一种核转移的方法

专利名称：一种核转移的方法
技术领域：
本发明涉及核转移的方法和由此发育成的胚胎。还包括培养胚胎和重组自本发明的核转移方法产生的胚胎动物的方法。
背景技术：
最近许多发表物阐述了核转移的潜在好处(Galli etal.，1999；Colman，1999；Wells & Powell，2000；Lewis etal.，2001；Trounson，2001)。在过去的二十年里核转移的方法被积极探索和开发并且在许多参考文献中有所描述(见，例如，Campbell etal.，Theriogenology，43181(1995)；Collas etal.，Mol.ReportDev.，38264-267(1994)；Keefer etal.，Biol.Reprod.，50935-939(1994)；Simsetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，906143-6147(1993)；WO97/07668；WO97/07669；WO94/26884；WO94/24274；和美国专利申请第4,944,384和5,057,420号(描述了牛的核移植)，在此将所有这些以其全部引入作为参考。
简言之，核转移的方法一般包括以下步骤(1)去除卵母细胞核；(2)分离要与去核的卵母细胞结合的供体细胞或细胞核；(3)将细胞或细胞核插入去核的卵母细胞中以形成重组细胞；(4)将重组细胞植入动物子宫以形成胚胎；和(5)胚胎发育。
尽管可以从活体动物的或者输卵管和/或者卵巢分离卵母细胞，但本发明卵母细胞一般从死亡动物上获得。在去核前一般使卵母细胞在本领域普通技术人员已知的多种培养基中成熟。去除卵母细胞核可通过本领域普通技术人员熟知的许多方式进行。
通常在融合前经供体细胞微注射于透明带下将供体细胞或细胞核插入去核的卵母细胞中以形成重组细胞。诱导融合可通过使用经过接触/融合平面的直流(DC)电脉冲(电融合)，将细胞暴露于促融合的化学物质，如聚乙二醇，或者用灭活的病毒，如仙台病毒。
一般在将核供体和受体卵母细胞融合之前，融合时，和/或融合之后使用电和/或非电方式将重组细胞激活。激活方法包括电脉冲，化学诱导的休克，精子穿透，增加卵母细胞内二价阳离子水平，和降低卵母细胞内蛋白质的磷酸化(如通过激酶抑制剂)。激活的重组细胞，或胚胎一般用本领域普通技术人员熟知的培养基培养，然后转移至动物的子宫。
直至最近，几乎全部从原始生殖细胞或胚胎细胞常规分离供体细胞核。真正地，直至20世纪90年代仍广泛相信在核转移后只有胚胎的或未分化的细胞类型能够指导任何类型的胚胎发育。结果大多数现在用于核转移操作的技术是利用胚胎细胞作为供体细胞和去核的卵母细胞作为受体细胞进行的。
尽管，分离和使用胚胎供体细胞需要特殊技术并且是非常细致的工作。但更重要的是，胚胎供体细胞是用于核转移方法的有限遗传物质资源并且其在体外操作以产生基因组被处理的(例如，转基因的)细胞，胚胎，和动物是不可能的。
1997年报道的用培养的细胞系作为供体(见，例如Wilmut etal.，Nature(London)385，810-183(1997))进行了成功的核转移使这种状态改变了。从而随着体细胞核转移的问世传统胚胎细胞核转移的一些问题被解决。特别是，克服了遗传物质的有限资源。然而，由于不是胚胎细胞核转移的所有技术都能适用于体细胞核转移所以一些问题仍然存在。例如，由于体细胞与胚胎细胞相比大小的巨大差异使传统使用的某些技术不再适用。
实际上，上面描述方法的体外步骤效率低导致低受孕，低产率，生后死亡和发育异常。用Wilmut等描述的方法(Wilmut etal.，Nature(London)385，810-183(1997))体细胞核转移的活产率估计大约是三百分之一，即，核转移效率充其量是0.4％(即克隆的小羊数除以用于生产这些数目克隆羊的核转移数)。更重要的是，文献中描述的所有方法需要有高度经验的技术人员和昂贵的设备。为使核转移方法广泛实际应用成为更加商业化，迫切需要提高克隆效率，降低与方法相关的费用和克服对高度经验技术人员的需要。
因此，尽管表面上建立了用于体细胞核转移的许多方法，但是仍然存在某些主要技术困难妨碍了这些方法的广泛实际应用。
因企图改善克隆效率许多研究小组已经改良了核转移技术；但是，这些改良仍需要昂贵的设备和/或技术好的工作人员。例如，上面列出的核转移方法中重要的步骤是步骤3将供体细胞或细胞核插入去核的卵母细胞一步。如上面所讨论的，这步一般需要两个过程，首先，将供体细胞微注射于去核的卵母细胞透明带下和然后，融合。但是，由于需要专业的技术和设备使微注射步骤妨碍了核转移的商业化希望。
避免使用以前用在卵母细胞和胚胎供体细胞的较传统方法中的微注射的技术包括去除透明带。参见，例如，WO98/29532和Peura et al.(1998)，在此将两者引入作为参考。不幸的是，通常认为完整的透明带在体细胞核转移中是重要的，原因包括几点(1)保持极体与卵母细胞的中期板靠近以显示合适的去核位点，(2)保持供体细胞与卵母细胞胞质体在融合前和融合时靠近，(3)供融合期间配对保护，和(4)支持重组和激活后的胚胎发育。因此，Peura等出处同上的技术未能成功用于体细胞。
在核转移期间透明带的存在意味着需要复杂的微操作工具和高技术水平。为避开透明带使用微操作仪来将供体细胞转移至去核卵母细胞的卵周隙以产生重组细胞。
微操作仪是特殊设备其需要工具制造装置包括毛细牵拉器(capillarypullers)，研磨器和显微拉制仪(microforge)。更重要的是，微操作仪的使用和制造微操作仪装置需要专业的技术人员。这些需要相当大地限制了核转移方法大规模应用所需的简单化。
基于前述，可以看到体细胞核转移方法的好处和前景是很可观的其提供使用保持产生能发育成活体动物的重组细胞能力的供体细胞并且提供高克隆效率而不需要微操作仪。直接的结果将包括降低仪器和人员的开支，和将因此导致克隆动物生产的更有效的成本花费。
最后，申请者目前已经开发的体细胞核转移方法其避免微操作仪的使用，因此允许使用标准融合技术，而维持或提高克隆效率。在一个实施方案中，使用无透明带，去核的卵母细胞作为受体和体细胞或核作为供体。为避免计划外的胚胎聚集，或者单独或者以二或三个重组的核转移胚胎为“聚集体”，将重组的无透明带胚胎在特殊系统中培养，因为传统的系统是不合适的该目的的。
发明概述本发明最广义的方面提供生产克隆的哺乳动物细胞的一种新的和改进的方法。
因此，本发明第一方面提供核转移方法其包括转移体细胞或体细胞核至无透明带的去核卵母细胞的步骤。
本发明第二方面提供生产基因工程的或转基因的哺乳动物的方法，其通过转移体细胞或细胞核至无透明带的去核卵母细胞前在体细胞或细胞核中将目的基因插入，去除或修饰。
本发明进一步提供生产基因工程的或转基因的哺乳动物的方法其包括(i)在体细胞或细胞核内插入，去除或修饰一个或多个目的基因；(ii)在适合形成重组细胞的条件下将体细胞或细胞核插入无透明带的去核卵母细胞中；(iii)激活重组细胞以形成胚胎；(iv)培养该胚胎直至大于二细胞发育阶段；和(v)转移该培养的胚胎至宿主哺乳动物因此胚胎发育成转基因胎儿。
第三方面，本发明提供克隆哺乳动物的方法其包括(i)在适合形成重组细胞的条件下将目的体细胞或细胞核插入无透明带的去核哺乳动物卵母细胞中；(ii)激活重组细胞以形成胚胎；(iii)培养该胚胎直至大于二细胞发育阶段；(iv)转移该培养的胚胎至宿主哺乳动物因此胚胎发育成胎儿。
本发明也提供按照上述方法获得的哺乳动物和它们的后代。
可以用已知方法从任何哺乳动物分离卵母细胞。例如，通过本领域熟知的和在此描述的输卵管回收方法或经阴道的卵母细胞回收方法可以从活体动物的或者输卵管和/或卵巢分离卵母细胞。而且，可以从死亡动物分离卵母细胞。例如，可以从屠宰场获得卵巢并从这些卵巢中吸出卵母细胞。也可以从刚刚处死的动物卵巢分离卵母细胞或者当卵巢已被冰冻和/或溶解时。优选地，从输卵管新鲜分离卵母细胞。
使用前也可以将卵母细胞或胞质体冷藏(cryopreserve)。
尽管这里描述的方法对任何哺乳动物的核转移都是有用的，但是对有蹄动物尤其有用。优选地，有蹄动物选自家养的或野生的牛科(bovids)，羊科(ovids)，鹿科，猪科，马科和骆驼科的代表。这些代表的例子是母牛或公牛，野牛，水牛(buffalo)，绵羊，大角绵羊(big-horn sheep)，马，小马，驴，骡，鹿，麋鹿，驯鹿(caribou)，山羊，印度水牛(water buffalo)，骆驼，美洲驼(llama)，羊驼(alpaca)，或猪。在牛科属中尤其优选的是Bos taurus，Bosindicus和Bos水母牛(buffaloes cows)或公牛。
可以用任何已知方法完成透明带的去除。优选地，去除透明带的步骤选自物理操作，化学处理和酶消化过程。更优选地，通过酶消化去除透明带。优选地，用于消化透明带的酶是蛋白酶，链霉蛋白酶或它们的联合使用。更优选地，酶是链霉蛋白酶。
优选地，使用的链霉蛋白酶浓度在0.1-5％。更优选地，浓度在0.25-2％。最优选地，链霉蛋白酶的浓度大约在0.5％。
本领域的技术人员应当理解可以使用任何去除卵母细胞核的方法，包括抽吸(aspriation)，物理去除，使用DNA特异的荧光染料，和紫外线照射。优选地，使用物理方法去核。更优选地，物理方法是二等分(bisection)。
体细胞选自包括上皮细胞，神经细胞，表皮细胞，角质细胞，造血细胞，黑素细胞，软骨细胞，淋巴细胞(B和T淋巴细胞)，红细胞，巨噬细胞，单核细胞(monocytes)，单核的细胞(mononuclear cells)，成纤维细胞，心肌细胞，和其它肌细胞。
这些可从不同器官获得，例如，皮肤，肺脏，胰腺，肝脏，胃，肠，心脏，生殖器官，膀胱，肾脏，尿道和其它泌尿器官(urinary organ cells)，等等。
优选地，体细胞是成纤维细胞或颗粒细胞。最优选地，体细胞是体外培养的成纤维细胞或颗粒细胞。
优选地，通过融合进行体细胞或体细胞核的转移。更优选地，融合的方法选自化学融合，电融合或生物融合。优选地，化学融合或生物融合(biofusion)通过将无透明带，去核的卵母细胞与体细胞一同暴露于融合试剂。优选地，融合试剂是当将体细胞供体与无透明带，去核的卵母细胞受体比邻放置时能增加不同细胞质膜部分融合概率的任何化合物或生物有机物。最优选地，融合试剂选自聚乙二醇(PEG)，胰蛋白酶，二甲基亚砜(DMSO)，植物凝集素(lectins)，凝集素(agglutinin)，病毒，或仙台病毒。
电融合优选使用通过接触/融合平面的电脉冲来诱导。更优选地，电融合包括向无透明带，去核的卵母细胞与体细胞组合发放一次或多次电脉冲的步骤。
在优选实施方案中，本发明的方法包括将重组细胞与一个或多个卵母细胞融合以进一步增加重组细胞细胞质体积的步骤。
因此，本发明第四方面提供克隆哺乳动物的方法其包括(i)在适合形成重组细胞的条件下向第一个无透明带，去核的哺乳动物卵母细胞中插入目的体细胞或细胞核；(ii)将第二个卵母细胞与该重组细胞融合因而增加了细胞质体积；(iii)激活重组细胞以形成胚胎；(iv)培养该胚胎直至大于二细胞发育阶段；和(v)转移该培养的胚胎至宿主哺乳动物因此胚胎发育成胎儿。
步骤(i)和(ii)可以单独或同时进行。
或者，在一个优选实施方案中，提供培养重组细胞(胚胎)的方法其包括(i)在适合形成重组细胞的条件下向无透明带，去核的哺乳动物卵母细胞中插入目的体细胞或细胞核；(ii)激活重组细胞；(iii)保温和培养一个或多个该细胞直至胚胎大于二细胞发育阶段。
优选地，将胚胎培养至大于60个细胞。更优选地，在60至200个细胞之间。
优选地，将二或多个细胞共同培养。更优选地，将二或三个细胞共同培养。
在可选的实施方案中，将单个重组细胞培养至产生8至128个细胞的胚胎然后将二或多个胚胎组合并共同培养成聚集体。
以聚集体培养无透明带的核转移胚胎增加了要转移的最终胚胎细胞数并增加了受孕率。
本发明也提供按照上面方法获得的哺乳动物和这些哺乳动物的后代。
附图简述


图1表示按照本发明优选方法的结果。提供无透明带卵母细胞-体细胞转移的方法和结果。图A表示二等分前在培养皿里排列的卵母细胞。图B表示人工二等分卵母细胞以产生去核的卵母细胞(胞质体)和核体。图C表示接触前的去核卵母细胞和体细胞。图D表示接触后，融合前的去核卵母细胞-体细胞。图E表示去核卵母细胞-体细胞对沿着进行第一次融合的电融合线排列。图F表示未融合的去核卵母细胞和融合的去核卵母细胞-体细胞对沿着进行第二次融合的电融合线排列。图G表示融合后在GO系统中发育7天的胚泡。图H表示离开GO系统后的同一胚泡。
发明详述除非有其它说明，本发明的实施使用本领域中的传统分子生物学，细胞生物学，和克隆技术。这些技术是技术人员熟知的，并在文献中有详细解释。见，例如，Sambrook and Russell″Molecular CloningA LaboratoryManual″(2001)；CloningA Practical Approach，″Volumes I and II(D.N.Glover，ed.，1985)；″AntibodiesA Laboratory Manual″(Harlow & Lane，eds.，1988)；″Animal Cell Culture″(R.I.Freshney，ed.，1986)；″Immobilised Cells andEnzymes″(IRL Press，1986)。
在描述本方法之前，应当明确本发明不局限于描述的具体材料和方法，因为这些可以改变。也应理解这里使用的命名法仅仅以描述具体实施方案为目的，并未打算限制本发明的范围，本发明的范围只由附加的权利要求书限制。必须指出如这里和附加的权利要求书中使用的单数形式“一”和“这”如无上下文明确提示则包括复数关联。因此，例如，“体细胞”的关联包括这些细胞的复数形式，“卵母细胞”的关联是指对一个或多个卵母细胞的关联，等等。除了另外定义，这里使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员所一般理解的意义相同。尽管任何与这里描述的相似或相当的材料和方法可被用于实践或试验本发明，优选的材料和方法是这里所描述的。
为了描述和公开文献中报道的方法，试剂和载体引用这里提及的所有发表物，而且这些方法，试剂和载体可能做和本发明相关的使用。这里的一切不应被理解为许可由于以前发明的此前这样的公开而不命名本发明。
本发明提供用核转移或核移植克隆哺乳动物的改良方法。在所属的申请中，短语“核转移”或者“核移植”替换使用；但是这里使用的这些短语指全部互补的核DNA从一个细胞导入另一个去核的细胞。
在优选的方法中第一步包括从合适动物分离受体卵母细胞。在这点上，卵母细胞可以取自任何动物来源和任何成熟阶段。
合适的哺乳动物来源包括以下目成员灵长目，啮齿目，兔形目(Lagomorpha)，鲸目(Cetacea)，食肉目(Camivora)，奇蹄目(Perissodactyla)和偶蹄目(Artiodactyla)。由于它们相似的生物学和经济的重要性尤其优选奇蹄动物和偶蹄动物目的成员。
例如，偶蹄动物包括大约150种生物种属其分为9个家族猪(猪科)，野猪(peccaries)(Tayassuidae)，河马(河马科(Hippopotamidae))，骆驼(骆驼科)，麋香鹿(Chevrotains)(鼷鹿科(Tragulidae))，长颈鹿和霍加皮(Okapi)(长颈鹿科)，鹿(鹿科)，叉角羚(Pronghorn)(Antilocapridae)，和家养牲畜，绵羊，山羊和羚羊(牛科)。在许多国家很多这些动物被作为饲养动物。更重要的是，就本发明而言，许多很经济重要的动物如山羊，绵羊，牛和猪有相似的生物学性质并且有高度的基因同源性。
奇蹄目包括马和驴，其都是很经济重要的动物并且相似。实际上，马和驴的杂交繁育为人熟知。
在一个实施方案中，可以从有蹄动物获得卵母细胞，具体地，牛科，羊科，鹿科，猪科，马科，和骆驼科。这些代表的例子是母牛或公牛，野牛，水牛，绵羊，大角绵羊，马，小马，驴，骡，鹿，麋鹿，驯鹿，山羊，水牛，骆驼，美洲驼，羊驼，和猪。在牛科属中尤其优选的是Bos taurus，Bosindicus和Bos水母牛或公牛。
分离卵母细胞的方法在本领域内已熟知。例如，通过本领域熟知的输卵管回收方法或经阴道的卵母细胞回收方法可以从活体动物的或者输卵管和/或卵巢分离卵母细胞。见，例如，Pieterse etal.，1988，″Aspiration of bovineoocytes during transvaginal ultrasound scanning of the ovaries，″Theriogenology30751-762。而且，可以从死亡动物的卵巢或输卵管分离卵母细胞。例如，可以从屠宰场获得卵巢并从这些卵巢中吸出卵母细胞。也可以从刚刚处死的动物卵巢分离卵母细胞或者当卵巢已被冰冻和/或溶解时分离卵母细胞。
简言之，在一优选实施方案中，用抽吸法从哺乳动物卵巢中收集未成熟(前期I)的卵母细胞。为使诸如基因工程，核转移和克隆等技术成功应用，一旦这些卵母细胞被收集就必须在其被用作核转移受体细胞之前将其在体外培养成熟。
已经有报道在去核和核转移时卵母细胞的成熟阶段对核转移方法的成功是非常重要的。(见，例如Prather etal.，Differentiation，48，1-8，1991)。总而言之，成功的哺乳动物胚胎克隆方法使用中期II卵母细胞作为受体卵母细胞，因为认为在此阶段卵母细胞可以被或是充分激活以接纳导入的细胞核如同接纳受精的精子。
卵母细胞的体外成熟通常发生在成熟培养基中直至卵母细胞已经排出第一个极体，或直至卵母细胞已经达到中期II。家养动物，尤其是牛，卵母细胞成熟期一般在抽吸后大约16-52小时，优选大约28-42小时，更优选大约18-24小时。为了本发明的目的，将此时间段称作“成熟期”。
可以用本领域普通技术人员熟知的多种方法和多种培养基使卵母细胞成熟。见，例如，对牛类见U.S.Pat.No.5,057,420；Saito et al.，1992，Roux′sArch.Dev.Biol，201134-141；和对羊类见Wells et al.1997，Biol.Repr.，57385-393和WO97/07668，题为″Unactivated Oocytes as CytoplastRecipients for Nuclear Transfer，″，将所有这些以其全文引入以作参考，包括所有数字，表格和图。
用作卵母细胞收集和成熟的最普通培养基之一是组织培养基-199(TCM-199)，并添加1-20％血清包括胎牛血清(FCS)，新生血清，动情期或非动情期母牛血清，小羊血清或食用牛血清。
本申请的实施例1显示了优选的维持培养基的一个例子有Earl盐的TCM-199添加15％母牛血清并且包括10IU/ml的孕马(Mare)血清促性腺激素和5IU/ml人绒毛膜促性腺激素(SuigonanRVet，Intervet，Australia)。在5％CO2，39℃环境中用此类培养基可以成功地使卵母细胞成熟。
本领域的技术人员应该理解新鲜分离的和成熟的卵母细胞是优选的，也应理解在将卵母细胞收集或成熟后冷藏是可能的。因此，这里使用的短语“冷藏”指将本发明的卵母细胞，胞质体，细胞，胚胎，或动物冷冻。本发明的卵母细胞，胞质体，细胞，胚胎，或动物的某些部分冷冻于优选低于0℃，更优选低于-80℃，和最优选低于-196℃。可以将本发明的卵母细胞，细胞，胚胎冷藏保存无限长时间。众所周知生物物质可以冷藏50年以上。例如，可以将冷藏50年以上的精液用于母牛的人工授精。冷藏的方法和工具是本领域技术人员熟知的。见，例如，U.S.Pat.No.5,160,312，题为“Cryopreservation Process for Direct Transfer of Embryos.”。
如果使用冷藏的卵母细胞，那么必须在将卵母细胞放入成熟培养基中之前将其初步溶解。溶解冷藏物质以使其在溶解过程后激活的方法是本领域一般技术人员熟知的。
在更进一步的优选实施方案中，在这里公开的核转移方法中收集并使用已经在体内成熟的成熟(中期II)卵母细胞。基本上，在进入动情期或者注射人绒毛膜促性腺激素(hcG)或相似激素后35-48小时从未排卵或排卵的哺乳动物手术收集成熟的中期II卵母细胞。
可以在体外培养卵母细胞处将可能已经积聚的卵丘细胞去除以提供对去核而言成熟阶段更合适的卵母细胞。例如，可以在存在0.5％透明质酸酶的情况下，通过吸管吸取或涡旋将卵丘细胞去除。
在如上描述的成熟阶段之后可以将透明带从卵母细胞上去除；但是，在一个具体的优选实施方案中，去除透明带之前，将卵母细胞放于含200μg/ml植物凝血素(PHA)的磷酸盐缓冲液中使极体(PB)附着于卵母细胞。已有报道显示90％以上的情况是含有中期板的染色体邻近PB(Peura et al，1998)。在透明带去除和卵母细胞二等分之后，可以容易地鉴别出并弃去核体(karyplast)(含有细胞核的半个卵母细胞)。
去除透明带的优点包括提供更简单，更快和更廉价的核转移方法。此外，透明带的去除允许核转移胚胎的大规模生产。从卵母细胞上去除透明带可以通过任何本领域已知的方法完成，包括物理操作(机械打开)，化学处理或酶消化(Wells andPowell，2000)。物理操作可包括使用超微吸管或显微外科刀片。优选地，使用酶消化。
在一个具体优选的实施方案中，透明带在存在蛋白酶或链霉蛋白酶的情况下被去除。简言之，将成熟的卵母细胞放于含有蛋白酶，链霉蛋白酶或两者都有的溶液中，每种酶终浓度为0.1％-0.5％，更优选0.25％-2％且最优选约0.5％。然后允许将成熟的卵母细胞在30℃至约45℃，优选大约39℃保温1到30分钟。优选地将卵母细胞暴露于酶约5分钟。尽管链霉蛋白酶对卵母细胞膜可能有害，但是这种作用可通过加入血清如FCS或母牛血清而降至最低。用链霉蛋白酶去除透明带的唯一优点是不需单个处理，可以将成百的卵母细胞一同进行此步骤。一旦透明带被去除可以将无透明带的成熟卵母细胞在4ml Hepes缓冲的添加了20％FCS和10μg/ml细胞松弛素B的TCM-199培养基中洗涤，然后去核。
在这里将短语“去核”，“去核的”和“去核的卵母细胞”替换使用，并且是指已有部分内含物被去掉的卵母细胞。
可以通过实际去除细胞核，前核或中期板(根据卵母细胞情况)物理性地完成卵母细胞的去核，或者功能性地去核，例如通过使用紫外线或其它去核因素。所有这些方法是本领域一般技术人员熟知的。例如，物理方法包括抽吸(Smith & Wilmut，Biol.Reprod.，401027-1035(1989))，功能性方法包括使用DNA-特异的荧光染料(见，例如Tusnoda etal.，J.Reprod.Fertil.82173(1988))，和紫外线照射(见，例如Gurdon，Q.J.Microsc.Soc.，101299-311(1960))。也可以用其它本领域已知的方法去核。见，例如U.S.Pat.No.4,994,384；U.S.Pat.No.5,057,420；and Willadsen，1986，Nature 32063-65，这里将所有这些引入以作参考。
优选地，通过人工二等分将卵母细胞去核。可以用任何本领域技术人员已知的方法完成卵母细胞二等分。在一个优选的实施方案中，如WO98/29532描述的使用显微外科刀片完成二等分，在此将其引入作为参考。简言之，用非常锋利的splitting刀片(AB Technology，Pullman，WA，USA)将卵母细胞不对称分成大约30％和70％总卵母细胞体积的部分。然后可以将卵母细胞筛查以鉴定出成功去核者。筛查可以通过选择那些被分成半个并附着有极体者或者用1μg/μl溶解于添加20％FCS的TCM-199中的Hoechst荧光染料33342将卵母细胞染色，然后在倒置显微镜下于紫外光下观察，此观察要短于10秒。然后将成功去核的卵母细胞(半(demi)-卵母细胞)放于合适的培养基中，例如，添加了20％FCS的TCM-199。
在本发明中，优选将受体卵母细胞从体外成熟后10小时到约40小时的时间范围内去核，更优选从体外成熟后16小时到约24小时，且最优选体外成熟后约16-20小时。
这里描述的二等分技术比其它去核方法需要更少的时间和技术并且随后用染色筛选有高度精确性。因而，为克隆技术的大规模应用，本二等分技术比其它技术更有效。
然后可以通过融合将源自与去核卵母细胞相同种属的单个哺乳动物体细胞转移入去核的卵母细胞以产生重组细胞。
这里使用的短语“体细胞”意思是除了胚胎细胞或生殖细胞以外，任何发育阶段动物的任何细胞。
按照本发明，将源于已分化的胎儿或成年体细胞的细胞核转移入与核供体相同种属的无透明带，去核的卵母细胞。分化的体细胞是早期胚胎阶段之后的细胞。更具体地，分化的细胞是至少过了胚盘阶段(牛胚胎发育10天)的细胞。分化的细胞可以来源于外胚层，中胚层和内胚层。
可以用熟知的方法获得哺乳动物体细胞。见，例如，讲述了从分化的供体体细胞向去核卵母细胞的核转移的U.S.Pat.No.5,945,577，和讲述了在核转移过程中使用源于成年耳道的培养的成纤维细胞作为核供体的U.S.Pat.No.6,022,197，在此将这两篇文献引入以作参考。
优选在融合于无透明带去核的受体卵母细胞之前将本发明的供体体细胞诱导至休眠。按照转让给Roslin Institute(Edinburgh)的PCT/GB96/02099和WO97/07668所述，优选在转移时供体细胞核处于细胞周期的或者G0期或者G1期。为了维持重组细胞的正确倍体数在转移时供体必须是二倍体。
在本发明中有用的哺乳动物体细胞包括，例如，上皮细胞，神经细胞，表皮细胞，角质细胞，造血细胞，黑素细胞，软骨细胞，淋巴细胞(B和T淋巴细胞)，红细胞，巨噬细胞，单核细胞，单核的细胞，成纤维细胞，心肌细胞，和其它肌细胞，等等。
而且，用于核转移的哺乳动物细胞可从不同器官获得，例如，皮肤，肺脏，胰腺，肝脏，胃，肠，心脏，生殖器官，膀胱，肾脏，尿道和其它泌尿器官，等等。这些仅仅是合适的供体细胞的例子。合适的供体细胞，即，在本发明中有用的细胞可以从身体的任何细胞或器官获得。
一个具体的优选供体细胞是成纤维细胞或成纤维样细胞。成纤维细胞是理想的细胞类型因为其可从发育中的胎儿和成年动物大量获得。
重要的是，这些细胞有快的倍增时间在体外容易繁殖，并且用在基因靶向方法时可以克隆繁殖。
可以从耳部皮肤标本收集成纤维细胞，并剪成小块(3mm2)培养。本领域有许多方法培养细胞。见，例如Culture of Animal Cells；A manual of BasicTechnique(2nd.edition)，Freshney，copyright 1987，Alan R.Liss，Inc.，New York.在一具体的优选实施方案中将从皮肤标本移植出的细胞培养在添加了20％FCS和抗生素的TCM-199培养基中，保持37℃，5％CO2和95％空气的湿润气体。培养一周后，在组织移植物周围形成成纤维细胞单层。然后去除移植物开始重新培养并用0.05％胰蛋白酶保温5分钟收获成纤维细胞。然后加入800μl的TCM199培养基和20％FCS灭活胰蛋白酶。为长期贮存，可以将培养的细胞在胰蛋白酶处理后收集，冻于10％二甲基亚砜并贮存于液氮中。用作核转移时，将细胞融化并培养至汇合时传代。每代细胞(估计每代2次细胞倍增)培养至汇合，用0.1％(w/v)胰蛋白酶和EDTA溶液在37℃保温1分钟使之解聚，并分至三个新培养瓶作进一步传代。一般每代持续约6天。
可以用直接抗细胞骨架纤维波形蛋白(filaments vimentin)(针对成纤维细胞)或角质蛋白(针对上皮细胞)的单克隆抗体进行免疫细胞化学染色确认供体细胞的成纤维细胞表型。在优选的确认方案中，细胞生长至汇合。然后将细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤并用甲醇4℃固定20分钟。固定后将细胞用PBS洗涤并用溶解于PBS的3％牛血清白蛋白于37℃封闭15分钟。弃去封闭液并加入100μl或者1∶40稀释的抗波形蛋白克隆V9(Sigma，cat#；6630)或者1∶40稀释的抗pan角质蛋白克隆11(Sigma，cat#；2931)。将细胞于37℃保温1小时，用PBS洗涤并用1∶300稀释的FITC标记的抗小鼠IgG100μl保温1小时。将细胞用PBS洗涤，用50％甘油PBS封片并在荧光显微镜下观察。应当包括合适的自发荧光和二抗对照。
可以用Kubota etal.，PNAS 97990-995(2000)描述的进行细胞周期的分析。简言之，将不同代数的细胞培养至汇合。胰蛋白酶消化后，将细胞用加有10％FCS的TCM-199培养基洗涤并在4℃用1ml含有葡萄糖(6.1mM)的PBS重悬成5×105细胞/ml。加入3ml冰冷的甲醇将细胞固定过夜。为细胞核染色，然后将细胞沉淀，用PBS洗涤并重悬于含有30g/ml碘化丙啶和0.3mg/ml RNase A的PBS中。在用30μm滤网过滤前允许细胞室温下黑暗中保温1小时。然后分析细胞。
为检测不同代数培养的供体体细胞的倍体数，可以用标准的中期spread制备技术培养在不同培养代数时判定染色体数目(见，例如，Kubota etal.，PNAS 97990-995(2000))。
培养的供体细胞也可以用本领域普通技术人员熟知的转基因方法进行遗传修饰。见，例如，Molecular Cloning a Laboratory Manual，2nd Ed.，1989，Sambrook，Fritsch and Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory Press；U.S.Pat.No.5,612,205；U.S.Pat.No.5,633,067；EPO 264 166，题为″TransgenicAnimals Secreting Desired Proteins IntoMilk″；WO94/19935，题为″Isolation ofComponents of Interest From Milk″；WO93/22432，题为″Method forIdentifying Transgenic Pre-implantation Embryos″；和WO95/175085，题为″Transgenic Production of Antibodies in Milk，″将所有这些以其全部包括数字，图和表在此引入以作参考。任何已知的插入，删除或修改哺乳动物细胞目的基因的方法可以被用于改变用作核供体的已分化细胞。这些方法可以去除某基因的全部或部分，并且此基因可以是异源的。包括同源重组技术其允许在细胞基因组的一个或多个特定位点插入，删除或修饰一个或多个基因。
用删除，插入，和/或突变修饰靶DNA基因组的例子是逆转录病毒插入，人工染色体技术，基因插入，用组织特异启动子的随机插入，基因靶向，转座元件和/或任何其它导入外源DNA或产生修饰的DNA/修饰的细胞核DNA的方法。其它修饰技术包括从基因组删除DNA序列和/或修饰细胞核DNA序列。例如，可以直接定位突变改变细胞核DNA序列。
因此可以用本发明提供有目的基因表型的成年哺乳动物。繁殖有证实的基因优势或其它目的特征的成年有蹄动物是非常有用的，包括转基因的或基因工程的动物，和嵌合体动物。而且，核转移胎儿的细胞和组织，包括转基因的和/或嵌合体胎儿，可被用于细胞，组织和器官移植。
生产转基因细胞的方法一般包括以下步骤(1)制备合适的DNA构建体其对将特异的DNA插入细胞核基因组是有用的；(2)用DNA构建体转染细胞；(3)允许随机插入和/或同源重组发生。此过程导致的修饰可以是合适的DNA构建体插入靶基因组；从靶基因组删除DNA；和/或靶基因组突变。
DNA构建体可包括目的基因和许多元件其包括调节启动子，绝缘子(insulator)，增强子，和阻遏物以及使核糖体结合于从DNA构建体转录的RNA上的元件。
DNA构建体也可以编码核酶和反义DNA和/或RNA。这些例子对本领域普通技术人员是熟知的并且不意味局限于此。
由于可得的有效重组DNA技术结合调控元件DNA序列和容易在碱基数据库中得到的基因以及商业载体(sector)，用这里描述的材料和方法本领域的普通技术人员可以容易地生产出适于建立转基因细胞的DNA构建体。
转染技术对本领域的普通技术人员是熟知的并且进行DNA构建体转染入细胞的材料和方法可由商业性获得。一般用DNA构建体转染细胞使用的材料是亲脂性化合物，例如LipofectinTM。可以诱导特殊的亲脂性化合物形成脂质体以介导DNA构建体转染入细胞。
通过合理设计DNA构建体可以将DNA构建体上的靶序列插入核基因组的特定区域。这些设计技术和方法是本领域普通技术人员熟知的。见，例如，U.S.Pat.No.5,633,067；U.S.Pat.No.5,612,205和WO93/22432，将所有这些以其全文引入以作参考。一旦目的DNA序列被插入核基因组，目的DNA序列插入核基因组的插入区域位置和频率用本领域技术人员熟知的方法鉴定。
一旦将转基因插入供体体细胞的核基因组，象本发明的其它供体体细胞一样，该细胞可被用作这里公开的核转移方法的核供体。将体细胞核转移至无透明带去核的卵母细胞的方法优选包括细胞融合形成重组细胞。
一般使用穿过接触/融合平面的直流(DC)电脉冲诱导融合，但是可以使用额外的交流电流(AC)帮助供体细胞和受体细胞排列成线。电融合产生电脉冲足以使质膜短暂破坏并且足够短以使膜快速再形成。因此，如果两个比邻膜被诱导破坏并且相互再形成脂质双层，那么在两个细胞间会有小通道开放。由于这样的小开口热动力学不稳定，它将扩大直至两个细胞成为一个。此方法的进一步讨论参考U.S.Pat.No.4,997,384 Prather etal.(在此以其全部引入作为参考)。可以使用许多电融合介质，包括例如，蔗糖，甘露醇，山梨醇和磷酸盐缓冲液。
也可以用仙台病毒作为融合剂完成融合(Graham，Wister Inot.Symp.Monogr.，9，19，1969)。也可以将细胞暴露于促融合化学物质如聚乙二醇诱导融合。
优选地，将供体体细胞和无透明带，去核的卵母细胞放于500μm融合室中并用4ml 26℃-27℃的融合介质覆盖(0.3M甘露醇，0.1mM MgSO4，0.05mM CaCl2)。然后细胞的电融合使用持续约15μs的70-100V双DC电脉冲，两者间隔约1s。融合后，将产生的融合的重组细胞放于合适的培养基中直至激活，例如，TCM-199培养基。
在优选的细胞融合方法中首先将供体体细胞附着于无透明带去核的卵母细胞。例如，挑选化合物能使体细胞附着于无透明带去核的卵母细胞以使体细胞和无透明带去核的卵母细胞膜融合。该化合物可以是任何能聚集细胞的化合物。化合物可以是能结合或聚集碳水化合物的蛋白质或糖蛋白。更优选地化合物是植物凝集素。植物凝集素可以选自伴刀豆球蛋白A，刀豆球蛋白A，蓖麻蛋白，大豆凝集素，莲子凝集素和植物凝血素(phytohemaglutinin)(PHA)。优选地化合物是PHA。
优选地在与体细胞接触前将无透明带的去核卵母细胞暴露于PHA。优选地将无透明带的去核卵母细胞暴露于浓度为50-400μg/ml的PHA。最优选地浓度是约200μg/ml。可以将无透明带的去核卵母细胞暴露于PHA 1-60s。最优选地将去核卵母细胞暴露于PHA 3s。
用PHA处理后，可以将无透明带的去核卵母细胞与体细胞接触使该体细胞附着于无透明带的去核卵母细胞。可以用本领域技术人员熟知的传统方法使无透明带的去核卵母细胞与体细胞接触。优选使用微吸管操作使无透明带的去核卵母细胞与体细胞接触。然后可以按照上述方法使无透明带的去核卵母细胞与附着的体细胞融合。
在一个优选实施方案中，上述的电融合方法也包括进一步融合步骤，或者上述融合步骤包括一个供体体细胞和两或多个无透明带的去核卵母细胞。双融合方法的优点是增加重组细胞的胞质体积。
在细胞核供体与受体卵母细胞融合前，融合时，和/或融合后一般用电的和/或非电方式将重组细胞激活(见，例如，Susko-Parrish etal.，U.S.Pat.No.5,496,720)。激活的方法包括1).电脉冲；2).化学诱导休克；3).精子穿透；4).通过向卵母细胞胞质导入二价阳离子增加卵母细胞内二价阳离子水平，例如，镁，锶，钡，钙，例如，以离子载体形式。增加二价阳离子水平的其它方法包括使用电休克，乙醇处理和caged螯合剂处理；和5).用已知方法降低卵母细胞内蛋白质的磷酸化，例如，通过加入激酶抑制剂，如丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂例如6-二甲基氨基嘌呤，staurosporine，2-氨基嘌呤，鞘氨醇。或者，抑制胞内蛋白质磷酸化可以通过向卵母细胞中导入磷脂酶例如磷脂酶2A和磷脂酶2B。
可以用已知方法激活重组细胞。这些方法包括例如，在低于生理温度培养重组细胞，实质上是向重组细胞使用冷刺激或低温休克。在室温培养重组细胞可以最方便地实现此方法，室温相对于胚胎暴露的正常生理温度状况是冷的。合适的卵母细胞激活方法是U.S.Pat.No.5,496,720Susko-Parrish etal的主题，这里将其全部引入作为参考。
然后可以将激活的卵母细胞培养于适合的体外培养基直至产生多细胞或细胞集落。适合于胚胎培养和成熟的培养基是本领域熟知的。可以用于牛胚胎培养和维持的已知培养基的例子包括添加10％FCS的Ham′s F-10，添加10％FCS的TCM-199，泰洛白蛋白-乳酸-丙酮酸盐(Tyrodes-Albumin-Lactate-Pyruvate)(TALP)，Dulbecco′s磷酸盐缓冲液(PBS)，合成的输卵管液(″SOF″)，B2，CRlaa培养基和高钾单纯(Simplex)培养基(″KSOM″)，Eagle′s和Whitten′s培养基。用于收集和成熟卵母细胞最普通培养基之一的是TCM-199，和1-20％添加血清包括FCS，新生血清，动情期母牛血清，小羊血清或食用牛(Steer)血清。优选的维持培养基包括TCM-199其含有Earl盐，10％FSC，0.2mM丙酮酸钠和50μg/ml硫酸庆大霉素。上述任何一种也可以用来与多种细胞类型例如颗粒细胞，输卵管细胞，BRL细胞和子宫细胞及STO细胞共培养。
或者，在一优选实施方案中，提供培养重组细胞(胚胎)方法其包括(i)在适合形成重组细胞的条件下向无透明带，去核的哺乳动物卵母细胞中插入目的体细胞或细胞核；(ii)激活重组细胞；(iii)保温和培养一个或多个该细胞直至胚胎大于二细胞发育阶段。
优选地，将胚胎培养至大于60个细胞。更优选地，在60至200个细胞之间。
简言之，将上述方法描述为Well of Well(WOW)系统。此方法包括在用“织补”型针(例如由BLS Ltd.，Budapest，Hungary制造并提供的“Aggregationneedles”，Catalogue no.DN09)ground尖端压入培养皿底部形成的小凹中(“V”或“U”型)或者单个或者群体培养重组细胞，一般使用4孔“Nunclone”培养皿(Vajta etal，2000.)。
这些小凹(WOWs)一般深0.5-2mm并且顶端直径0.5-2mm。激活后将胚胎置于这些WOW小凹(depression)中，或者单个或者2或3个“重组的”核转移胚胎一起放于每个WOW中并且激活(当它们在细胞分裂前仍是单个细胞时)后以聚集体培养。或者将重组的单个细胞核转移胚胎在WOWs中单个培养3-4天(一般在8-128细胞之间)，然后将2-3个这样的胚胎联合置于每个孔中作为“聚集体”继续培养。以这种聚集体培养核转移胚胎增加了要转移的最终胚胎细胞数并增加了受孕率(Peura et al，1998)。
在进一步实施方案中，提供培养重组细胞(胚胎)的方法其包括提供在培养基中按照这里前述方法的重组细胞(胚胎)；获得至少两端开放的管子并且其一端能够接受重组细胞(胚胎)，管子直径能够允许吸取并维持管内培养基中的重组细胞(胚胎)；将重组细胞(胚胎)吸至管中；和在管中保温并培养重组细胞(胚胎)。
在管中培养的方法里，优选管是对胚胎最低毒性级别的。最优选地，它是未包被或处理过的，酸洗涤的硼硅酸盐实验室级玻璃。最重要的是，管子必须具有吸纳能力因此在管中胚胎周围的培养基通过毛细作用和表面张力被吸住以维持管中的胚胎。从管的任何一端空气/培养基交界面处保护(cushion)管中的培养基，偶尔用一个小的油栓。
培养系统的管子可以是任何所提供直径者其能吸纳并维持管内培养基中胚胎因此胚胎可以在吸引的培养基中发育。因此，管子必须能提供对培养基充足的毛细作用和表面张力以维持管子内垂直的培养基并且也向管子上方吸引胚胎。优选地，管子内径200-250mm。管子可以是毛细管。更窄范围内径可以按照200mm或胚胎体积为限制因素的更小直径。更窄范围如200mm或以下可能对发育的完全启动是有益的。
可以在被动毛细作用下或者通过在管上端吸取液体产生主动压力将胚胎吸入或放入管中。可以使用第二种方法提供管子足够的维持和吸住管中培养基和胚胎的能力。
一旦胚胎被吸入管中，优选将管子保持垂直而不是水平以至于在空气/培养基交界面产生保护。尽管垂直方向是最优选的，也可以使用水平保温。
设计培养管系统以使其含有的胚胎可以向发育的更高阶段发育，优选向成熟的囊胚泡阶段。但是，观察直接在管中的胚胎发育后可以选择例如早期卵裂或桑椹胚阶段。依据所需发育阶段胚胎可以在任何时间除去。这有许多优点因为一旦在培养系统中胚胎被容纳并成熟，能立即在发育的最适阶段用最小限度操作将其植入动物。
之后，优选将培养的重组细胞洗涤并且然后置于合适的培养介质，例如在孔板中含10％FCS的TCM-199培养基其优选含有合适的融合营养层。合适的饲养层包括，例如，成纤维细胞和上皮细胞，例如。源自有蹄动物的成纤维细胞和子宫上皮细胞，小鸡成纤维细胞，鼠的(例如小鼠或大鼠)成纤维细胞，STO和SI-m220饲养细胞系，和BRL细胞。
在一实施方案中，饲养细胞包括小鼠胚胎成纤维细胞。制备合适的成纤维细胞饲养层是本领域熟知的。
将重组细胞培养在饲养层上直至重组细胞达到适合转移给雌性受体的大小时，或适合获取细胞其可用于生产细胞或细胞克隆时。优选地，将这些重组细胞培养至至少约50个细胞。在合适条件下培养将是有效的，即，约39℃，和5％CO2，为了最佳生长一般约每隔2-5天更换培养基，优选约每隔3天。
在本发明中胚胎转移和受体动物管理的方法是在胚胎转移工业上使用的标准程序。同步转移对本发明成功是重要的，即，核转移胚胎的阶段与雌性受体的动情周期同步。其优点和如何维持受体参见Siedel，G.E.，Jr.(11Critical review of embryo transfer procedures withcattle″in Fertilization andEmbryonic Development in Vitro(1981)L.Mastroianni，Jr.and J.D.Biggers，ed.，Plenum Press，New York，N.Y.，page 323)，在此将这些内容引入作为参考。
简言之，可以将囊胚泡用非外科或外科的方法转移入同步的受体子宫中。用本领域普通技术人员熟知的技术和介质也可应用其它培养基。在一方法中，于5％2，5％O2和90％N2，39℃下，将克隆的胚胎用新鲜的KSOM洗涤并培养在含0.1％BSA的KSOM中4天，随后用1％BSA再培养3天。用本领域已知的标准方法检测胚胎的发育并分级。在第2天记录卵裂率并且将卵裂的胚胎继续培养7天。在第7天，记录囊胚泡(blastcyst)发育并且将一或两个胚胎，在胚胎和/或动物的有效性期(pending availability)内，非外科方法转移入每个同步化的寄养母体子宫内。
优选定期如妊娠40，60，90，和120天用直肠触诊或超声波检查寄养母体怀孕状况。优选在妊娠全程仔细观察并连续超声监测(每月)以估计在妊娠的许多阶段的胚胎流产。如果可能，应该收集任何流产的胎儿，做DNA分型以确定克隆状态及常规病理检查。
在此方法各步中产生的重组细胞，激活的重组细胞或胚胎，胎儿和动物，和从其收获的细胞，细胞核，和其它细胞成分也按本发明实施方案确认。
本发明也可用于生产胚胎，胎儿或例如，在细胞，组织和器官移植中可被使用的后代。通过从动物上取得胎儿或成年细胞并将其用于克隆方法可以当其经历器官发育过程时从克隆的胎儿获得大量细胞，组织和可能的器官。也可以从克隆的后代分离细胞，组织和器官。此方法可提供许多医疗和兽医治疗包括细胞和基因治疗的“物质”资源。如果将这些细胞转移回其来源的动物，那么可避免免疫排斥。而且，因为可以从这些克隆分离出许多细胞类型，可以使用其它方法学例如造血嵌合状态来避免在同种动物之间以及种属之间产生免疫排斥。
本说明书的全部描述和全部权利要求书中，词语“包括”和该词的变体例如″comprising″and comprises″，不打算排除其它添加物，成分，integers或步骤。
仅仅为提供本发明来龙去脉的目的将对前面背景资料，做法，装置等等的讨论包括在本说明书内。这不意味或代表任何或全部这些资料形成前面背景基础的一部分或者是本发明相关领域一般常识知识，因为在本申请提交日之前它已在澳大利亚存在。
现在仅用参考下面非限制性的实施例的方式进一步描述本发明。但是应当理解，下面的实施例仅仅是作为例证的，不应以任何方式当作对上述本发明总体的限制。例如，尽管大量关于牛卵母细胞和颗粒细胞(granulosa)的实施例，但是应当理解，如这里公开的本发明也可应用于其它动物卵母细胞，包括例如，绵羊，山羊和马。
实施例1用颗粒细胞作为供体的核转移方法除非另有说明所有化学品购自Sigma Chemical Co.(St Louis，MO，USA)。
以最少修改按照以前(Vajta etal.，1996)详细描述的进行牛卵母细胞(每天共150个)的体外成熟。简言之，将卵母细胞从屠宰场来源的卵巢中抽吸出来，在4孔培养皿(Nunc，Roskilde，Denmark)中成熟24小时，用添加了15％母牛血清，10IU/ml孕马血清促性腺激素和5IU/ml人绒毛膜促性腺激素(SuigonanRVet，Intervet，Australia)的碳酸氢盐缓冲的TCM-199培养基(GibcoBRL，Paisley，UK)并且在39℃，含5％CO2的湿润空气中用矿物油保温。
成熟过程开始后19小时时用涡旋去除卵丘细胞。从此时起(除非额外说明)所有操作在调至39℃的热平台(heat stage)上进行。根据第一极体的存在挑选成熟的卵母细胞(约110个)，放于0.5％链霉蛋白酶(Sigma蛋白酶)溶液中5分钟从细胞去除透明带。将无透明带的卵母细胞(大约50-60个，总数的一半)排列于35mm培养皿中(Falcon，Becton Dickinson Labware，Franklin Lakes，NJ，USA)其内装有4ml添加了20％FCS和10μg/ml细胞松弛素B的Hepes缓冲的TCM-199培养基(TCMH)(参见
图1A)。
在立体显微镜控制下用Ultra sharp Splitting Blades(AB Technology，Pullman，WA，USA)人工进行二等分(参见
图1B)。然后在培养皿中间旋动收集二等分的卵母细胞(半-卵母细胞)，并置于无细胞松弛素的同样培养基中，将其它卵母细胞重复此步骤。
完成二等分后，将所有的半卵母细胞用溶解于TCMH和30％FCS的荧光染料Hoechst 33342染色，然后置于在60mm Falcon培养皿底部3μl滴同样的培养基中并用油覆盖(每滴3个半卵母细胞，共约70滴)。在倒置显微镜和紫外照明下检查后，在描述的用于成熟和保温至融合的条件下挑选无染色质染色(胞质体)的半卵母细胞，并在立体显微镜下(共约100-120)收集在原始成熟培养皿的一孔中者。
从早于成熟7-10天使用的4孔培养板中形成的颗粒细胞单层制备体细胞。用100μl 0.05％胰蛋白酶保温5分钟后，向孔中加入800μl的TCMH和20％FCS，用力吹打(pipetting)分离细胞并用1.5ml Eppendorf管贮存于4℃直至融合。
在成熟开始后21-22小时进行融合。对于第一次融合，将15个去核的卵母细胞转移至含2％FCS的TCMH中。将5μl颗粒细胞悬液沉淀于装有无血清TCMH的4孔培养皿的底部中间部位。将用细吸口的玻璃吸管吸取的去核卵母细胞单个暴露于200μg/ml PHA(ICN Pharmaceuticals，Australia)3秒，然后迅速滴在沉降在培养皿底部的单个颗粒细胞上(参见
图1C和1D)。附着后将去核的卵母细胞颗粒细胞对再次拿起，并转移至覆盖了4ml26-27℃融合培养基(0.3M甘露醇，0.1mM MgS04，，0.05mM CaCl2)的融合槽内。融合室内装有直径1mm间隔0.8mm的平行铂丝。使用15V交流电流(AC)和700KHz(Genaust Electrofusion Machine，Australia)。将细胞对(pair)附着于一根电线(体细胞远离电线-参见
图1E)然后用85V的双DC脉冲，每次20μs，间隔0.1s融合。然后当评价融合时，将细胞对小心地移出并在含20％FCS的TCM-199中保温15-30分钟。全部15个去核卵母细胞与颗粒细胞融合后，更换融合培养基，并且为新一轮第一次融合制备新的去核卵母细胞和颗粒细胞。
对第二次融合，首先将未融合的去核卵母细胞和融合的细胞对(重组细胞)(各5-10个)在融合培养基中保温1-2分钟，然后用同样的AC脉冲成对排列，未融合的去核卵母细胞附着电线(参见
图1F)。用同样参数的双融合脉冲，但是使用45V DC，然后将两个去核卵母细胞和颗粒细胞的三体在TCMH和20％FCS中保温20分钟。然后将融合的重组细胞(共约40-45个)转移至成熟培养皿的孔中并进一步在上述条件下保温(Vajta etal.，2002)。
在成熟开始(大约融合后3小时)后24-26小时开始激活。首先将重组细胞在含10μM钙ionophoreA23187的TCMH于空气中5分钟，然后在2mM6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)中于5％CO2的空气中保温5小时。其中6-DMAP溶解于碳酸氢盐缓冲的添加10％FCS的TCM-199中。
然后将胚胎用添加5％母牛血清的SOFaaci培养基(Holm etal.，1999)400μl反复洗涤并用矿物油覆盖，之后随机分成三组，每组保持在相同的培养基中。将第一组单个培养在覆盖有矿物油的1μl滴中。将第二组的胚胎置于wells的孔中(WOWs；Vajta etal.，2000)。将第三组单个装入2μl Drummond显微毛细管中(Thouas etal.，2001)。所有培养在39℃，5％CO2和90％N2(湿润的空气中)进行。
重组2和7天后，在立体显微镜下分别评价每个胚胎的卵裂和囊胚泡率。
图1(G)显示融合后在GO系统中发育7天的囊胚泡。
图1(H)显示离开GO系统后的同一囊胚泡。将一些囊胚泡固定用于将来免疫组织化学和超微结构研究；将其它的玻璃化用于将来胚胎转移实验。
卵裂和囊胚泡率的统计学分析用Pearson Chi-square方法进行，p＞0.05认为是有意义的。
实施例2用颗粒细胞作为供体的核转移的结果使用了共1016个未成熟卵细胞的7次重复核转移实验主要步骤的平均效率和大约时间总结于表1表1无透明带体细胞核转移步骤的平均效率和大约需要时间方法 单个效率累计效率 需要时间PB率判定 - - 30分钟透明带去除99％99％ 10分钟二等分89％88％ 20分钟UV观察91％80％ 30分钟第一次融合94％75％ 40分钟第二次融合91％69％ 15分钟(相关工作)- - 35分钟总计180分钟弃去无明显可见极体的卵母细胞(占总数的28％)。但是，此损失不影响核转移方法，因此在计算效率时不包括在内。在二等分时的损失是在该步完成后5分钟观察到的裂解的结果。选择去核卵母细胞的最后准确性近乎100％。但是，9％的误差多数由于计算的和获得的数目之间发生技术失误。融合中的丢失几乎全部是裂解的结果或技术失误，将不成功的融合(融合后15-20分钟细胞对分离)排除并且通常用重复融合步骤来降低。
平均地，每个实验使用105个成熟的卵母细胞并产生35个去核卵母细胞-去核卵母细胞-体细胞三聚体，而且所需工作时间不超过3小时。
在三个培养系统中完成的胚胎发育率总结于表2。除在培养在微滴中相对于WOW系统中的胚胎卵裂率(2细胞或多个)外所有值有显著性差异。
表2在不同培养组中完成的卵裂和囊胚泡率培养系统 卵裂率囊胚泡率微滴 25/41(61％)a0/41(0％)aWOW系统76/103(74％)a19/103(18％)bGO系统 47/53(89％)b10/53(36％)ca，b，c在同一列内带有不同标记的值意味着显著差异。
一般地，在微滴中培养的胚胎发育不超过8-16个细胞阶段；致密生长只发生在WOW或GO系统中。囊胚泡形成通常在重组后6天开始并在第7天完成。
在实施例中描述的双融合核转移方法的功效是可能的因为被融合的两个细胞大小相似(在我们的实验中胞质体的体积仅为原始卵母细胞的一半)，并且PHA粘附可以在相当大区域建立强的膜接触。与Peura et al.(1998)的一步(去核卵母细胞+去核卵母细胞+裂球)融合方法相比，实施例中描述的双融合方法(首先去核卵母细胞+体细胞产生重组细胞，然后第二个去核卵母细胞与重组细胞融合)更方便和有效。使用两个去核卵母细胞来重组也意味着可以完全弥补传统核转移不可避免的细胞质体积的丢失。
实施例中所描述优选方法的结果显示这些方法对细胞克隆技术的发展有重要的潜力，其满足对使这些技术在农业上大规模应用的核转移自动化的需要。特别是，体细胞核转移的简化方法大大降低了对目前使用的昂贵的和技术高难的显微操作方法的依赖。而且，这些改进已经明显缩短了进行成功核转移的全部时间。
实施例3简化的无带体细胞克隆技术除了下面的以外本实施例中使用的方法与实施例1中描述的相同。
将重组的核转移胚胎或者单个，或者2个重组的核转移胚胎作为聚集体培养，并且培养或者在玻璃毛细管中或者在4孔Nunclone培养皿的WOWs中进行。激活后将胚胎吸入玻璃管中或置于WOW小凹中，将或者单独或者2“重组的”核转移胚胎在每个玻璃毛细管中培养，或在WOW小凹中培养，并且激活后以聚集体培养。
表3，4和5显示用实施例1描述的技术生产的核转移胚胎培养和转移的囊胚泡发育率和受孕率。将重组核转移胚胎单个(表3)或以两个重组核转移胚胎为聚集体(表4和5)培养。
表3中报告的所有实验除最后一个使用胎儿成纤维细胞外均使用一周龄的颗粒细胞进行。囊胚泡率是从单个(即不是聚集体)培养的核转移胚胎发育来的。
表4显示用转基因供体细胞(用牛αS1酪蛋白基因转染)从简化的，无带核转移技术获得的囊胚泡率。将重组核转移胚胎单个或以2个为聚集体培养。或者培养在GO系统或者培养在WOW系统。忽略由于融合和激活引起的损失。在3.5小时(加上激活)内可生产20-30囊胚泡。
表5显示用转基因供体细胞(用牛αS1酪蛋白基因转染的成纤维细胞)从简化的，无带核转移技术得到的聚集核转移胚胎转移后的受孕率。2重组核转移胚胎或者单个培养或者以2个为聚集体培养，并且或者培养在玻璃毛细管(GO)或者培养在4孔Nun培养皿中的WOWs系统中(Lewis etal.，2002)。
表32001/2002获得的囊胚泡率实验日期 细胞类型 单个重组NT胚胎培养数囊胚泡数 ％囊胚泡05.12.01 颗粒细胞 44 2148％12.12.01 颗粒细胞 40 2255％13.12.01 颗粒细胞 59 3864％
14.12.01颗粒细胞 5324 45％15.12.01颗粒细胞 5423 43％25.01.02颗粒细胞 3918 47％26.01.02(IL)颗粒细胞 21943％30.01.02(IL)颗粒细胞 19947％05.02.02胎儿成纤维细胞5625 45％总计 385 189 49％表4单个重组NT胚胎培养 聚集体数 囊胚泡数％囊胚泡数18090 35 每个聚集体39％或每个单个重组NT胚胎19％表5用转基因供体细胞(用牛αS1酪蛋白基因转染)从简化的，无带核转移技术得到的受孕率新鲜的或 接受胚胎的受体数 在30-40天妊娠 超过7个月玻璃化的 (胚胎数) 的受体数(％) 继续妊娠数-新鲜的 6(19) 2(33％)1-玻璃化的5(16) 2(40％)1总计 11(35) 4(36％)2**1个在7.5个月妊娠失败(胎儿未回收)。
*1个在怀孕8个月零1周时失败。
难产-兽医助产后胎儿死亡。小牛出生体重35kg。Post-mortem at VIAS，Attwood。在P-M未检测出明显的大体(gross)异常。组织病理学上，在脑，胸腺，肺，心脏，肝，肾，骨骼肌或胎盘未发现明显损害(见VIAS报告01-005483-MW)。
实施例4在核转移胚胎转移入受体母牛后改善的植入除下述外使用的方法如实施例1所描述。
将重组的单个细胞核转移胚胎单独在WOWs中培养4天(当它们一般在30-60细胞之间时)，然后将2个这样胚胎在一孔中组合以进一步培养成“聚集体”。以这种聚集体培养核转移胚胎增加了要转移的最终胚胎细胞数并增加了受孕率(Peura etal，1998)。
将6个7天的囊胚泡转移入6个受体母牛。即，每个受体只转移入一个胚胎。在妊娠30天左右6个受体母牛中5个被诊断为怀孕(通过超声检查)。相对照，在实施例3和5中每个受体转移入多个胚胎其增加了受孕率。
实施例5融合参数和条件的优化在本实施例中，进行优化融合参数和条件的研究。
在将体细胞与2或3个胞质体融合中间作对比。激活后，将重组的核转移胚胎以单个胚胎，或以2个胚胎的聚集体培养。
本实施例中使用的方法与实施例1中使用的相同，除以下例外1.使用一步融合来融合体细胞和2个胞质体，而不是实施例1中为达到此目的使用的2步融合步骤。
将体细胞和胞质体(每个体细胞或者2个或者3个胞质体)同时融合。
使用成纤维细胞。融合所需参数按照成纤维细胞大小计算(Teissie et al.，1998)。使用0.5mm间隔的融合室或者在成纤维细胞表面使用2V(112V＝2.22kV)6μsec(Genaust Electrofusion Machine，Australia)或者在成纤维细胞表面使用3V(166.8V＝2.3kV)4μsec(BTX Electro Cell Manipulator 200，USA)。是成纤维细胞中稳定状态值的诱导电位差是较大胞质体上电位的微小一部分因此保存了胞质的活力。所有融合使用单一脉冲进行。
用微细吸管操作将一半胞质体暴露于PHA并附着于一个成纤维细胞。将成纤维细胞/胞质体对与另外一个半胞质体一起(当进行三聚体时)在电融合培养基中平衡。
2.将或者2个或者3个胞质体与体细胞融合以形成重组的核转移胚胎。
3.激活后，将核转移胚胎或者以单个胚胎或者以2个重组核转移胚胎为聚集体培养。
从共60个胚胎转移入16个接受受体(即平均每个受体转移入3.8个胚胎)得到的7个怀孕者在写此申请时有3个继续妊娠。
表6对比与体细胞融合2或3个胞质体。将单个胚胎培养在玻璃毛细管(GO系统)中。将聚集的胚胎在4孔Nunc培养皿中培养(每个WOW中2个重组的核转移胚胎)。
表6
*使用有预设值(166V，4μSec)的BTX仪器进行融合，而其它的使用GA仪器(112V，6μsec)进行。重组的表7显示转移胚胎数和受孕率。
表7转移的胚胎(源自或者单个的或者聚集的重组核转移胚胎)数
应当指出本方法需要较少时间。特别是，用优化的融合参数和条件使步骤数(SC-胞质体复合物的再检查和再融合，用另外卵母细胞的二次融合)已经被减少但不损失效率，融合过程可以在非常短时间内完成，但是去核过程仍需大约此步骤所用时间的60-70％。这将是自动化的主要目标。
预计的电压和脉冲持续时间对同时融合是有效的。预计值(依据9μm成纤维细胞)用进行体细胞+胞质体的同时融合的BTX仪器检测，判定融合和囊胚泡率。
为了加速系统自9月份以来按照PB或形态学表现选择不要的卵母细胞。同样不被选择的标准应用于转移的胚胎。
将PVA加入融合培养基中防止卵母细胞粘连和膜破坏而裂解。尽管建议应该每隔两周制备融合培养基，但是将培养基分装冻存并无不良影响。将Demo-卵母细胞放入融合槽前在含有融合培养基的分别的孔中保温。
通过引入一步融合已经将现存的融合方法简化和改进。与现存的两步法对比(体细胞+胞质体和然后胞质体+胞质体)将体细胞和胞质体同时融合(同时10-12核转移)。现有方法所需时间大大缩短。
而且按照现存的公式计算和测试融合参数(Teissie etal.，1997)。将体细胞和无透明带，去核的卵母细胞同时融合(同时10-12个核转移)。用新参数(在细胞表面使用3V，4μsec)，诱导电位差是成纤维细胞中稳定状态值但它是较大胞质体上电位微小的一部分因此保存了较大胞质体的活力。
实施例6与牛卵母细胞对比使用鼠和绵羊卵母细胞的核转移用绵羊和鼠的卵母细胞在实验中使用实施例1中描述的方法。例如，参考实施例1中的以相似于牛卵母细胞的方式将绵羊和鼠的卵母细胞收集，处理去除透明带和去核。体细胞使用成纤维细胞。
表8显示在用55V(1.1Kv)和112V(2.2kV)6μsec同时融合2胞质体和体细胞(成纤维细胞)后重组绵羊胚胎中的融合率。
表8重组的无透明带绵羊胚胎中的融合率
表9显示在2个重复实验中于112V(2.2kV)6μSec同时融合2个胞质体和绵羊体细胞(成纤维细胞)后重组绵羊胚胎中的融合率。融合后3小时在荧光显微镜下检查每个胚胎的染色质数。
表9重组的无透明带绵羊胚胎中的染色质
表10显示在2个重复实验中于112V(2.2kV)6μSec同时融合2个胞质体和体细胞(成纤维细胞)后重组绵羊核转移胚胎中的裂解率。
表10重组的无透明带绵羊核转移胚胎中的裂解率
表11无透明带鼠卵母细胞二等分后的裂解组别 ％(数目)无卵母细胞 100％(36预计的半卵母细胞＝72)半-卵母细胞 12.5％(9)分裂后裂解 87.5％(63)表12在用AT V(2.2kV)6μSec同时融合2胞质体和体细胞(成纤维细胞)后种属间的(牛胞质体+啮齿类成纤维细胞)重组的胚胎囊胚泡率新鲜的小鼠成纤维细胞 干的小鼠成纤维细胞重组胚胎数目19 18卵裂12(63.2％) 8(44.4％)
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权利要求
1.一种核转移的方法，其包括将体细胞或体细胞核转移入无透明带，去核的卵母细胞步骤。
2.一种生产遗传工程改造的或转基因的哺乳动物的方法，其包括(i)在体细胞或细胞核内插入，去除或修饰一个目的基因或多个基因；(ii)在适合形成重组细胞的条件下将体细胞或细胞核插入无透明带的去核卵母细胞中；(iii)激活重组细胞以形成胚胎；(iv)培养该胚胎直至大于二细胞发育阶段；和(v)转移该培养的胚胎至宿主哺乳动物以使胚胎发育成转基因胎儿。
3.一种克隆哺乳动物的方法，其包括(i)在适合形成重组细胞的条件下将目的体细胞或细胞核插入无透明带的去核卵母细胞中；(ii)激活重组细胞以形成胚胎；(iii)培养该胚胎直至大于二细胞发育阶段；和(iv)转移该培养的胚胎至宿主哺乳动物以使胚胎发育成胎儿。
4.按照权利要求1-3中任一项的方法，其中卵母细胞从哺乳动物的输卵管和/或卵巢分离。
5.按照权利要求4的方法，其中卵母细胞用输卵管回收或经阴道回收方法分离。
6.按照权利要求4或5的方法，其中卵母细胞用抽吸法分离。
7.按照权利要求1-6中任一项的方法，其中卵母细胞处于前期I或中期II。
8.按照权利要求7的方法，其中卵母细胞处于前期I。
9.按照权利要求2-8中任一项的方法，其中卵母细胞在体外培养成熟至中期II。
10.按照权利要求2-9中任一项的方法，进一步包括冷藏卵母细胞，重组细胞，胚胎或胎儿的步骤。
11.按照权利要求2-10中任一项的方法，其中哺乳动物是选自牛科，羊科，鹿科，猪科，马科或骆驼科的家养的或野生的代表性有蹄动物。
12.按照权利要求2-10中任一项的方法，其中哺乳动物是母牛或公牛，野牛，水牛，绵羊，大角绵羊，马，小马，驴，骡，鹿，麋鹿，驯鹿，山羊，印度水牛，骆驼，美洲驼，羊驼，或猪。
13.按照权利要求6的方法，其中牛科种类是Bos taurus，Bos indicus或Bos水母牛或公牛。
14.按照权利要求1-13中任一项的方法，其中去除透明带使用的方法选自物理操作，化学处理或酶消化。
15.按照权利要求14的方法，其中透明带用酶消化去除。
16.按照权利要求15的方法，其中是用暴露于蛋白酶，链霉蛋白酶或它们组合来进行酶消化。
17.按照权利要求16的方法，其中酶消化是通过暴露于链霉蛋白酶。
18.按照权利要求17的方法，其中使用链霉蛋白酶浓度在0.1％-5％之间。
19.按照权利要求17的方法，其中使用链霉蛋白酶浓度在0.25％-2％之间。
20.按照权利要求17的方法，其中使用链霉蛋白酶浓度约为0.5％。
21.按照权利要求1-20中任一项的方法，其中去核步骤使用方法选自抽吸，物理去除，使用DNA特异的荧光染料，或紫外线照射。
22.按照权利要求21的方法，其中去核通过物理去除。
23.按照权利要求22的方法，其中物理去除是二等分。
24.按照权利要求1-23中任一项的方法，其中体细胞选自上皮细胞，神经细胞，表皮细胞，角质细胞，造血细胞，黑素细胞，软骨细胞，淋巴细胞(B和T淋巴细胞)，红细胞，巨噬细胞，单核细胞，单核的细胞，成纤维细胞，心肌细胞，或其它肌细胞。
25.按照权利要求24的方法，其中体细胞来自皮肤细胞，肺脏细胞，胰腺细胞，肝脏细胞，胃细胞，肠细胞，心脏细胞，生殖器官细胞，膀胱细胞，肾脏细胞，尿道细胞或其它泌尿器官细胞。
26.按照权利要求24的方法，其中体细胞是成纤维细胞或颗粒细胞。
27.按照权利要求24的方法，其中体细胞是体外培养的成纤维细胞或颗粒细胞。
28.按照权利要求24的方法，其中体细胞是转基因细胞。
29.按照权利要求28的方法，其中转基因细胞已通过一个或多个目的基因插入，删除或修饰而得以修饰。
30.按照权利要求1-29中任一项的方法，其中转移体细胞或细胞核的步骤是通过融合。
31.按照权利要求30的方法，其中融合的方法选自化学融合，电融合或生物融合。
32.按照权利要求31的方法，其中化学融合或生物融合通过将无透明带，去核的卵母细胞与体细胞组合暴露于融合试剂。
33.按照权利要求32的方法，其中融合试剂是当将体细胞供体与无透明带，去核的卵母细胞受体邻近放置时能增加不同细胞质膜部分融合概率的任何化合物或生物有机物。
34.按照权利要求33的方法，其中融合试剂选自聚乙二醇(PEG)，胰蛋白酶，二甲基亚砜(DMSO)，植物凝集素，凝集素，病毒，或仙台病毒。
35.按照权利要求32的方法，其中使用电脉冲诱导电融合。
36.按照权利要求32的方法，其中电融合包括向无透明带，去核的卵母细胞与体细胞组合传递一次或多次电脉冲的步骤。
37.按照权利要求31的方法，进一步包括在融合前将无透明带，去核的卵母细胞与体细胞附着步骤。
38.按照权利要求37的方法，其附着步骤通过将无透明带，去核的卵母细胞暴露于能使细胞聚集的化合物。
39.按照权利要求38的方法，其中化合物是能结合或聚集碳水化合物的蛋白质或糖蛋白。
40.按照权利要求39的方法，其中化合物是植物凝集素。
41.按照权利要求40的方法，其中植物凝集素选自伴刀豆球蛋白A，刀豆球蛋白A，蓖麻蛋白，大豆凝集素，莲子凝集素和植物凝血素(PHA)。
42.按照权利要求41的方法，其中化合物是PHA。
43.按照权利要求42的方法，其在与体细胞接触前将无透明带，去核的卵母细胞暴露于PHA。
44.按照权利要求43的方法，其中将无透明带的去核卵母细胞暴露于浓度为50-400μg/ml的PHA。
45.按照权利要求44的方法，其中浓度是约200μg/ml。
46.按照权利要求42-45中任一项的方法，其中将无透明带的去核卵母细胞暴露于PHA 1-60s。
47.按照权利要求46的方法，其中将去核卵母细胞暴露于PHA 3s。
48.按照权利要求2-48中任一项的方法，进一步包括向重组细胞融合一或多个无透明带的卵母细胞。
49.按照权利要求48的方法，其中进一步步骤是按顺序或同时进行权利要求2的步骤(ii)。
50.一种克隆哺乳动物的方法，其包括(i)在适合形成重组细胞的条件下向第一个无透明带，去核的哺乳动物卵母细胞中插入目的体细胞或细胞核；(ii)将第二个或多个卵母细胞与该重组细胞融合因而增加了细胞质体积；(iii)激活重组细胞以形成胚胎；(iv)培养该胚胎直至大于二细胞发育阶段；和(v)转移该培养的胚胎至宿主哺乳动物以使胚胎发育成胎儿。
51.按照权利要求50的方法，其中步骤(i)和(ii)按顺序或同时进行。
52.按照权利要求50的方法，其中步骤(i)和(ii)同时进行。
53.按照权利要求2-52中任一项的方法，其中激活重组细胞的步骤选自电脉冲，化学诱导休克，精子穿透，增加细胞内二价阳离子水平或降低磷酸化。
54.按照权利要求2-52中任一项的方法，其中胎儿被转移入同步化的受体子宫内。
55.按照权利要求54的方法，其中受体是雌性哺乳动物。
56.一种培养重组细胞(胚胎)的方法，其包括(i)在适合形成重组细胞的条件下向无透明带，去核的哺乳动物卵母细胞中插入目的体细胞或细胞核；(ii)激活重组细胞；(iii)保温和培养一个或多个该细胞直至胚胎发育成8-128个细胞之间。
57.按照权利要求56的方法，其中将两或多个细胞共同培养。
58.按照权利要求56的方法，其中将二或三个细胞共同培养。
59.按照权利要求56的方法，其中将单个重组细胞培养至产生8至128个细胞的胚胎然后将二或多个胚胎组合并共同培养成聚集体。
60.按照权利要求1-59任何一项获得的哺乳动物。
61.按照权利要求60从哺乳动物获得的细胞，组织或器官。
全文摘要
本发明涉及核转移方法和由此发育成的胚胎。尤其是，本发明涉及包括将体细胞或体细胞核转移入无透明带，去核的卵母细胞的核转移的方法。
文档编号A01K67/027GK1524121SQ02812581
公开日2004年8月25日 申请日期2002年4月19日 优先权日2001年4月20日
发明者伊恩·刘易斯, 加博尔·瓦杰塔, 泰弗·特西里奥格鲁, 瓦杰塔, 伊恩 刘易斯, 特西里奥格鲁 申请人:蒙纳希大学