评估果汁/果酒质量和/或安全性的方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请案设及2013年9月30日提交的名称为通过测量自果汁/果酒分离的DNA评估 果汁/果酒质量和/或安全性的方法(AMETH0D FOR ASSESSING JUICE/CID邸卵ALITY AND/ OR SAFETY BY MEASURING DNA ISOLATED FROM Τ肥 JUICE/CI肥R)的美国临时专利申请第 61/884,354号且要求其优先权。W上鉴别的同在申请中的临时申请的公开内容W全文引用 的方式并入本文中。
技术领域
[0003] 本发明设及一种通过测定存在于果汁和/或果酒中的微生物DNA的量评估果汁和/ 或果酒的风味质量W及果汁和/或果酒的安全性的新方法。本发明设及一种自果汁和/或果 酒分离DNA的新方法。
【背景技术】
[0004] 佛罗里达州（Florida)的黄龙病化LB)为分布广泛的且与相橘黄龙病菌亚洲种 (化as),-种限于初皮部的细菌相关。此疾病可杀死5-10年份的树，且自化B感染的水果处 理澄汁通常与苦味和/或异味相关（鲍尔溫（Baldwin)等人，农业与食品化学杂志 (J.Agr.Food Chem. )58:1247-1262(2010);普洛托（Plotto)等人，食品科学杂志（Food Sci.)75:S220-S230(2010))。已显示化as群体因为留下具有较高化as群体的严重症状而与 HLB症状相关(哥特瓦尔德(Gottwald)等人，作物保护(Crop Protect. )36:73-82(2012);斯 托弗（Stover)和麦考伦(McCollum),园艺科学化 ortScience)46:1344-1348(2011);特里维 迪（Trivedi)等人，欧洲植物病理学杂志化uropean J.Plant化thol. )124:553-563 (2009))。相橘黄龙病菌非洲种(CLaf)和相橘黄龙病菌非洲种(CLam)也分别在非洲和己西 引起相橘树中的HLB疾病。
[0005] 定量聚合酶链反应(qPCR)为测定植物是否感染病原体的极好的诊断分析工具。在 进行qPCR之前，必须首先分离和纯化DNA。尽管存在许多不同的分离和纯化DNA的方法，一般 来说，最常使用的方法属于两个类别中的一个。一个类别使用SDS溶解细胞，接着使用高浓 度的KoAC沉淀SDS和蛋白质且因此称为SDS-KoAC方法(德拉波塔(Dellapoda)等人，植物分 子生物学报告(Plant Molecular Biology RepOTter), 1(4) :19-21 (1983))。第二类别在提 取程序中使用CTAB且因此称为CTAB方法(艾伦(A11 en)等人，自然实验手册(化t. Pro toe.)， 1(5) :2320-2325(2006))。存在许多其它方法，包括(但不限于)基于二氧化娃的分离试剂 盒、磁粒子分离技术、使用树脂等。自植物物质和病原体细胞分离DNA的困难中的一者在存 在刚性多糖细胞壁和物理上抑制DNA释放的胶囊的情况下（冈萨雷斯-Π 多萨(Gonzalez- Mendoza)等人，分子遗传学研究（Gen. Mol. Res. )9:162-166(2010);努尔埃蒂拉（Noor Adila)等人，微生物学杂志(Mai. J.Microbiol. )3:7-13(2007);瓦尔马(Varma)等人，生物 技术杂志(Biotechnol.J. )2:386-392(2007))。用于组织破坏W自植物组织提取DNA的最广 泛使用的方法为通过用研鉢和研巧在液氮下研磨组织:研磨越精细，提取的DNA的量越大 (罗格斯塔（Rogstad)等人，植物分子生物学报导（Plant Mol. Biol. Rep . ) 19 : 353-359 (2001))。当标祀DM的浓度低且干扰化合物(例如植物细胞壁、果胶、其它糖、蛋白质、次级 代谢物)的浓度高时，那么可能需要额外溶解步骤(例如机械破坏、超声处理、酶促消化)和/ 或额外纯化步骤(例如溶离管柱）(A^萨马赖(Samarrai)和施密特(Schmid),应用微生物学 快报化ett .Appl .Microbiol. )30:53-56(2000);阿利(Alaey)等人，国际农业和生物学杂志 (Inti. J.Agr.Biol. )7:882-884(2005);和冈萨雷斯-Π 多萨，等人(2010))。但是，当使用澄 子树叶或更精确地，富含庇护化as细菌的初皮部脉管的澄子树叶的中脉时，能够在不使用 超声发生器、消化酶或溶离管柱的情况下分离和纯化细菌DNA，因为相比于上述干扰化合物 的浓度，初皮部脉管中的CLas DNA的浓度高。
[0006] 相比于叶子的中脉，囊瓣含有低得多的量的化as细胞(相橘叶组织的0.25%)(李 化i)等人，植物疾病(Plant Dis. )92:854-861(2008);廖化iao)和伯恩斯(Burns),实验植 物学杂志(J.Expt.Bot. )63:3307-3319(2012))和更多干扰化合物（例如果胶、其它糖和次 级代谢物）（鲍尔溫等人，（2010))。相比于叶子和甚至其它果汁，澄汁具有极高果胶含量，其 测量为半乳糖醒酸(0.037-1.433mg/g)(取决于品种和收获时间）（鲍尔溫等人(2010))。当 使用DNA分离的先前技术方法时，果胶和DNA通常共纯化（斯科特（Scott)和普莱福德 (Playford)，生物技术(BioTechniques)20:974-978( 1996))。另外，当使用先前技术分离方 法时，澄汁中的其它糖（例如薦糖、葡萄糖和果糖）干扰DNA提取和分离（鲍尔溫等人 (2010))。已开发多种DNA提取方法W避免果胶/多糖和DNA的共沉淀，包括使用高化C1浓度 (瓦尔马，等人(2007))?及经修饰漠化十六烷基Ξ甲基锭(CTABK谢己德(Shepard)和麦克 莱(McLay)，植物研究杂志(J. Plant Res.) 124: 311-314(2011))、酪、乙二醇单乙醋和果胶 酶（奥卡达（Okada)等人，美国植物学杂志（Amer.J.Bot. )84:1236:1246(1997);雷其尔 (Rether)等人，植物分子生物学报导11:333-337(1993);和罗格斯塔等人(2001))。不幸的 是，尽管CTAB加上高化化浓度方法对于自具有高化as DNA浓度的相橘叶组织分离和纯化 化as DNA很好地起作用，此方法不对于具有低化as DNA浓度和高浓度的干扰多糖，尤其果 胶的相橘果汁很好地起作用。另一方法使用果胶酶消化果胶（白（Bai)等人，评论中（in press))，但是，仅获得低产量的DNA(参见表1)，可能由于商业果胶酶制剂含有低含量的DNA 酶。因此，难W自相橘果汁获得高量和质量DNA(微生物DM和植物DNA两者）。实际上，使用凯 杰（Qiagen)DNeasy Plant Mini试剂盒、凯杰mericon 化〇(1 试剂盒、Qiagen QIAamp DNA Blood Mini试剂盒或普洛麦格(Promega)Wizarcf基因组DM纯化试剂盒自澄汁W足够纯度 水平分离足够量的DNA的先前尝试不成功(参见下文）。
[0007] 如上所述，澄汁富含次级代谢物，包括生物碱、巧樣苦素类化合物和类黄酬，其不 W相对于化as DNA的高浓度存在于叶组织中（鲍尔溫等人（2010);贾斯特逊(Justesen)等 人，色谱法杂志A辑化油'〇111日扣旨'.4)799:101-110(1998))。运些次级代谢物可抑制？〔尺反 应(邓(Deng)和克利弗（Cliver)，国际食品微生物学杂志（Inti. J.Food Microbiol. )54: 155-162(2000);金化im)和曹（Cho)，食品控制(Food Con化〇1 )21:1419-1423(2000);奥古 恩吉米(Ogunjimi)和乔杜里（Choudary)，欧洲微生物学会联合会医学微生物学与免疫学 (FEMS Immunol.Med. Microbiol. )23:213-220( 1999);蔡（Tsai)和奥尔森（Olson),环境微 生物学应用（A 邮 1.化 viron. Microbiol. )58: 2292-2295( 1992);威尔逊，I.G. (Wilson, I.G.)，环境微生物学应用63:3741-3751(1997))。适当离子交换管柱或馨合剂可用于去除 运些污染物（桑德斯，G. C. (Saunders，G. C.)，DNA 提取(DNA extract ion)，第29-46页.G. C. 桑德斯和H. C .帕克斯（H. C . Parkers)(编）分析分子生物学：质量和验证（Analytical molecul曰Γ b i 〇 1 〇 gy : Qu曰1 i t y 曰nd v曰lid曰tion ).会。桥皇家化学学会（Ro y日1 Soc .Qiem. Cambridge))。金和曹（2010)使用Qielex处理和葡聚糖凝胶（Sephadex)管柱过滤 成功地自苹果、葡萄和西瓜果汁去除PCR抑制剂。但是，金和曹未成功地使用此方法自澄汁 分离DNA而不含次级代谢物。相比之下，李等人(微生物方法杂志(J.Microbiol.Meth.)66: 104-115 (2006))显示当样品用标准漠化十六烷基Ξ甲基锭(CTAB)方法或DNeasy "I植物试 剂盒(凯杰，马里兰州盖瑟斯堡(Gaithersburg,MD))提取自相橘叶组织时，TaqMan"郝其它 用于化as DNA的商业"实时"PCR分析不经抑制，指示与具有大扩增子(约1200bp)的常规PCR 分析相比，具有小扩增子(约70bp)的运些qPCR分析可能较不易受扩增反应的抑制剂损害 (马开(Mackay)等人，核酸研究(Nucl.Acid.Res. )30:1292-1305(2002))。枯曲化11? 分析也 用于澄汁且成功地扩增化as DNA。但是，如先前所提到，运些DNA提取方法产生浓度过低而 无法实际使用的DNA。此外，qPCT中的循环阔值(Ct)的标准差随着标祀DNA的量减小而增加， 指示低标祀DNA浓度处的较高误差风险（刘（Liu)等人，微生物学方法杂志65 :21-31 (2006))。
[000引在2013年，公开了一种检测澄汁中的CLas DNA的新方法（白等人，佛罗里达州园艺 学会会刊（Proc.Fla. State Hort. Soc.) 125: 233-238(2013))，然而，此方法对于通过相橘 处理器商业使用太复杂、在分析期间使用过多澄汁且由于产生的少量DNA导致Ct值的标准 差的增加而不始终精确。因此，仍需要一种通过分析果汁中的化as DNA检测相橘果汁中的 化as的简单、可靠的分析。此外，此方法使得能够分离和纯化澄汁和其它果汁中的其它微生 物的DNA。
[0009] 当前，澄汁质量通过美国农业部化.S.Department of Agriculture)等级测定，其 通过品尝果汁且对其评级的检验人和通过果汁处理器测量可溶性固体、可滴定酸度且有时 测量苦味巧樣苦素类化合物巧樣苦素来测定。需要测定果汁质量是否已受微生物负面地影 响，且如果是，风味改变的程度的更定量的分析。此分析也可用于测定果汁是否适于饮用。
【发明内容】
[0010] 本发明的一个目标为具有一种自液体分离核酸的方法，所述方法设及自液体可溶 组分分离存在于液体样品中的固体组分，溶解存在于固体组分中的细胞W释放存在于细胞 中的核酸、蛋白质、多糖、脂质和非极性物质，将蛋白质、脂质和非极性物质与核酸和多糖分 离，将多糖与核酸分离，W及洗涂核酸的步骤。本发明的另一目标为液体可为果汁、果酒、葡 萄酒或其它液体。
[0011] 本发明的一个目标为具有一种自液体分离核酸的方法，所述方法设及自液体可溶 组分分离存在于液体样品中的固体组分，溶解存在于固体组分中的细胞W释放存在于细胞 中的核酸、蛋白质、多糖、脂质和非极性物质，将蛋白质、脂质和非极性物质与核酸和多糖分 离，将多糖与核酸分离，W及洗涂核酸的步骤。本发明的另一目标为将多糖与核酸分离的步 骤设及将CTAB和盐的水溶液与多糖和核酸混合，使得核酸从水溶液中沉淀出溶液且使得多 糖保持溶解于水溶液中。本发明的另一目标为将多糖与核酸分离的步骤设及将含有溶解多 糖的水溶液与核酸分离。本发明的另一目标为液体可为果汁、果酒、葡萄酒或其它液体。
[0012] 本发明的一个目标为具有一种自液体分离核酸的方法，所述方法设及自液体可溶 组分分离存在于液体样品中的固体组分，溶解存在于固体组分中的细胞W释放存在于细胞 中的核酸、蛋白质、多糖、脂质和非极性物质，将蛋白质、脂质和非极性物质与核酸和多糖分 离，将多糖与核酸分离，W及洗涂核酸的步骤。本发明的另一目标为将多糖与核酸分离的步 骤设及将CTAB和盐的水溶液与多糖和核酸混合，使得核酸从水溶液中沉淀出溶液且使得多 糖保持溶解于水溶液中。本发明的另一目标为将多糖与核酸分离的步骤设及将含有溶解多 糖的水溶液与核酸分离。本发明的另一目标为水溶液中的盐浓度在大致lOmM与大致400mM 之间。本发明的另一目标为盐浓度在大致lOOmM与大致300mM之间。本发明的另一目标为盐 浓度为大致250mM。本发明的另一目标为液体可为果汁、果酒、葡萄酒或其它液体。
[0013] 本发明的一个目标为具有一种自液体分离核酸的方法，所述方法设及自液体可溶 组分分离存在于液体样品中的固体组分，溶解存在于固体组分中的细胞W释放存在于细胞 中的核酸、蛋白质、多糖、脂质和非极性物质，将蛋白质、脂质和非极性物质与核酸和多糖分 离，将多糖与核酸分离，W及洗涂核酸的步骤。本发明的另一目标为核酸和多糖的混合物含 有盐。本发明的另一目标为将多糖与核酸分离的步骤设及混合CTAB的水溶液与多糖核酸和 盐W形成溶液。本发明的另一目标为含有CTAB、盐、多糖和核酸的溶液具有使得核酸从溶液 中沉淀出溶液且使得多糖保持溶解于溶液中的盐浓度。本发明的另一目标为将多糖与核酸 分离的步骤设及将含有溶解多糖的溶液与核酸分离。本发明的另一目标为含有CTAB、盐、多 糖和核酸的溶液中的盐浓度在大致lOmM与大致400mM之间。本发明的另一目标为盐浓度在 大致lOOmM与大致300mM之间。本发明的另一目标为盐浓度为大致250mM。本发明的另一目标 为液体可为果汁、果酒、葡萄酒或其它液体。
[0014] 本发明的目标为具有将核酸与液体分离的改进的方法，其具有W下步骤:将存在 于液体样品中的固体组分与液体可溶组分分离，将固体组分暴露于Tris-碱、EDTA、盐、 PVP40、β-琉基乙醇、化0H和表面活性剂的溶液W溶解固体组分和溶解细胞;任选地加热溶 液W溶解细胞;添加氯仿来产生水相、中间相和有机相，使得脂质和非极性物质溶解于有机 相中且使得变性蛋白质在中间相中；将水相与有机相和中间相分离;添加 CTAB到水相，使得 存在于水相中的核酸从水相中沉淀出溶液;任选地加热W帮助核酸沉淀;粒化沉淀;任选地 在乙醇中再悬浮沉淀W去除任何其余的CTAB但允许核酸保持未溶解于乙醇中；和将核酸与 乙醇分离，使得分离步骤设及粒化核酸和将乙醇与粒化核酸分离。本发明的另一目标为将 固体组分暴露于化i S-碱、邸TA、盐、PVP40、β-琉基乙醇、NaOH和表面活性剂的溶液W溶解固 体组分和溶解细胞的步骤设及将固体组分暴露于化is-碱、邸TA、盐、PVP40和β-琉基乙醇的 第一溶液，且接着添加 NaOH和表面活性剂到第一溶液。
[0015] 本发明的目标为具有将核酸与液体分离的改进的方法，其具有W下步骤:将存在 于液体样品中的固体组分与液体可溶组分分离，将固体组分暴露于Tris-碱、EDTA、盐、 PVP40、β-琉基乙醇、化0H和表面活性剂的溶液W溶解固体组分和溶解细胞;任选地加热溶 液W溶解细胞;添加氯仿来产生水相、中间相和有机相，使得脂质和非极性物质溶解于有机 相中且使得变性蛋白质在中间相中；将水相与有机相和中间相分离;添加 CTAB到水相，使得 存在于水相中的核酸从水相中沉淀出溶液;任选地加热W帮助核酸沉淀;粒化沉淀;任选地 在乙醇中再悬浮沉淀W去除任何其余的CTAB但允许核酸保持未溶解于乙醇中；和将核酸与 乙醇分离，使得分离步骤设及粒化核酸和将乙醇与粒化核酸分离。本发明的另一目标为将 固体组分暴露于化i S-碱、邸TA、盐、PVP40、β-琉基乙醇、NaOH和表面活性剂的溶液W溶解固 体组分和溶解细胞的步骤设及将固体组分暴露于化is-碱、邸TA、盐、PVP40和β-琉基乙醇的 第一溶液，且接着添加化0Η和表面活性剂到第一溶液。本发明的另一目标为在添加 CTAB之 后的水相的盐浓度在大致lOOmM与大致300mM之间。本发明的另一目标为在添加 CTAB之后的 水相的盐浓度为大致250mM。本发明的另一目标为液体可为果汁、果酒、葡萄酒或其它液体。
[0016] 本发明的另一目标为具有一种测定果汁或果酒的质量的方法，其具有W下步骤： 将获自果汁或果酒的DNA暴露于第一引物、第二引物和巧光组合物，使得第一引物的序列和 第二引物的序列与微生物DNA中的特定序列互补且结合到微生物DNA中的特定序列；扩增 DNA来产生扩增子W使得扩增子在扩增子的一端具有第一引物的序列且在所述扩增子的另 一端具有第二引物的序列的反向互补序列;测定扩增DM的Ct值;和比较Ct值与一或多个已 知Ct值，其中一或多个已知Ct值指示果汁或果酒的质量。本发明的另一目标为质量可为风 味、气味、颜色、安全性或其组合。
[0017] 本发明的另一目标为具有一种测定果汁或果酒的质量的方法，其具有W下步骤： 将获自果汁或果酒的DNA暴露于第一引物、第二引物和巧光组合物，使得第一引物的序列和 第二引物的序列与微生物DNA中的特定序列互补且结合到微生物DNA中的特定序列；扩增 DNA来产生扩增子W使得扩增子在扩增子的一端具有第一引物的序列且在所述扩增子的另 一端具有第二引物的序列的反向互补序列;测定扩增DM的Ct值;和比较Ct值与一或多个已 知Ct值，其中一或多个已知Ct值指示果汁或果酒的质量。当果汁或果酒的质量为风味时，样 品中DNA的量(如可通过扩增DNA的Ct值指示)可与对果汁或果酒的口味/风味的负面影响相 关。可接着通过知道Ct值和在一或多个已知Ct值指示果汁的风味质量时将Ct值相比于一或 多个已知Ct值来对果汁的有利质量评级。举例来说，如果某一 Ct值指示不佳风味质量，那么 果汁可相应地评级。与澄汁的负面或不佳口味相关的典型不佳风味质量描述词例如包括酸 味、苦味或具有金属口味。
[0018] 本发明的另一目标为具有一种测定果汁或果酒的质量的方法，其具有W下步骤： 将获自果汁或果酒的DNA暴露于第一引物、第二引物和巧光组合物，使得第一引物的序列和 第二引物的序列与