乳腺癌诊断标记物组合、应用及其测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，涉及一种乳腺癌诊断标记物组合、应用及其测定方法。
【背景技术】
[0002]乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升。女性乳腺癌患者的长期生存率与疾病发现和被诊断的时间及阶段密切相关，乳腺癌的早期发现、早期诊断，是提高疗效的关键，能大大减少乳腺癌的死亡率。目前使用最广泛的筛查乳腺癌的方法是乳房X光检查，该方法的灵敏度方法为54%-77%。还有其他的方法比如热敏成像法和磁共振成像(MRI)也是常用的方法，但普遍灵敏度不高。因此寻找乳腺癌早期诊断的生物标志物非常重要。现在已经确定的肿瘤标记物包括癌胚抗原(CEA)、癌抗原(CA15-3, CA27.29，CA125)、组织多肽抗原和组织多肽特异性抗原等，但这些标记物由于敏感性和(或)特异性较低无法被推荐用于临床乳腺癌的诊断，因而急需找到一种替代的方法。最近有关乳腺癌方面的代谢组学研究，通过研究癌症患者和健康人的血浆/血清，尿液，唾液或者组织等样本进行分析测试，寻找癌症诊断标记物。然而到目前为止，尚未有关于诊断标志物对于乳腺癌区别于乳腺病以及其他恶性肿瘤的选择性评价报道。
[0003]专利CN101493464公开了一种诊断乳腺癌的分子标记物，检测乳房正常周边组织与包块组织中的硫氧还蛋白(TH10RED0XIN，TRX)和硫氧还蛋白结合蛋2(TRX-BINDINGPR0TEIN-2, TBP-2)的表达。采用蛋白免疫印迹实验检测硫氧还蛋白、硫氧还蛋白结合蛋白2的表达量，在乳腺包块组织中硫氧还蛋白表达增高和硫氧还蛋白结合蛋白2表达降低，由于与正常乳腺组织存在显著的差别，硫氧还蛋白和硫氧还蛋白结合蛋白2可以作为乳腺癌新的分子标记物，可用作为对乳腺癌临床诊断。但该专利具有疾病早期灵敏度较低及对疾病早期检测精度低的缺点。
[0004]专利CN103109187A公开了一种用于癌症诊断、研究和治疗的组合物和方法，包括但不限于癌症标记物。具体地，本发明涉及用于受试者对癌症治疗的反应的预测的组合物和方法。其包括a)检测来自患有乳腺癌的受试者的样品中的循环肿瘤细胞(CTC)水平；b)基于所述样品中的所述CTC水平来确定作用疗程。但该专利也具有疾病早期灵敏度较低及对疾病早期检测精度低的缺点。
【发明内容】
[0005]有鉴于此，本发明提供了一种乳腺癌诊断标记物组合、应用及其测定方法。
[0006]为达到上述目的，具体技术方案如下:
[0007]—方面，提供了一种乳腺癌诊断标记物组合，为血浆或血清差异性代谢物，包括Aspartate (天(门)冬氨酸盐(或酯))、Glutamate (谷氨酸盐/谷氨酸酯)、5-0xoproline (焦谷氨酸)、Isoleucine (异亮氨酸)、Aminoacetone (氨基丙酮 / 丙酮基胺)、Delta-hydroxylysine (异轻赖氨酸)、Cystine (胱氨酸/双硫丙氨酸)、Glutamine (谷氨酰胺)、Cysteine (半胱氨酸/巯基丙氨酸)、Hypotaurine (亚牛磺酸/氨乙基亚磺酸)、Asparagine (天门冬素/天冬酰胺酸)、Glycerolphosphate (甘油磷酸盐/甘油磷酸酯)、Glycerophosphocholine (甘油磷酸胆碱)、Arachidonate (花生四烯酸酯/花生四烯酸盐)、nicotinurate (烟尿酸)、Octadecanoate (十八酸盐/硬脂酸盐)、Choline (胆碱)、Myristoleate (十四碳烯酸酯)、Butyrylcarnitine ( 丁酰基肉碱)、Prop1nylcarnitine (丙酰肉碱)、a -ketoglutarate ( α -酮戊二酸脱氢1 酶)、Lactate (乳酸)、Malate (苹果酸盐(或酯))、Glyoxylate (乙酸酸)、Pentosidine (戊糖素)、Uracil (尿啼唆 / 二氧啼唆)、Quinate (奎尼酸)、Epinephrineglucuronide (肾上腺素葡(萄)糖苷酸)中的一种或多种的组合。
[0008]优选的,所述标记物包括Aspartate (天(门)冬氨酸盐(或酯))、Glutamate (谷氨酸盐/谷氨酸酯)、5-0xoproline(焦谷氨酸)、Cystine (胱氨酸/双硫丙氨酸)、Glutamine (谷氨酰胺)、Cysteine (半胱氨酸/巯基丙氨酸)、Hypotaurine (亚牛磺酸/氨乙基亚磺酸)、Asparagine (天门冬素/天冬酰胺酸)、Glycerolphosphate (甘油磷酸盐/甘油磷酸酯)、Glycerophosphocholine (甘油磷酸胆碱)、Arachidonate (花生四烯酸酯/花生四烯酸盐)、Glyoxylate (乙酸酸)、Pentosidine (戊糖素)中的一种或多种的组合。
[0009]另一方面，提供了乳腺癌诊断标记物组合的应用，用于诊断乳腺癌的试剂盒。
[0010]优选的，诊断标记物的诊断样品是血浆或血清。
[0011]另一方面，提供了乳腺癌诊断标记物组合的测定方法，包括以下步骤:
[0012]步骤I，取乳腺癌病人临床血浆或者血清样本和健康人对照血浆或者血清样本；
[0013]步骤2，通过色谱质谱联用代谢组学分析方法分析鉴定乳腺癌病人临床血浆/血清样本和健康人对照血浆/血清样本的初步差异性代谢物；
[0014]步骤3，在多维OPLS-DA模型的变量权重(VIP)值大于I及非参检验的P值小于0.05的选择标准下，得到进一步差异性代谢物；
[0015]步骤4，进行逻辑回归模型进行验证，得到差异性代谢物。
[0016]优选的，所述步骤I中包括不同地区的乳腺癌病人临床血浆/血清样本和健康人对照血浆/血清样本。
[0017]优选的，所述步骤I中包括乳腺癌患者、乳腺疾病患者、良性乳腺肿瘤患者和健康人对照血浆或者血清样本。
[0018]优选的，所述步骤2中的色谱质谱联用代谢组学分析方法包括液相/气相色谱质谱联用代谢组学分析方法。
[0019]优选的，所述步骤2中气相色谱质谱联用测试的色谱条件包括:RX1-5ms毛细管柱，载气:超纯氦气，流量:1.0mL/min，进样口温度:260°C，传输线温度:260°C，离子源温度:210°C，进样量:luL，进样方式:不分流进样，升温程序:从80°C开始并持续2min，以10C /min的升温速度升至220°C，之后以5°C /min的升温速度升至240°C，再以25°C /min的升温速度升至290°C，最后在290°C持续8min，质谱离子源:EI源，电子轰击能量:70eV，质谱扫描范围:m/z,40-600,全扫描方式。
[0020]优选的，所述步骤2中液相色谱质谱联用测试的色谱条件包括=AgilentZ0RBAXEclipseXDB-C18 柱(4.6X 150mm, 5 μ m)，柱温:30°C。流动相 A:水(0.1%甲酸)，B:乙腈(0.1%甲酸，)，流动相洗脱梯度为0-25min:1-100% B，流速:0.4mL/min，进样量:10yL。飞行时间质谱优化条件为:(1)正离子模式(ES+)，毛细管电压3500V，喷雾器45psig，干燥气温度325°C，干燥器流速llL/min;(2)负离子模式(ES-)，毛细管电压3000V，其他参数与正离子模式一致。在代谢物谱分析时，数据采集形式为plot和centroid同时进行，采集质量范围为50-1000Da。
[0021]优选的，所述步骤2中气相色谱质谱联用测试的血清样本前处理包括:取50 μ L血清，加入1ul氯苯丙氨酸(0.lmg/mL，水溶)和10 μ L十七酸(lmg/mL，醇溶)作为内标来监测样本的重现性；再加入175 μ L氯仿甲醇混合溶剂(l:3，v/v)，涡旋振荡30s ;置离心管于-20°C放置1min以促进蛋白沉淀；然后13000rpm离心1min,取上清200 μ L于高回收进样瓶中，室温下真空干燥得到样本品。
[0022]优选的，所述步骤2中样本品经抽干后使用两步法进行衍生，首先加入50 μ L甲氧胺(15mg/mL，吡啶溶)，涡旋振荡30s，在30°C下反应90min，然后再加入50 μ LBSTFA (含I %TMCS)在70°C反应60min，静置后进行GC-TOFMS分析。
[0023]优选的，所述步骤2中液相色谱质谱联用测试的血清样本前处理包括:取50ul血清样本与200ul含氯苯丙氨酸(5ug/mL，水溶)的甲醇乙腈混合液(5:3，v/v)混合，涡旋振荡2min,静置1min后,用13000rpm离心20min,取上清液。
[0024]相对于现有技术，本发明的技术方首次提出Aspartate, Glutamate,
5— OxoproIine, Cystine, Glutamine, Cysteine, Hypotaurine, Asparagine ,Glycerolphosphate,Glycerophosphocholine,Arachidonate,Glyoxylate,Pentosidine 作为乳腺癌诊断标记物，对乳腺癌的诊断具有高灵敏度和高特异性，并且对于早期乳腺腺癌诊断也具有较高的灵敏度和特异性，可用于乳腺癌的早期发现，为患者争取时间，尽早开始治疗，提高临床治疗效果。同时通过运用液相色谱质谱联用仪(LC-TOFMS)和气相色谱质谱联用仪(GC-TOFMS)对乳腺癌病人及健康人对照血浆或血清进行代谢物全谱分析测试，结合生物信息学工具，寻找差异性代谢物，并通过验证确定其作为乳腺癌的诊断标记物，可以用于乳腺癌的早期发现和诊断，提高乳腺癌治疗效果。
【附图说明】
[0025]构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
[0026]图1A是训练集中乳腺癌患者(η = 100)和正常对照(η = 80)之间血浆代谢物差异柱形图。其中，变化倍数(FC)值通过计算在乳腺癌患者和健康人对照组中每个代谢物的平均强度比率得到。每一个柱状分别代表一个FC值，不同灰度值对应相应的P值，说明各物质的统计学意义；
[0027]图1B是训练集乳腺癌血浆样本的ROC曲线图(包含13个代谢物组合成的代谢物组 Asp