专利名称：用于治疗性克隆的人体细胞组织器官保存方法
技术领域：
本发明涉及冻存技术，尤其是人体细胞组织器官(如脐带组织和脐带相关细胞)的体外冻存技术，其中冻存的细胞被用于治疗性克隆及其它用途。通过本发明的冻存技术，冻存的组织和细胞可以在复苏使用前无限期保存。当冻存的组织和细胞被复苏后，可用于治疗性克隆和移植、功能基因组学研究、疾病相关基因筛选以及筛选有生物活性的化合物的原料。
目前，生物材料的储存时间是由生物材料降温至冷冻保存温度的过程所决定的。降温过程中细胞内外的水分从液体状态到固体状态要经历结冰过程，包括水分子的有序排列——结晶化或非结晶化过程。对于冷冻学家而言，其技术关键在于使细胞进入冷冻温度后仍能使其回到生理状态而没有损伤。
细胞和组织冻存的两个关键步骤是冻融和结晶。冻融技术要求细胞外液体结冰，但采用了很多步骤来减少细胞内结冰。有人建议采用全样本冻存，但仍无法防止细胞内结冰，正是这些冰晶在冻融中对细胞造成致命的损伤。另一技术是结晶技术，其中试图采用高浓度液体和/或多聚体来减少冰晶形成。然而长久地暴露于高浓度甚至毒性水平的结晶添加剂中对细胞的损害亦很大。
在人体的各种细胞组织器官中，脐带组织和脐带相关细胞一直被认为是生物学废物，在胎儿出生后予以废弃，尽管有些脐带组织和脐带相关细胞可作为人体细胞来源而用于体外研究，但通常为短期研究。并没有将脐带组织和脐带相关细胞经过冻存，解冻后再用于研究的报道。
近年来，随着体细胞克隆技术、治疗性器官克隆和同种或异种移植技术的发展和成功，要求一种能长期保存脐带组织和脐带相关细胞的方法，确保脐带组织和脐带各种细胞在长期乃至无限期的保存后能安全复苏，并且保持其理化性质不变，以便为脐带提供者本人或他人提供器官克隆、移植、功能基因组学研究、疾病相关基因筛选以及筛选有生物活性的化合物的原料所用。
因此，本发明的目的在于提供一种对用于治疗性克隆的人体细胞组织器官进行冻存的方法，用该方法进行冻存的人体细胞、组织和器官，在解冻后能安全复苏并且保持理化性质不变，从而用于各种用途如制备治疗性克隆。
在本发明的一个方面，提供了一种对用于治疗性克隆的人体细胞、组织或器官进行冻存的方法，该方法包括以下步骤(a)将获取的人体细胞、组织或器官浸入冷冻保护液，充分混匀冷冻保护液，使冷冻保护液充分渗透入该细胞、组织、器官；(b)起始温度设为20±5℃，以5-15℃/分钟降温至5-8℃，然后持续15-30分钟，进行点冰；(c)点冰以后，维持5±3分钟以使冷冻温度仍保持在5-8℃；(d)调整降温速度至-0.5至-1.5℃/分钟并将温度降至-8±1℃，维持30±20分钟；(e)以-0.1至-0.5℃/分钟的速度下降至低于-70℃的保存温度。
较佳地，步骤(b)-(e)是在CO2缓冲环境中进行；而且，用液氮冷却的金属探棒点冰而形成细胞外点冰。较佳地，在冰晶形成后，温度以每分钟0.5至1.5℃(如1度)的速度下降至约-8℃，并保持10-50分钟以保证冷冻组织进入冷冻状态之前，在冷冻保护液中达到物理和生物学平衡状态。
本发明还提供了将冻存的人体细胞、组织、器官解冻，用于制备治疗性克隆供核的方法，它包括将上述冻存的人体细胞组织器官在1-3分钟内快速解冻，然后在体外培养用作供核。
在生物材料的冻存过程中，冷冻保护剂起的作用是保护结冰过程中细胞的活性。冷冻保护剂的主要通过以下方式起到保护作用，即当水转变成冰且盐离子浓度升高时，起稀释作用。结冰量取决于温度和溶液组分。另外，冷冻保护剂还能降低细胞内的结冰温度、稳定细胞膜和蛋白。
所有的溶液在形成冰晶核心之前都能在低于其冰点的温度下过冷而不冻结。当用冻融法冻存时，细胞外介质的冻结出现在过冷低点时的点冰。非点冰引起的结冰是在溶液温度大大地低于冰点时的自发结冰。因为该过程是自发的，结冰随机发生于无法预见的温度下，因此在同样的冻存程序下细胞的存活力差异很大。
另外，当极度过冷时发生的快速结冰易造成细胞和组织损伤。另外，如果细胞外结冰发生极度过冷时，细胞内冰形成的可能性大大增加。这一现象源于结冰导致的细胞脱水延迟发生，进一步增加细胞内水的潴留，从而使细胞内结冰的可能性又大大地增加了。
一旦细胞外点冰完成，样品被冰包围，样品就能降温至冻存状态。
降温步骤是冻融法中的关键点。部分结冰的细胞外溶液浓度高于细胞内溶液，为达到热力学平衡，细胞丢失水分而脱水。随着细胞外冰的逐渐增多，脱水愈加严重。细胞的三个特性决定其脱水的速度(1)细胞膜的水渗透率(水渗透率愈差，细胞脱水的时间愈长)；(2)细胞膜水渗透率的温度依赖性(所有细胞膜在温度降低时其水渗透率下降)；(3)细胞的大小(大细胞比小细胞需要更长的时间发生脱水)。由于各细胞的特性各不相同，其冻存的优选条件就有一定的差异。
尽管，冻存时细胞损伤的确切机制尚未完全阐明，然而通过细胞活力测定发现，非常快和非常慢的冷却速度都大大地降低细胞活力，中等冷却速度产生最优选的结果。尽管对于不同的细胞，其优选冷却速度和降温曲线可以差别很大，但冷冻的总体程度是相近的。过快冷冻细胞没有足够的时间脱水而形成细胞内冰，细胞损伤主要归因于细胞内冰。过慢冷冻时，细胞损伤主要因为过长时间暴露于高浓度的细胞内和细胞外的盐分以及冷冻保护液，或细胞外冰和细胞之间的相互作用。
在细胞内冰核形成之前必须使细胞脱水。当细胞在1M和2M浓度的冷冻保存液内时，细胞脱水这一事件多发生在-50℃-40℃之间。值得一提的是，细胞内的结冰量在降温中可能不会对细胞造成伤害，但如果解冻不够快的话，细胞会因为溶解时发生肿胀而死亡。
利用本发明的组织和细胞冷冻方法，可以在低温下避免细胞内冰晶形成和细胞毒性化学试剂的使用，利用程序冷冻仪在适当降温速度下进行冷冻保护组织。该组织和细胞的冷冻保存方法使组织和细胞能无限期保持其活力和生理特性，以供器官克隆、移植、体外检测以及其他功用方面的应用。
本发明提供的对用于治疗性克隆的人体细胞组织器官进行冻存的方法，包括步骤(a)将获取的人体细胞、组织或器官浸入冷冻保护液，充分混匀冷冻保护液，使冷冻保护液充分渗透入该细胞、组织、器官；(b)起始温度设为20±5℃，以5-15℃/分钟降温至5-8℃，然后持续15-30分钟，进行点冰；(c)点冰以后，维持5±3分钟以使冷冻温度仍保持在5-8℃；(d)调整降温速度至-0.5至-1.5℃/分钟并将温度降至-8±1℃，维持30±20分钟；(e)以-0.1至-0.5℃/分钟的速度下降至低于-70℃的保存温度。
适用于本发明方法的人体细胞组织器官可以是任何的人体细胞、组织和器官，其中包括(但并不限于)脐带相关细胞、皮肤细胞、乳腺细胞、输卵管细胞、耳细胞、卵巢细胞、上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、卵丘细胞、肌肉细胞、神经细胞、成骨细胞；脐带组织、皮肤、乳腺等。
在本申请中，“脐带相关细胞”指来源于脐带的各种细胞，包括消化后体外培养的脐带组织的各种细胞，如血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞等。“脐带组织”指脐带的全部组织，包括小段、切片等。
在本发明方法中，冻存温度一般为低于-70℃，较佳地为不大于-120℃，更佳地为不大于-140℃，最佳地为不大于-196℃。如为短期保存(运输途中)可置于-76℃(干冰的温度)。长期保存时，温度宜更低，例如采用液氮保存(-196℃)。
适用于本发明方法的冷冻保护液包括细胞渗透性晶体形成试剂或非细胞渗透性的晶体形成试剂合适的细胞渗透性晶体形成试剂的例子包括(但并不限于)丙二醇、乙二醇、二甲亚砜、甘油，较佳地是甘油。非细胞渗透性的晶体形成试剂的例子包括(但并不限于)高分子量复合糖比如硫酸软骨素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇或羟乙基淀粉等。
通常，冷冻保护液被稀释于稀释剂中。合适的稀释剂例子包括磷酸缓冲液和细胞培养液如DMEM、IDMEM、MEM、M199、RPMI1640、Ham′s F-10、NCTC109、NCTC135培养液、或以上稀释剂的混合物。较佳地，该稀释剂是DMEM培养液。为了在冻融过程中保持最佳的细胞活力，冷冻保护液和稀释剂可根据各个不同的细胞加以调整。
一种优选的冷冻保护溶液是稀释于DMEM培养液的1.5M到2.5M甘油，最好是2M的甘油。
在本发明的一个实例中，冷冻保护剂为1.5-2.5M甘油稀释于DMEMF培养基中；冷冻组织，细胞浸入冷冻保护液时在20℃中完成，然后，降低温度从20℃至6℃。降温速度为-5至-15℃/分钟。
在将细胞组织样品与冷冻保护溶液混匀时，可使用任何机械搅动方式进行，从而增强冷冻保护液的渗透性。合适的混匀方法例子包括振荡、水平摇动、离心、真空泵抽吸等。通常，要有足够的时间以保证冷冻保护液的充分渗透，因此混匀时间通常为1-4小时。较佳地为2-3小时。
当稀释冷冻保护液的培养基为碳酸氢钠缓冲体系，较佳地可采用CO2缓冲环境，因为在冷冻保护液渗透入组织和细胞的渗透过程中，需要CO2缓冲环境以确保溶液的酸碱度稳定。CO2缓冲环境中的CO2的具体含量可根据不同的组织和细胞加以调整，以期保持最佳的细胞活力。通常，CO2浓度为含5％或10％或更高。
在本发明方法中，宜先将样品温度从室温降至约-5℃至-10℃。这是可采用快冻或慢冻程序，较佳地是降温速度为5-12℃/分钟，更佳地降温速度为8-10℃/分钟。
在点冰以促发冰晶形成时，可用液氮冷却的金属探针接触装有组织或细胞的冻存管，也可直接接触管内的冷冻保护液或通过冷冻室内的机械臂操作，也可在冷冻室内注入氟立昂或干冰进行点冰。
在点冰之后的降温过程中，宜采用慢冻程序，即降温速度低于0.1-0.5℃/分钟，更佳地降温速度为0.2-0.5℃/分钟，更佳地降温速度为0.2-0.4℃/分钟，最佳地降温速度约为0.2-0.3℃/分钟。
在溶解冻存组织或细胞时，宜以较高速度升温，在1-3分钟内将温度升至37℃。一种解冻方法是将冻存管直接置入37℃水浴。也可采用其他直接而快速的加热方法。
在解冻后，为避免冷冻保护液在常温下对细胞的毒性作用，须在解冻后15分钟内，最好是在解冻后立即去除冷冻液。
解冻后的组织或细胞，可用于制备治疗性克隆，以及作为功能基因组学研究，疾病相关基因筛选以及筛选有生物活性的化合物的原料。
下面结合实施例进一步详细地描述本发明，应理解，这些实施例仅用于阐述目的而不用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1人脐带组织和脐带相关细胞的冻存将脐带组织浸入至少等量的冰上预冷的2.0M甘油的DMEM培养基冻存保护液中，持续1-2小时。或者，将脐带内皮细胞的悬浮液与等量的冰上预冷的同上冻存保护液，持续0.5小时。期间充分混匀冷冻保护液，可置于CO2缓冲环境中，以50-70rpm摇床摇匀，或在管中轻轻震摇。
然后移入冻存管并真空封口。冻存管置入程序冷冻仪(Planer)，起始温度设为20℃，以5-15℃/分钟降温至6℃，然后持续20分钟，接着进行点冰。持续20分钟以确保整体组织温度一致(至少要维持15分钟)，为6℃。点冰的接触点在冷冻管的液面以下。
点冰以后，维持5分钟以使冷冻室内温度仍保持在6℃。调整降温速度至-1℃/分钟并将温度降至-8℃，维持30分钟。然后以-0.3℃或更慢速度下降至预定的保存温度，可以是-70℃，也可以是更低温度如为-120℃或-140℃下，则对细胞的损伤较小。
冻存组织(或细胞)从程序冷冻仪中移入-196℃冷冻库或冷冻室内保存，直至使用。
实施例2人脐带组织和脐带相关细胞的冻存样品的解冻冻存组织溶解要求在1-3分钟内快速完成。在该实施例中，将含人脐带组织和脐带相关细胞的冻存样品的冻存管直接置入37℃水浴，或其他直接而快速的加热方法。
解冻后，立即用1000rpm离心10分钟的方法，去除冷冻液。
实施例3人脐带内皮细胞进行体细胞克隆1、获得供核的人脐带内皮细胞将实施例2或者直接培养获得的人脐带内皮细胞，用M199或RM1640等培养液(加10％胎牛血清)培养，传代，遗传分析，冷冻保存或直接作供核。
2、奶山羊超排与寄母羊同步奶山羊超排每只动物肌注PG,0.06-0.1mg/次，间隔10-14天后注射第二次，在第二次注射PG 10-14天后开始超排，即首先肌肉注射FSH，用量按7-12IU/Kg计(不同种动物用量不尽相同)，分6次，2次/日，每次间隔8-12小时。间隔24小时发情时注射LRH,25ug/次，根据羊的体重作适当调整。
寄母羊的同步为与提供卵母细胞胞质的供质母羊同步，受体母羊间隔10-14天分两次肌肉注射PG，在供质母羊超排注射PG前24小时，受体也同时注射PG，受体注射LRH的时间及剂量同供体。
3、卵母细胞的回收奶山羊注射LRH后28-30小时后手术回收卵母细胞。按手术常规剪毛、消毒、打开腹腔、拉出子宫与输卵管，用10ml针筒7号针头，冲卵液为含5％BSA的F10培养液，冲出输卵管内的卵子接于园杯内。在体视解剖镜下，将卵母细胞检出置于CZB培养液中，37℃,5％二氧化碳培养箱中培养。
4、卵母细胞去核与注射人的体细胞将卵母细胞移于含7.5ug/ml细胞松弛素B的CZB培养液中20min，再移至CZB(含20mM HEPES)培养液中，同时将已消化成球形的脐带内皮细胞或成纤维细胞亦移至该液中。按常规将卵母细胞去核，去核后再将人的脐带内皮细胞直接注入卵母细胞的胞质内，形成的细胞被称之为重构卵。重构卵置于CZB液中培养30分钟，然后激活。
5、激活与包埋重构卵于CZB+细胞松弛素B(7.5μg/ml)+离子霉素(10μm)中，37℃培养5分钟。移至CZB+细胞松弛素B(7.5μg/ml)+6-DMAP(2μm)370C，液滴法培养2-6小时。激活后的重构卵移至CZB中，待包埋。
包埋采用双层包埋。所用的包埋液是0.8％与1.0％琼脂糖(低熔点胶，约40℃)溶液。该包埋液是这样制备的在10ml锥形玻璃离心管内将适量的琼脂糖与生理盐水混合煮沸，至完全溶解后置于42℃，水浴待用。
包埋时，在一塑料平皿中加入含Ca2+、Mg2+的PBS液，在PBS液底部用吸管加入胎牛血清，将待包埋的卵母细胞移入血清层，使其自然下沉，待位于底壁，吸出。然后移入另一含刚倒出的0.8％琼脂糖的小平皿中，将卵母细胞的位置移动2-4次(起到洗涤作用)，再均匀吸卵(卵与卵之间有一定的距离，但相靠不是太远)，移至PBS中。让其自然凝固，再分割，换一口径稍大的吸管，按相同方法进行第二层包埋，不同点在于包埋液的琼脂糖浓度为1.0％。
6、移植与回收应用手术的方法，将包埋后的重构卵吸入移卵管，从输卵管喇叭口处插入移卵管，将卵移进输卵管内。随后在输卵管与子宫连接部用缝线结扎。在体内培养6天后，剪下输卵管，用培养液冲出胚胎，观察胚胎发育情况。
7、发育胚胎检验与保存采用PCR方法对发育的胚胎进行验证，即该胚胎是否是来自人体细胞。方法如下从发育至桑椹或囊胚的胚胎取其部分细胞进行PCR检测，所用的随机单引物(10bp)的序列为5′-ACCCCCGAAG-3′，PCR反应程序是先94℃4分钟，然后94℃10秒→36℃15秒→72℃30秒(共40个循环)，最后是72℃4分钟。
发育至囊胚的胚胎的保存可利用其内细胞团细胞进行体外培养，建立ES细胞；或者将发育的胚胎液氮冷冻保持备用。结果如下(一)超数排卵
1、超排奶山羊总数20只2、奶山羊超排效果卵巢发育率(以卵巢直径＞1cm计)85％(17/20)平均每只奶山羊排卵数11.2枚(225/20)平均每只奶山羊回收卵数11.7枚(235/20)回收卵效率104％(235/225)(在计排卵点数时有误，有的几个排卵点紧靠在一起)(二)受体同步发情通过PG处理后，羊的同步率为78％(20/26)。
(三)体细胞培养建立婴儿脐带内皮细胞或成纤维细胞系。在传代供过程中进行了染色体数分析。观察了100分裂相，2倍体(46条染色体)占75％。
本试验所用的人体细胞是脐带内皮细胞或脐带成纤维细胞，未进行冷冻与饥饿处理。
(四)卵母细胞去核与注射人的体细胞去核总卵数153枚，其中成活148枚，成活率96.7％体细胞注射后成活卵数133枚重构卵存活率89.8％(五)重构胚发育情况重构胚早期发育情况表
结果表明，将人婴儿脐带内皮细胞移植入去核卵母细胞的发育率达到75.5％，正常发育率达到60.2％。
(六)发育胚胎的验证用发育胚胎的细胞与山羊胚胎(囊胚)的DNA，分别进行随机引物PCR分析，其检测结果见
图1，其中goat1和2分别为莎能奶山羊细胞、和本地山羊细胞，human1和human2为来自2个治疗性克隆植入前胚胎的细胞。
结果表明，发育胚胎的细胞的两个样品间是一致的，两种山羊囊胚间亦是一致的；而山羊囊胚与发育胚胎(其基因组来自人体细胞)之间的差别是很明显的。因此，这证实发育胚胎来自人，即胚胎细胞中含有的是人的染色体和基因组。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1．一种对用于治疗性克隆的人体细胞、组织或器官进行冻存的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(a)将获取的人体细胞、组织或器官浸入冷冻保护液，充分混匀冷冻保护液，使冷冻保护液充分渗透入该细胞、组织、器官；(b)起始温度设为20±5℃，以5-15℃/分钟降温至5-8℃，然后持续15-30分钟，进行点冰；(c)点冰以后，维持5±3分钟以使冷冻温度仍保持在5-8℃；(d)调整降温速度为-0.5至-1.5℃/分钟并将温度降至-8±1℃，维持30±20分钟；(e)以-0.1至-0.5℃/分钟的速度下降至低于-70℃的保存温度。
2．如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)-(e)是在CO2缓冲环境中进行；而且，用液氮冷却的金属探棒点冰而形成细胞外点冰；
3．如权利要求1所述的方法，其特征在于，冰晶形成后，温度以每分钟1度的速度下降至-8℃，并保持10-50分钟以保证冷冻组织进入冷冻状态之前，在冷冻保护液中达到物理和生物学平衡状态。
4．如权利要求1所述的方法，其特征在于，人体细胞组织器官选自下组脐带相关细胞、皮肤细胞、乳腺细胞、输卵管细胞、耳细胞、卵巢细胞、上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、卵丘细胞、肌肉细胞、神经细胞、成骨细胞；脐带、皮肤、乳腺。
5．如权利要求1所述的方法，其特征在于，冻存状态的温度为不高于-120℃。
6．如权利要求5所述的方法，其特征在于，冻存状态的温度为不高于-140℃。
7．如权利要求1所述的方法，其特征在于，冷冻保护液含有细胞渗透试剂、晶体形成试剂或非晶体形成试剂，并且稀释于选自下组的培养基或介质中DMEM、IDMEM、MEM、M199、RPMI1640、Ham′s F12、Ham′s F10、NCTC109、NCTC135或磷酸缓冲盐。
8．如权利要求1所述的方法，其特征在于，细胞渗透试剂、晶体形成试剂或非晶体形成试剂选自下组硫酸软骨素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯乙二醇、羟乙基淀粉、甘油、丙二醇、乙烯乙二醇、二甲亚砜。
9．如权利要求1所述的方法，其特征在于，冷冻保护剂为1.5-2.5M甘油稀释于DMEMF培养基中；冷冻组织，细胞浸入冷冻保护液时在20℃中完成，然后，降低温度从20℃至6℃，降温速度为-5至-15℃/分钟。
10．如权利要求1所述的方法，其特征在于，将冻存的人体细胞组织器官解冻，用于制备治疗性克隆的供核，其步骤包括在1-3分钟内快速解冻，然后在体外培养用作供核。
全文摘要
本发明涉及对人活细胞、活组织和活器官以及原代细胞、继代细胞和细胞株的体外保存技术。它包括将人各种组织细胞浸入冷冻保护液,与冷冻保护液充分混匀,冷冻保护液有效地渗透入组织,分阶段地将温度降至预定温度。冷冻组织细胞在使用前可无限期保存。可用于治疗性器官克隆的供体细胞或细胞核。此外冻存的人体组织,细胞解冻复苏后体外培养可作为功能基因组学研究,疾病相关基因筛选以及筛选有生物活性的化合物的原料。
文档编号A01N1/02GK1302542SQ00111408
公开日2001年7月11日 申请日期2000年1月3日 优先权日2000年1月3日
发明者成国祥 申请人:上海中路生物工程有限公司