具有免疫增强活性的包含寡核苷酸的复合体及其用图【
技术领域：
】[0001]本发明设及具有免疫刺激活性的包含寡核巧酸的复合体及其用途。更具体而言，本发明设及包含具有免疫刺激活性的CpG寡脱氧核巧酸(0DN)和β-葡聚糖的复合体及其药物用途。【
背景技术：
】[0002]CpG寡脱氧核巧酸(CpG0DN)是包含免疫刺激CpG基序的短的（约20个碱基对）、单链的合成DNA片段，是Toll样受体9(化R9)的有效激动剂，活化树突细胞(DC)和B细胞W产生I型干扰素（IFN)和炎性细胞因子(非专利文件1、2)，并且作为对于化1型体液和细胞免疫应答(包括细胞毒性T淋己细胞(CTL)应答）的佐剂(非专利文件3、4)。因此，CpG0DN已假定为针对传染病、癌症、哮喘和花粉症的可能的免疫治疗剂(非专利文件2、5)。[0003]存在至少四种类型的CpG0DN，其每一种具有不同的骨架、序列和免疫刺激特性(非专利文件6)。0(也称为A)型CpG0DN通常包含具有憐酸二醋(P0)骨架和硫代憐酸醋(PS)多G尾的一个回文CpG基序，其活化类浆细胞DC(pDC)W产生大量的IFN-a，但无法诱导pDC成熟和B细胞活化(非专利文件7、8)。其他Ξ类0DN由PS骨架组成。Κ(也称为B)型CpG0DN含有非回文的多CpG基序，并且强烈活化B细胞W产生比-6和pDCW成熟，但几乎不产生IFN-a(非专利文件8、9)。近期，C和P型CpG0DN已被开发;运些分别含有一个和两个回文CpG序列，其两个均可W如K型活化B细胞和如D型活化pDC，尽管相比于P型CpG0DN，C型CpG0DN诱导较弱的IFN-a产生(非专利文件10-12)。许多优秀的K型CpG0DN描述于专利文件1中。[0004]D和P型CpG0DN已显示形成高级结构化ogsteen碱基配对W分别形成称为G四联体(tetrad)的平行四倍结构和顺式和反式回文部分之间的沃森克里克碱基配对，其对于通过pDC的活跃的IFN-a产生是必需的（非专利文件12-14)。尽管此类更高级结构似乎对于定位至早期内体和经化R9的信号传导是必需的，但它们受制于产物多态性、聚集和沉淀，因而阻碍了其临床应用(非专利文件15)。因此，仅K和C型CpG0DN通常可用作免疫治疗剂和疫苗佐剂用于人使用(非专利文件16和17)。虽然K型CpG0DN在人临床试验中增强祀向传染病和癌症的疫苗的免疫原性(非专利文件6、16)，但抗原和K型CpG0DN之间的化学和物理结合对于最优佐剂效应是必需的。运些结果表明运四种(K、D、P和C)类型的CpG0DN具有优点和缺点，然而开发活化B细胞和pDC两者而无聚集的"一体化(all-in-one)"CpG0DN尚未完成。[0005]裂權菌多糖(SPG)，一种来源于裂權菌(Schizophyllumcommune)的可溶性β-1,3-葡聚糖，是在日本被批准作为宫颈癌患者的放疗增强剂的药物，持续最近Ξ十年(非专利文件18)。类似地，香茹多糖化NT)，一种来源于香茹的可溶性β-1,3-葡聚糖，是于1985年批准的药物，且与氣喀晚药物组合使用，用于无法实施手术的和复发性胃癌患者（非专利文件19、20)。护1，3-葡聚糖已显示与多脱氧腺巧酸((^)形成作为^链螺旋结构的复合体(非专利文件21)。[0006]专利文件2-4公开了包括裂權菌多糖和核酸(基因）作为基因载体的β-1,3-葡聚糖的复合体的用途。运些文件描述了形成复合体增强了基因的反义作用及其针对核酸酶的抗性作用。[0007]专利文件5公开了具有β-1，3-键的多糖作为载体(转染剂)增强具有CpG序列的免疫刺激寡核巧酸的用途，其中憐酸二醋键被硫代憐酸醋键或二硫代憐酸醋键所取代。[000引专利文件6公开了由免疫刺激寡核巧酸和具有长的β-1,6-葡糖巧键侧链的β-1,3-葡聚糖组成的免疫刺激复合体。[0009]本发明人之前证实与SPG形成复合体的与在5'端具有憐酸二醋键的多dA连接的小鼠和人源化CpG0DN增强细胞因子产生并且用作流感疫苗佐剂和用于化2细胞相关疾病的预防剂和治疗剂(非专利文件22、23,专利文件7)。当多(dA)加入到K型和D型的各CpG的5'端W形成与SPG的复合体时，两者显示增强的活性同时保持K型和D型的特性。然而，实现朝向其更有效且更成本节约的临床前W及临床开发的CpG-SPG复合体的高产量是困难的。近期，当具有硫代憐酸醋键的多（dA)连接至CpG0DN时，复合体形成的效率评价接近100%(非专利文件24)。然而，仍未进行彻底的研究W鉴定最佳的人源化CpG序列和因素的优化W获得四种类型的CpG0DN的"一体化"活性。[0010]专利文件8公开了抗原/CpG寡核巧酸/β-1,3-葡聚糖类型Ξ元复合体的生产方法。[00川[文件列表][专利文件]专利文件1:US8,030,285Β2专利文件2:WO01/034207A1专利文件3:WO02/072152A1专利文件4:JP-A-2004-107272专利文件5:W02004/100965A1专利文件6:JP-A-2007-70307专利文件7:JP-A-2008-100919专利文件8:JP-A-2010-174107[非专利文件]非专利文件1,Η.,等人.AToll-likereceptorrecognizesbacterialDM.NaUire408，740-745(2000).非专利文件2:Krie邑，A.Μ.TherapeuticpotentialofToll-likereceptor9activation.Naturereviews.Drugdiscovery5,471-484(2006).非专利文件3:化azolotMillan,C丄.，Weeratna,R.,Krieg,A.M.,Siegrist,C.A.&Davis,H.L.CpGDNAcaninducestrongThlhumoralandcell-mediatedimmuneresponsesagainsthepatitisBsurfaceantigeninyoungmice.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica95,15553-15558(1998).非专利文件4:Chu,R.S.，Targoni,O.S.，Krieg,A.M.，Lehmann,P.V.&Harding,C.V.CpGoligodeoxynucleotidesactasadjuvantsthatswitchonThelper1(Thl)immunity.TheJournalofexperimentalmedicine186,1623-1631(1997).非专矛U文件5:Klinman,D.M.ImmunotherapeuticusesofCpGoligodeoxynucleotides.Naturereviews.Immunology4，249-258(2004).非专利文件6:Vollmer，J.&Krieg，A.M.ImmunotherapeuticapplicationsofCpGoligodeoxynucleotideTL民9agonists.Advanceddrugdeliveryreviews61，195-204(2009).非专禾U文件7:Krug，A.，IdentificationofCpGoligonucleotidesequenceswithhighinductionofIFN-alpha/betainplasmacytoiddendriticcells.Europeanjournalofimmunology31，2154-2163(2001).非专利文件8:Vei'thelyi,D·，Ishii,K.J·，Gursel,M·，Takeshita,F.&Klinman,D.M.HumanperipheralbloodcellsdifferentiallyrecognizeandrespondtotwodistinctCPGmotifs.Journalofimmunology166，2372-2377(2001).非专利文件9:Hartmann，G.&Krieg，A.M.MechanismandfunctionofanewlyidentifiedCpGDNAmotifinhumanprimaryBcells.Journalofimmunology164，944-953(2000).非专利文件l〇:Hartmann,G·，等人.RationaldesignofnewCpGoligonucleotidesthatcombineBcellactivationwithhighIFN-alphainductioninplasmacytoiddendriticcells.Europeanjournalofimmunology33，1633-1641(2003).非专利文件ll:Marshall，J.D·，等人.IdentificationofanovelCpGDNAclassandmotifthatoptimallystimulateBcellandplasmacytoiddendriticcellfunctions.Journalofleukocytebiology73，781-792(2003).非专利文件12:Samulowitz，U.，等人.Anovelclassofimmune-stimulatoryCpGoligodeoxynucleotidesunifieshighpotencyintypeIinterferoninductionwithpreferredstructuralproperties.Oligonucleotides20，93-101(2010).非专利文件13:Kerkmann，M.，等人.Spontaneousformationofnucleicacid-b过sedn过nop过rticlesisresponsibleforhighinterferon-过Iph过inductionbyCpG-Ainplasmacytoiddendriticcells.TheJournalofbiologicalchemistry280,8086-8093(2005).非专利文件14:Klein，D.C·，Latz,E·，Espevik，T.&Stokke,B.T.Higherorderstructureofshortimmunostimulatoryoligonucleotidesstudiedbyatomicforcemicroscopy.Ultramicroscopy110，689-693(2010).非专利文件15:Puig，M.，等人.UseofthermolyticprotectivegroupstopreventG-tetradformationinCpGODNDtype:structuralstudiesandimmunomodulatoryactivityinprimates.Nucleicacidsresearch34，6488-6495(2006).非专利文件16:Bode，C.，Zhao，G.，Steinhagen，F.，Kinjo,T.&Klinman,D.M.CpGDNAasavaccineadjuvant.Expertreviewofvaccines10，499-511(2011).非专利文件17:McHutchison,J.G·，等人.PhaseIB,randomized,double-blind,dose-escalationtrialofCPG10101inpatientswithchronichepatitisCvirus.H邱atology46，1341-1349(2007).非专利文件18:0kamura，K.，等人.Clinicalevaluationofschizophyllancombinedwithirradiationinpatientswithcervicalcancer.Arandomizedcontrolledstudy.Cancer58，865-872(1986).非专利文件19:0ba，K·;Kobayashi,M·;Ma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