专利名称：一种培育银杉菌根苗的方法
技术领域：
本发明涉及一种培育银杉菌根苗的方法。
背景技术：
银杉(Cathaya argyrophylla Chun et Kuang)是20世纪50年代在我国发现的松科单型属植物，是我国特有的珍稀濒危植物，有“植物中的大熊猫”之称。
银杉主要分布于我国亚热带山地，目前，仅在我国广西，四川，贵州，湖南等地有少量分布。分布区域狭小，对生态环境的适应性差，在分类系统上比较孤立。在自然条件下，银杉通过种子繁殖，但银杉的结实量很少，而且发芽率也不高，所以银杉的自然繁殖能力低下。同时，用扦插法或嫁接法繁殖时成活率很低(王伏雄.银杉生物学.科学出版社.101.1990；谢宗强.中国特有植物银杉及其研究.生物多样性.399-103.1995)。
我国研究人员对濒危植物-银杉已进行了一系列的研究工作，特别是对于银杉的胚胎发育进行了较全面的研究，发现银杉有性生殖周期长，并且在传粉，受精以及种子发育过程中遭到不良生境，导致生殖效率低，种子产量极少，严重影响银杉的天然更新。同时，银杉是阳性植物，随着年龄的增加对光照的要求逐渐增强，而银杉往往与阔叶树种混生，受到阔叶树种荫蔽，导致种群更新不良，数量下降(王伏雄.银杉生物学.科学出版社.101.1990)。
目前，在各银杉保护区一般用人工种子繁殖法来繁育银杉小苗，在一定程度上提高了种子的发芽率，但是小苗的成活率还是不高。但是目前为止，还没有找到有效的提高银杉幼树生存率，复壮其种群的方法。
银杉是典型的松科植物，而绝大多数的松科植物都是外生菌根植物。外生菌根在植物营养代谢，抗逆境及抗病虫害方面的功能越来越引起人们的关注，目前外生菌根技术在引种、菌根化育苗造林、逆境造林、植物病害防治方面的应用都已在许多树种上取得了初步成效。但是，有关银杉菌根的报道还没有。
目前，在世界上已有不少先例是运用菌根技术进行造林，如桉树(Dell B，Malajczuk N and Dunstan WA.Persistence of some Australian Pisolithusspecies introduced into eucalypt plantations in China.Forest Ecology andManagement.169271-281.2002)，桦树(Fleming LV.Experimental study ofsequences of ectomycorrhizal fungi on birth(Betula SP.)seedling root systems.Soil Biology and Biochemistry.17591-600.1985)。无菌条件下人工菌根苗的诱导是一种非常有效的合成和验证菌根苗的方法，如在赤松(Yamada A，Maeda K andOhmasa M Ectomycorrhiza formation of Tricholoma matsutake isolates onseedlings of Pinus densiflora in vitro.Mycoscience，40455-463.1999)；桉树(Chilvers GA，Douglass PA and Lapeyrie FF A paper-sandwich techniquefor rapid synthesis of ectomycorrhizas.New Phytol 103397-402.1986)；欧洲松(Bending GD，Poole EJ，Whipps JM and Read DJ.Characterisation ofbacteria from Pinus sylvestris-Suillus luteus mycorrhizas and theireffects on root-fungus interactions and plant growth.FEMS MicrobiologyEcology，39219-227.2002)；冷杉(Vaario LM，Tanaka M，Ide Y，Gill WM andSuzuki K.In vitro ectomycorrhiza formation between Abies firma and Pisolithustinctorius.Mycorrhiza 9177-183.1999；Vaario LM，Gill WM，Tanaka M，Ide Y andSuzuki K.Aseptic ectomycorrhizal synthesis between Abies firma and Cenococcumgeophilum in artificial culture.Mycoscience，41395-399.2000b；Vaario LM andSuzuki K.Ectomycorrhizal synthesis between Abies firma roots/callus and Laccariabicolor strain S238.Acta Botany Sinica，(in press).2003)；杨树(Massicotte HB，Melville LH，Peterson RL and Unestam T.Comparative studies of ectomycorrhizaformation in Alnus glutinosa and Pinus resinosa with Paxillus involutus.Mycorrhiza，8229-240.1999；Hampp R，Ecke M，Schaeffer C，Wallenda T，Wingler A，Kottke Iand Sundberg B.Axenic mycorrhization of wild type and transgenic hybrid aspenexpressing T-DNA indoleacetic acid-biosynthetic genes.Trees-Structure andFunction，1159-64.1996)；栎树(Diez J，Manjon JL，Kovocs GM，Celestino C andToribio M.Mycorrhization of in vitro plants raised from somatic embryos of corkoak(Quercus suber L).Applied Soil Ecology 15119-123.2000)等树种上已有不少报道，但对于离体条件下生长困难的树种来说，成功率并不是很高。主要的技术障害是无法有效地诱导植物根和菌的同时生长，常造成菌的过剩生长，从而影响植物的生长。菌根菌的筛选、植物体的生长诱导、以及菌根诱导培养基的筛选都是人工菌根苗诱导的关键。
发明创造内容本发明的目的是提供一种可快速培育银杉菌根苗的方法。
一种培育银杉菌根苗的方法，包括以下步骤1)培育苗高为2-6厘米的银杉小苗；
2)将银杉小苗和菌根菌土生空团菌(C.geophilum)一同接种于供银杉菌根合成的培养基中，经培养得到银杉菌根苗。
其中，步骤1)中的小苗可由常规方法得到，为使银杉种子的萌芽率提高，可按如下方法培育将银杉种子4℃低温处理2周-8周后，消毒，在含0.2-0.8％葡萄糖，其中优选为含0.5％葡萄糖的琼脂培养基中在23±2℃，光照周期为16h/8h，光照强度为4000lux条件下无菌培养1-14天，以3-5天为佳，将种子胚乳的外周切开1/3-1/5，继续无菌培养得到苗高为2-6厘米的银杉小苗。按上述方法培养的种子萌芽率可从4％提高到60％以上。
所述适合银杉菌根合成的培养基优选为RM(Vaario LM，Guerin-laguette A，Matsushita N，Suzuki K and Lapeyrie F(2002)Saprobic potential of Tricholomamatsutakegrowth over bark treated with surfactants.Mycorrhiza 12(1)1-6)培养基。
因过多的碳源会引起菌根菌自我生长过剩，从而影响共生体的形成，所以，所述RM培养基中葡萄糖的浓度为0.05-1.0g/l，优选为0.1-0.3g/l。
步骤3)中的培养条件为在18-26℃，光照周期为14-18h/10-6h，2000-6000lux光强，其中，优选为在23±2℃，光照周期为16h/8h，4000lux光照强度，将上述接种于适合银杉菌根合成的培养基中的银杉苗根部避光培养4-6周。
本发明通过组织培养法诱导银杉无菌小苗、进行培养基和外生菌根菌的筛选，并对传统的用于菌根合成的paper-sandwish方法进行改良，找到同时适合银杉幼苗与外生菌根菌生长的培养条件，成功地建立起银杉快速人工菌根苗的诱导法。这一方法为拯救银杉种群，打下了一个良好的研究平台。本发明的方法诱导效率高，操作简便，适合推广应用，具有显著的社会效益、经济效益和生态效益。
图1为土生空团菌(C.geophilum)分别在MMN和RM培养基上的菌落生长速率曲线。
图2为土生空团菌(C.geophilum)分别在MMN和RM培养基上培养43天的菌丝体干重柱状图。
图3为土生空团菌(C.geophilum)和银杉发芽2个月的小苗共培养接种示意图。
图4A为银杉菌根的照片。
图4B为银杉菌根横切片的显微镜照片。
具体实施例方式
实施例1、银杉菌根苗的培育
1、银杉种子的发芽诱导将采于广西大瑶山银杉种子4度低温处理4周后，首先用洗剂轻轻搓洗，随后用流水冲洗数小时。70％酒精表面消毒30秒，用30％过氧化氢溶液浸泡30分钟，然后移入无菌滤纸上凉干。最后，培养在含0.5％葡萄糖的琼脂培养基中。培养室的温度，光照条件为23±2℃，16小时光照，光照强度为4000lux。培养3天后，在超净工作台内，用解剖刀将种子的胚乳切开，以种子胚乳的外周切开1/3-1/5为佳，然后再培养在相同培养基上。10-20天，银杉的胚根，胚芽开始萌发。经过上述处理，种子的萌芽率从4％提高到60％以上。移入培养基A，进行小苗生长的诱导。5-7周，可以得到苗高2-3厘米的银杉小苗。
2、适合银杉菌根诱导的外生菌根菌的筛选将苗高为3-4厘米的银杉小苗培养于100ml三角烧瓶MMN斜面培养基上，分别接上外生菌根菌Cenococcum geophilum，Pisolithus tinctorius，Boletus edulis，Russula foetens。将培养烧瓶下部用锡箔纸包上，培养于23±2℃，16小时光照，光照强度为4000lux的培养室。培养1个月后，对于银杉的生长进行观察。B.edulis以及R.foetens菌生长过剩，一个月后，菌丝体覆盖整个银杉小苗，使小苗枯死。而P.tinctorius生长速度较B.edulis，R.foetens，慢，但还是很快盖过银杉小根。C.geophilum的生长速度适中，银杉小苗生长能与此共存。
3、适合银杉菌根合成培养基的筛选菌种土生空团菌(C.geophilum)培养基MMN培养基和RM培养基，分别含有0.1％葡萄糖和1.2％琼脂。
培养从生长在MMN(Marx，DH，(1969)The influence of ectotrophic mycorrhizalfungi on the resistance of pine roots to pathogenic infections.I.Antagonism ofmycorrhizal fungi to root pathogenic fungi and soil bacteria.Phytopathology 59153-163.)培养基上(约一个月)的C.geophilum菌落上，从外往内地切割直径为6厘米的接种块，分别接种在MMN及RM培养基上，每隔一周进行菌落直径的测定，第6周时，用80度温水洗脱法，将菌落洗脱，60℃烘箱中烘干一宿，测其干重。
结果表明，菌丝体趋于在RM培养基的表面或浅层平铺生长，菌丝体的生长速率如图1所示，表明在同样的生长期内，生长在RM培养基上的菌落的直径远远大于生长在MMN培养基上的，有利于与植物根形成最大面积的接触。培养6周后菌丝体的干重比较如图2所示，表明在RM培养基和MMN培养基上培养6周后的菌丝体干重并不存在统计学上的差异。RM培养基被选为菌根合成用培养基。表1和表2中的数值为5个重复的平均值。
4、银杉菌根的合成菌种土生空团菌(C.geophilum)植物银杉发芽2个月的小苗(苗高为4厘米)接种方法如图3所示。
接种培养将平板培养皿的下部2/3部分包上锡箔纸以避光，放置在23±2℃，16小时光照，光照强度为4000lux处培养。每周进行细根的显微镜观察。3-4周后，能观察到细根的周边的黑色菌丝体，5-6周后，形成明显的黑色菌套(图4A)。通过石蜡切片法观察结果如图4B所示，发现银杉-土生空团菌(C.geophilum)的菌根外形(黑色的菌套及外延菌丝)和明显的皮层中哈啼氏(Hartig)网，确认为菌根形成。
权利要求
1.一种培育银杉菌根苗的方法，包括以下步骤
1)培育苗高为2-6厘米的银杉小苗；
2)将银杉小苗和菌根菌土生空团菌(C.geophilum)一同接种于供银杉菌根合成的培养基中，经培养得到银杉菌根苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)中所述苗高为2-6厘米的银杉小苗可按如下方法培育将银杉种子4℃低温处理2-8周后，消毒，在含0.2-0.8％葡萄糖的琼脂培养基中在23±2℃，光照周期为16h/8h，光照强度为4000lux条件下无菌培养无菌培养1-14天后，将种子胚乳的外周切开1/3-1/5，继续无菌培养得到苗高为2-6厘米的银杉小苗。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述葡萄糖的含量为0.5％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述供银杉菌根合成的培养基为RM培养基。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述RM培养基中葡萄糖的浓度为0.05-1.0g/l。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述葡萄糖的浓度为0.1-0.3g/l。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其特征在于所述培养银杉菌根苗的条件为在18-26℃，光照周期为14-18h/10-6h，2000-6000lux光强下，根部避光培养4-6周。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述培养温度为23±2℃，所述光照周期为16h/8h，所述光照强度为4000lux。
全文摘要
本发明公开了一种培育银杉菌根苗的方法，目的是提供一种可快速培育银杉菌根苗的方法。本发明所提供的培育银杉菌根苗的方法，包括以下步骤1)培育苗高为2－6厘米的银杉小苗；2)将银杉小苗和菌根菌土生空团菌(C.geophilum)一同接种于供银杉菌根合成的培养基中，经培养得到银杉菌根苗。本发明的方法诱导效率高，操作简便，适合推广应用，具有显著的社会效益、经济效益和生态效益。
文档编号A01H17/00GK1620855SQ20031010389
公开日2005年6月1日 申请日期2003年11月24日 优先权日2003年11月24日
发明者傅禄敏, 李玉花, 邢树堂, 谢宗强, 伦志明 申请人:中国科学院植物研究所, 东北林业大学