专利名称：一种动物的冷冻精液及其制作方法
技术领域：
本发明涉及精液冷冻技术，广泛适用于动物精液冷冻。
背景技术：
生物技术飞速发展的今天，优秀种公畜的精液可以通过人工输精大力推广，但是由于受地域限制，低温保存下，鲜精存活并且有受精能力的时间不超过48小时。精液冷冻后则可以保存数十年，解冻后仍然具有受精能力。长期以来，动物精液冷冻多采用甘油作为防冻剂，而甘油对精子的毒副作用较大，影响受胎效果。动物冻精解冻后存活时间比鲜精短10小时以上，这也是冻精受胎率低的重要因素。在冻精稀释液保存方面，一般是现配制现使用，最多不能超过3天，因此，经常配制稀释液成为生产冻精的主要工作，某些对受胎效果有益的物质在输精时添加比较麻烦，工作量大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种动物的冷冻精液及其制作方法，该冷冻精液具有较高的受胎率，可以简化输精操作，并且制作方法更为简化。
本发明提供了一种动物的冷冻精液，含有动物精子、糖源、微量元素、抗生素，其特征在于另外含有乙二醇、睾丸酮。
本发明动物的冷冻精液中，还可以含有卵黄、VB12。
本发明动物的冷冻精液中，所用动物精子特别指山羊精子。
本发明特别提供了一种上述动物冷冻精液的制作方法，其特征在于过程如下
稀释液配制基础液取乳糖5.1g，葡萄糖3.5g，两水柠檬酸钠1.4g，tris 0.12g，EDTA0.03g，然后加双蒸馏水100ml，溶液煮沸消毒，降温至37℃；I液取基础液80ml，加入新鲜卵黄20ml，青霉素10万iu，链霉素0.1g；II液取I液22ml，加入乙二醇4.2ml，睾丸酮5～10mg，葡萄糖130mg，1ml∶0.5mg的VB1212～24ml；I液和II液分别用精密滤纸过滤，取其滤过液；精液处理采出的精液，首先用2.9％的柠檬酸钠溶液等温稀释，然后离心10分钟，转速为1000～1500转/分，转速逐渐上升。然后弃去上清液，按1∶2加入等温的I液。
精液加入I液后，以0.2～0.3℃/分钟降温至0～4℃，降温时间为1.5～2.0小时，然后加入等温的II液对倍稀释，再平衡0.5～1小时，在该温度下分装无菌塑料细管内。
冷冻将0～4℃温区中的试管移入-100℃±5℃的液氮网面上，冷冻2～3分钟，至细管表面全部呈现白色后浸入液氮保存。
本发明动物冷冻精液的制作方法中，所述稀释液可以按以下方式保存将配制好的I液和II液，分装于玻璃试管或其它玻璃容器中，然后在-1～20℃下冻结；每次处理精液时，取出一定量的I液和II液在37℃以下温度回温溶化，即可使用。但溶化后的稀释液，不能第二次再冻结。
本发明首定量地使用乙二醇作为抗冻剂，并且在抗冻作用方面，以乙二醇为主，其它抗冻剂为辅，代替传统的使用甘油作防冻剂，使冻精活力提高0.15以上本发明首次在稀释液中添加丙酸睾丸酮这一雄性激素，作为稀释液的成分之一，使解冻后的精子存活时间延长8小时以上。这对提高冻精的受胎率具有重大意义。
本发明在稀释液的保存方面，首次以冷冻状态保存含有卵黄的稀释液。在以往的稀释液中，含有卵黄成分的稀释液，往往怕冻结而影响冷冻效果。
本发明的发明人经验后证实，卵黄稀释液经一次冻结保存，并不影响精液冷冻效果。这就为保存稀释液带来了有利的因素稀释液在0～4℃温区保存条件下。经2～3天后也会变质而无法使用；然而如果在0℃以下保存取得成功，则可做到稀释液大量配制，分装后长期保存。这无疑为生产冻精创造了便利条件。值得一提的是，冷冻状态解冻后，便不能回复到冷冻状态。
本发明在稀释液中，首次加入VB12由这一成分，即将VB12由原来的解冻液中转移到稀释液中。在以往的报导在，经常见到以VB12具有提高受胎率的作用，本发明在生产冻精时一次添加VB12，则省去了在千家万户输精时添加VB12的烦琐操作。
总之，采用本发明技术，冻精解冻后精子的活力由原来的平均0.35，提高到0.50以上；顶体完整率由原来的45％提高到65％以上，冻精解冻后具有授精能力的时间由以前的10～12小时提高到18～20小时。以辽宁绒山羊为实验对象，综合配方解冻后效果，使情期母羊受胎率由原来的45％提高到现在的80％，从而可以使辽宁绒山羊优秀种公羊冷冻精液可以大力推广。
具体实施例方式实施例1稀释液配制基础液基础液取乳糖5.1g，葡萄糖3.5g，两水柠檬酸钠1.4g，tris0.12g，EDTA0.03g，然后加双蒸馏水100ml，溶液煮沸消毒，降温至37℃；I液取基础液80ml，加入新鲜卵黄20ml，青霉素10万iu，链霉素0.1g；II液取I液22ml，加入乙二醇4.2ml，睾丸酮5mg，葡萄糖130mg，VB12(1ml∶0.5mg)12ml。
I液和II液分别用精密滤纸过滤，取其滤过液。
稀释液的保存将配制好的I液和II液，分装于玻璃试管或其它玻璃容器中，然后在-10℃下冻结。每次处理精液时，取出一定量的I液和II液在37℃以下温度回温溶化，即可使用。但溶化后的稀释液，不能第二次再冻结。
精液处理采用的精液，首先用2.9％的柠檬酸钠溶液稀释(等温稀释)，然后离心10分钟，转速为1000～1500转/分，转速逐步渐上升。然后弃去上清液，按1∶2加入等温的I液。
精液加入I液后，以0.2～0.3℃/分钟降温至2±1℃，降温时间为1.5小时，然后加入等温的II液(对倍稀释)，再平衡0.5小时，在该温度下分装无菌塑料细管内。
冷冻将试管移入-100±5℃的液氮网面上，冷冻2分钟，至细管表面全部呈现白色后浸入液氮保存。
解冻将细管迅速放入38～40℃的温不中，至细管表面刚呈现透明时立即取出，在25℃下进行输精。
冻精解冻后精子的活力达到0.50；顶体完整率达到65％，冻精解冻后具有授精能力的时间达到18小时。以辽宁绒山羊为实验对象，综合配方解冻后效果，使情期母羊受胎率达到80％。
实施例2稀释液配制基础液取乳糖5.1g，葡萄糖3.5g，两水柠檬酸钠1.4g，tris 0.12g，EDTA0.03g，然后加双蒸馏水100ml，溶液煮沸消毒，降温至37℃。
I液取基础液80ml，加入新鲜卵黄20ml，青霉素10万iu，链霉素0.1g。
II液取I液22ml，加入乙二醇4.2ml，睾丸酮10mg，葡萄糖130mg，VB12(1ml:0.5mg)24ml。
I液和II液分别用精密滤纸过滤，取其滤过液。
稀释液的保存将配制好的I液和II液，分装于玻璃试管或其它玻璃容器中，然后在-10℃下冻结。每次处理精液时，取出一定量的I液和II液在37℃以下温度回温溶化，即可使用。但溶化后的稀释液，不能第二次再冻结。
精液处理采用的精液，首先用2.9％的柠檬酸钠溶液稀释(等温稀释)，然后离心10分钟，转速为1000～1500转/分，转速逐步渐上升。然后弃去上清液，按1∶2加入等温的I液。
精液加入I液后，以0.2～0.3℃/分钟降温至1±1℃，降温时间为2小时，然后加入等温的II液(对倍稀释)，再平衡1小时，在该温度下分装无菌塑料细管内。
冷冻将试管移入-100℃±5℃的液氮网面上，冷冻3分种，至细管表面全部呈现白色后浸入液氮保存。
解冻将细管迅速放入38～40℃的温水中，至细管表面刚呈现透明时立即取出，在25℃下进行输精。
冻精解冻后精子的活力达到0.55；顶体整率达到68％，冻精解冻后具有授精能力的时间达到20小时。以辽宁绒山羊为实验对象，综合配方解冻后效果，使情期母羊受胎率达到82％。
权利要求
1.一种动物的冷冻精液，含有动物精子、糖源、微量元素、抗生素，其特征在于另外含有乙二醇、睾丸酮。
2.按照权利要求1所述动物的冷冻精液，其特征在于所述冷冻保存的动物精液中含有卵黄。
3.按照权利要求2所述动物的冷冻精液，其特征在于所述冷冻保存的动物精液中含有VB12。
4.按照权利要求3所述动物的冷冻精液，其特征在于所述动物精子为山羊精子。
5.一种权利要求1所述动物冷冻精液的制作方法，其特征在于过程如下稀释液配制基础液取乳糖5.1g，葡萄糖3.5g，两水柠檬酸钠1.4g，tris 0.12g，EDTA0.03g，然后加双蒸馏水100ml，溶液煮沸消毒，降温至37℃；I液取基础液80ml，加入新鲜卵黄20ml，青霉素10万iu，链霉素0.1g；II液取I液22ml，加入乙二醇4.2ml，睾丸酮5～10mg，葡萄糖130mg，1ml0.5mg的VB1212～24ml；I液和II液分别用精密滤纸过滤，取其滤过液；精液处理采用的精液，首先用2.9％的柠檬酸钠溶液等温稀释，然后离心10分钟转速为1000～1500转/分，转速逐步渐上升。然后弃去上清液，按1∶2加入等温的I液；精液加入I液后，以0.2～0.3℃/分钟降温至0～4℃，降温时间为1.5～2.0小时，然后加入等温的II液对倍稀释，再平衡0.5～1小时，在该温度下分装无菌塑料细管内；冷冻将0～4℃温区中的试管移入-100℃±5℃的液氮网面上，冷冻2～3分钟，至细管表面全部呈现白色后浸入液氮保存。
6.按照权利要求5所述动物冷冻精液的制作方法，其特征在于所述稀释液按以下方式保存将配制好的I液和II液，分装于玻璃试管或其它玻璃容器，然后在-1～-20℃下冻结；每次处理精液时，取出一定量的I液和II在37℃以下温度回温溶化，即可使用。
全文摘要
一种动物的冷冻精液，含有动物精子、糖源、微量元素、抗生素，其特征在于另外含有乙二醇、睾丸酮、卵黄、V
文档编号A61D19/00GK1657020SQ20041002117
公开日2005年8月24日 申请日期2004年2月20日 优先权日2004年2月20日
发明者张世伟, 宋先忱, 朱延旭, 刘兴伟, 郭春润 申请人:辽宁省辽宁绒山羊原种场