蜜蜂肤表达载体转化至枯草芽抱杆菌（例如枯草芽抱杆菌 1A751)并筛选阳性转化子得到。
[0020] 本发明还提供上述蜜蜂肤表达载体或重组枯草芽抱杆菌在制备蜜蜂肤上的应用。
[0021] 本发明还提供一种蜜蜂肤的制备方法，包括：
[0022] 将所述蜜蜂肤表达载体转化至枯草芽抱杆菌1A751后，筛选阳性转化子；
[0023] 对所述阳性转化子进行培养，并从培养液中提取蜜蜂肤。
[0024] 进一步地，所述培养的温度为34~4(TC，转速为200~3(K)r/min，时间为20~ 2地。
[00巧]进一步地，所述从培养液中提取蜜蜂肤包括：
[0026] 对培养液进行离必，收集离必上清液；
[0027] 调节所述离必上清液的抑值为2~3后，置于60~8(TC的温度下保持1~3小 时。
[0028] 本发明的实施，至少具有W下优势：
[0029] 1、本发明采用蜜蜂肤AP与木聚糖酶融合表达体系，由于由木聚糖酶与蜜蜂肤AP 融合表达得到的AP融合体不具有抗菌肤活性，其不会对宿主菌产生毒害作用，因此可W使 宿主菌持续且大量地表达蜜蜂肤AP融合体。
[0030] 2、本发明采用使宿主菌产生TEV蛋白酶的双顺反子表达体系，只需将含有蜜蜂肤 表达载体的基因工程菌的发酵液调整至TEV蛋白酶水解所需的适宜条件，即可大量产生具 有活性的蜜蜂肤AP，从而大大降低了蜜蜂肤的生产成本。
[0031] 3、本发明采用枯草芽抱杆菌表达系统，相对于真核细胞表达系统和病毒表达系统 具有培养条件易于控制、繁殖速度快、分泌量高、蜜蜂肤提取工艺操作相对简单等优点，特 别适用于大规模的生产。
[0032] 4、本发明的方法生产成本低、并且易于操作，其分泌得到的蜜蜂肤浓度高、生物活 性强，并且整个工艺过程无毒害物质产生，应用范围广泛。
【附图说明】
[003引图1为本发明一实施例提供的蜜蜂肤的SDS-PA(iE图谱；其中；1为对照例1的分 泌表达产物；2为实施例2的分泌表达产物；3为Mark ;
[0034] 图2(a)至图2(c)为本发明一实施例提供的蜜蜂肤的抑菌结果；其中；图2(a)为 大肠杆菌抑菌圈；图2(b)为沙口氏杆菌抑菌圈；图2(c)为粪肠球菌的抑菌圈。
【具体实施方式】
[0035] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的附图和实施 例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明 一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有 做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0036] 实施例1
[0037] 1、人工合成含编码TEV蛋白酶的表达操纵子基因
[0038] 商业化公司应用专业软件优化TEV蛋白酶的表达操纵子基因为枯草芽抱杆菌最 佳密码子基因，其中：
[0039] 人工合成的含编码TEV蛋白酶的表达操纵子基因的核巧酸序列如SEQ ID NO: 1所 示，该基因片段的大小为72化P。
[0040] 2、人工合成含编码木聚糖酶与蜜蜂肤的融合蛋白表达操纵子基因
[0041] 商业化公司应用专业软件优化含编码木聚糖酶与蜜蜂肤的融合蛋白表达操纵子 基因为枯草芽抱杆菌最佳密码子基因，其中：
[0042] 人工合成的含编码木聚糖酶与蜜蜂肤的融合蛋白表达操纵子基因的核巧酸序列 如SEQ ID N0:2所示，该基因片段的大小为1566bp。
[0043] 3、构建重组质粒D1778-1
[0044] 采用EcoR I和BamH I对步骤1扩增得到的含编码NTEV蛋白酶的表达操纵子基 因进行双酶切，采用BamH I和Sac I对步骤2扩增得到的含编码木聚糖酶与蜜蜂肤的融 合蛋白表达操纵子基因进行双酶切，然后构建入载体地luescript II SK(+)，得到重组质粒 D1778-1。
[0045] 4、构建质粒 PGJ288
[0046] 提取枯草芽抱杆菌168的基因组DNA，扩增其启动子p43,采用T载体克隆得到含 启动子基因质粒，构建入质粒PGJ103,得到质粒PGJ284 ;
[0047] 通过反向PCR得到含p43启动子部分基因序列的高效启动子序列基因，构建入质 粒PGJ284,得到质粒PGJ288 ;其中，反向PCR的条件为：
[004引 引物F1:
[0049] GACAACAATGATCCCATACCTGATCCGGAAAACCTGTATTTTCAAGGAAA(SEQ ID NO :3)
[0050] 引物 Rl:
[0051] CGGATCAGGTATGGGATCATTGTTGTCCCACACTGTTACGTTAGAACTTCC(沈Q ID N0:4)
[0052] PCR体系为：质粒pGJ284 (模板），化1 ;
[0053] dNTP, 2. 5mmol/L,3ul ；
[0054] LA taq 聚合酶 buffer, 2. 5ul ;
[00巧]引物 FI (SEQ ID NO:3),1.加1 ;
[0056] 引物 R1(SEQ ID N0:4)，l.加1 ;
[0057] LA taq 聚合酶，0. 3ul ;
[005引灭菌超纯水，14.化1 ;
[0059] PCR反应条件；94 °C预变性3min，进入PCR循环；94 °C 30s，退火41 °C 30s， 60°C 3min,共 10 个循环；94°C 30s,退火 51°C 30s, 86°C 3min,共 25 个循环；72°C 延伸 lOmin ; 扩增得到大小为4836bp的基因片段。
[0060] 5、构建蜜蜂肤表达载体
[0061] 将重组质粒D1778-1和PGJ288分别用EcoR I与Sac I进行双酶切，回收酶切产 物后，用T4DNA连接酶在16°