一种超敏感超顺磁性纳米免疫微球及其检测gp73抗原的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于诊断试剂技术领域，涉及磁性免疫体外诊断试剂，特别涉及一种表面 偶联有GP73单克隆抗体的超顺磁性纳米免疫微球，及利用该微球采用双抗体夹心酶免法 或化学发光法检测人血清或血浆中GP73抗原的方法。
【背景技术】
[0002] 肝癌是常见的恶性肿瘤之一，"早诊、早治"是防治肝癌的关键。目前临床上对肝 癌的诊断方法主要是影像学和血清标志物甲胎蛋白（AFP)的检测，早期肝癌直径小，影像 学几乎检测不到，AFP诊断敏感性较低（25% )，会漏检一部分早期肝癌患者。
[0003] 高尔基体蛋白73(GP73)被认为是目前最好的肝癌早期诊断血清学标志物之一， 其检测敏感性和特异性均高于AFP。国内外已有的GP73试剂均为传统的酶联免疫方法，该 方法的不足之处在于检测灵敏度较低，反应时间较长。
[0004] 磁性纳米微球具有超顺磁性，具有巨大的比表面积和可以偶联多种生物分子的特 点。在无外加磁场时磁性纳米微球均匀分散在溶液中，使抗原-抗体快速、高效反应，在外 加磁场的作用下，超顺磁性纳米微球可快速移动，通过吸附、洗涤、解吸附等操作步骤从复 杂的生物化学混合物体系中分离得到目标分子；传统的酶联免疫方法是通过物理吸附将生 物分子固定在酶标板表面，因而限制了该方法的敏感性和稳定性。磁性纳米微球有巨大的 比表面积，可偶联更大量的生物分子，并且通过双功能化学试剂将生物分子共价偶联在其 表面，因而大大提高反应速度、检测灵敏度和稳定性。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中肝癌诊断试剂检测用时长、抗体固定容量小、灵敏度较低和 稳定性较差的技术问题，为了解决传统酶联免疫方法中固定的抗体容量较小、反应时间较 长、灵敏度相对较低和固定的抗体稳定性较低的技术问题，本发明提供一种GP73单克隆抗 体及一种表面偶联有GP73单克隆抗体的超顺磁性纳米免疫微球，及利用该微球采用双抗 体夹心酶免法或化学发光法检测人血清或血浆中GP73抗原的方法。用于产生所述GP73单 克隆抗体的抗原具有下述氨基酸序列：AAAERGAVELKK。本发明提供的超顺磁性纳米免疫微 球具有偶联更多抗体、免疫反应速度较快、特异性高、重复性好、成本低、实验条件要求简单 等特点。本发明提供的超顺磁性纳米免疫微球，及利用该微球检测GP73抗原的方法，能够 用于肝癌早期诊断。
[0006] 为达到上述目的，本发明的技术解决方案是：
[0007] 本发明提供一种用于检测GP73抗原的单克隆抗体，用于产生所述单克隆抗体的 抗原具有下述氨基酸序列：
[0008] AAAERGAVELKK (参见序列 1)。
[0009] 进一步的，所述单克隆抗体是CGMCC保藏编号9806的GP73单克隆抗体杂交瘤细 胞产生的抗体。
[0010] 用于检测GP73抗原的抗体称为GP73抗体。所述GP73单克隆抗体具有高免疫活 性。
[0011] GP73抗体针对GP73抗原的超保守部位（PC Site)，因此具有高度敏感性和特异 性。
[0012] 本发明还提供一种超顺磁纳米免疫微球，所述纳米免疫微球包括纳米微球，所述 纳米微球上偶联有所述GP73单克隆抗体。
[0013] 所述超顺磁纳米免疫微球可简称为磁性免疫微球。
[0014] 所述GP73单克隆抗体通过双功能化学试剂共价偶联在磁性纳米微球表面。所述 双功能化学试剂是戊二醛，或，EDC (1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）碳二 亚胺。
[0015] 进一步的，所述超顺磁纳米免疫微球中，所述纳米微球包括微球核心和无机小分 子，所述无机小分子覆盖在微球核心的表面形成无机小分子层，所述纳米微球通过无机小 分子偶联所述抗体。
[0016] 所述微球核心表面覆盖薄层无机小分子，可减少非特异性吸附。所述微球表面利 用-NH 2, -C00H，或PEI (聚醚酰亚胺）进行表面化学修饰。
[0017] 所述微球核心的材质是四氧化三铁，所述微球核心的直径尺寸为6-12nm ;所述微 球的直径为10~30nm。进一步的，所述微球核心的直径尺寸为8nm。
[0018] 所述的超顺磁纳米免疫微球中，所述无机小分子是二氧化硅（Si02)。
[0019] 本发明还提供一种用于检测GP73的多克隆抗体，用于产生所述多克隆抗体的抗 原选自下述氨基酸序列的片段：
[0026] 用于检测GP73抗原的多克隆抗体称为GP73多克隆抗体。所述GP73多克隆抗体 上偶联酶标记物。
[0027] 进一步的，用于产生所述多克隆抗体的抗原为下述氨基酸序列中至少两种氨基酸 序列的组合：
[0028] MKEVKEQCE (参见序列 2);
[0029] EAVASRDLS (参见序列 3);
[0030] PERDQLVIP (参见序列 4)。
[0031] 本发明还提供一种制备上述纳米免疫微球的方法，所述方法包括下述步骤：
[0032] (1)取50-200 μ 1超顺磁性纳米微球；
[0033] (2)对微球表面进行化学修饰；
[0034] (3)将双功能化学试剂共价偶联在磁性纳米微球表面；
[0035] (4)用洗涤液进行洗涤；
[0036] a.将超顺磁性纳米微球加入400-800 μ 1洗涤液，并使之分散；
[0037] b.磁性分离，弃上清液；
[0038] (5)加入浓度为0· 5~3mg/ml的GP73单克隆抗体溶液，恒温振荡反应；
[0039] (6)磁性分离，弃上清液；
[0040] (7)用相同洗涤液进行洗涤；
[0041] a.每次加入洗涤液400-800 μ 1，并使之分散；
[0042] b.磁性分离，弃上清液；
[0043] c.重复以上洗涤步骤2-3次；
[0044] d.加入0· 5~2ml贮存液，4°C保存备用。
[0045] 所述洗涤液为0. 01~0. 2M的碳酸盐缓冲液，PH = 8. 0~9. 5 ;或0. 01~0. 2M的 三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液，PH = 7. 0~7. 6。
[0046] 所述GP73单克隆抗体的溶液采用碳酸盐缓冲液，PH = 8. 0~9. 5 ;或0. 01~0. 2M 的三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液，PH = 7. 0~7. 6。
[0047] 所述贮存液为 0· 01 ~0· 2M 的 PB，PH = 7. 0 ~8. 0 ;或 0· 01 ~0· 2M 的 Tris-HCl， PH = 7. 0~8. 0 ;所述贮存液中均加入防腐剂，所述防腐剂为0. 01~0. 2 %的NaN3或者 0· 01~0· 2%的硫柳汞。
[0048] 所述防腐剂的浓度单位为重量（克）体积比（毫升）。
[0049] 所述第（5)步中恒温振荡反应的温度为4~40°C，反应时间为10~60分钟，振动 速度为180~200rpm。
[0050] 本发明还提供一种杂交瘤细胞株，其是CGMCC保藏编号9806的GP73单克隆抗体 杂交瘤细胞株。
[0051] 本发明还提供一种利用所述的超顺磁性纳米免疫微球检测GP73抗原的方法（简 称显色检测法），所述方法包括下述步骤：
[0052] (1)将试管置于试管架上，设阳性对照试管孔2孔，阴性对照试管孔3孔，空白对照 孔1孔；
[0053] ⑵在待检样品试管中加入10~50 μ 1样品稀释液和5~100 μ 1的待检样品，阳 性对照管和阴性对照管中分别加入阳性对照样品和阴性对照样品50~100μ 1 ;
[0054] (3)充分混匀已加贮存液的含有GP73单克隆抗体的超顺磁性纳米免疫微球溶液 后，用加样器向各反应试管中加入5~50 μ 1该微球溶液，混匀，4~40°C反应0. 5~2小 时；
[0055] (4)各试管加入5~50 μ 1已偶联GP73多克隆抗体的酶标记物，混匀，4~40°C反 应0. 5~2小时；
[0056] (5)用相同洗涤液洗涤各管至少2次：
[0057] a.每次加入洗涤液400-800 μ 1，并使之分散，
[0058] b.磁性分离，弃上清液；
[0059] (6)各管加入50~200 μ 1 3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺（TMB)显色液，混匀，4~ 40°C反应10~30分钟；
[0060] (7)各管加入50~200 μ 1终止液，混匀，磁性分离，将上清液移至专用于酶标仪上 进行吸光度值（0D)测量的酶标板孔中，在酶标仪上用450nm和630nm进行双波长测定各孔 0D值。
[0061] 本发明还提供另一种利用上述的超顺磁性纳米免疫微球检测GP73抗原的方法 (简称化学发光检测法），所述方法包括下述步骤：<