专利名称：一种地面模拟宇宙粒子辐射育种方法
技术领域：
本发明涉及利用模拟空间环境影响植物的生物遗传效应的方法，具体涉及一种地面模拟宇宙粒子辐射育种方法。
背景技术：
进行空间技术育种实验研究已经取得可喜进展。例如利用返回式卫星搭载植物种子，已育成了高产、优质、多抗的水稻、小麦、芝麻、青椒、番茄等作物新品种、新品系，并从中获得一些特异突变新材料、新种质。空间诱变技术育种具有变异幅度较大、有益变异增多，有利于加速育种进程和改进品质等特点，是一个颇具发展前景的育种新途径(刘录祥等作物空间诱变效应及其地面模拟研究进展，核农学报，2004，18(4)247-251)。
尽管太空环境因素协同诱变具有显著的特点和效应，但由于太空实验投资大，技术要求高，实验机会也十分有限，因此，有必要进行地面模拟太空环境因素的试验研究，这有利于揭示太空诱变机理，开展育种研究。
宇宙线辐射是空间环境诱变种子的重要因素之一。国内外在高能单粒子生物效应研究方面已有大量文献积累(杨垂绪，梅曼彤太空放射生物学，中山大学出版社，1995)，但尚未报道过混合粒子场的生物效应及其育种应用研究。由于宇宙线是由多种高能、高LET粒子组成的混合场，单粒子效应难以真实反映宇宙线辐射的实际效应。因此，开展混合粒子场诱变农作物的生物效应试验，对于探索空间环境诱变机理、提高空间育种效率和开辟育种新途径具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是在地面模拟宇宙粒子进行太空辐射生物效应研究，为开展地面模拟空间环境诱变育种，进行品种改良提供一种新方法。
本发明的技术方案是利用混合粒子场模拟空间环境处理植物种子和离体培养物。
具体操作方法是将待处理的植物种子或离体培养物置于地面模拟的高能混合粒子辐射场环境进行处理，然后进行种植筛选或培养。
所述植物包括粮食作物(如小麦、大麦、水稻、玉米)、蔬菜、牧草(紫花苜蓿和草坪草)和花卉等。
所述离体培养物包括花药、幼胚及其愈伤组织等。
所述高能混合粒子辐射场环境是指由地面直线加速器引出的能量为1.1～1.5Gev的电子束轰击金属靶产生的混合粒子场，包括派介子、谬子、正、负电子、质子、中子和伽马。
根据植物种类或组织的不同，所使用的高能混合粒子场的剂量范围也不同。植物种子所用的剂量范围在100～500Gy。如小麦、大麦、水稻和玉米等粮食作物的适宜剂量范围为200～300Gy；番茄、青椒、黄瓜、牧草、花卉等作物的适宜剂量范围为150～200Gy；离体培养物的适宜剂量范围为15～20Gy。
本发明采用不同基因型的植物种子及离体状态脱分化过程中的植物组织等为材料，经不同剂量的模拟空间混合粒子场处理，实验室分析和大田种植试验相结合，通过世代跟踪和对比分析方法，揭示模拟空间环境处理植物的生物遗传效应。
本发明为评价空间环境生物效应要素中宇宙线辐射的重要性和探索地面模拟空间环境诱变育种新途径提供了实验依据。为开拓植物诱变育种提供了新方法。
图1～4展示了不同的粒子数目随辐照动量变化的数量关系。图中A正电子；B派介子；C质子；D负电子；图5是混合粒子场靶室不同照射角度粒子剂量刻度分布图。图中No.1辐照24h；No.2辐照48h；
具体实施例方式实施例11 材料和方法1.1 供试材料小麦品种SP8724和D6-3。
1.2 试验方法利用北京正负电子对撞机(简称BEPC)上运行的直线加速器引出的1.5Gev的高能电子束打固定(碳)靶，产生次级粒子束，组成高能混合粒子场，模拟高空(中层大气层)宇宙线辐射。辐照靶室放在距离固定靶2m远的弧线上，不同位点(以角度表示)的辐照剂量用硫酸亚铁剂量计刻度。小麦品种SP8724和D6-3风干种子各300粒，在室温下经185Gy高能混合粒子场处理，并以185Gy的60Coγ射线与未经处理的种子为对照，在21℃恒温条件下做室内发芽试验，每一处理100粒，三次重复。调查统计萌发势、发芽率及10天后的苗高和根长。
各处理M1代及对照幼苗移栽大田，顺序排列，一次重复，行长2m，行距30cm，株距5cm。田间调查记载主要农艺性状，抽穗后逐株套袋，成熟后单株收获，室内考种。
2 结果与讨论2.1 高能混合粒子场的产生与剂量刻度利用BEPC直线加速器引出的1.5Gev的电子束，在θ＝15°的出射角处打铜靶，产生次级粒子束，主要包括派介子(π±、π0)、谬子(μ±)、电子(e±)、伽马(γ)和质子(p)等。这些粒子均具有广谱结构，即Ek＝200Mev～1.2Gev。
经过蒙特卡罗理论模拟计算，不同粒子在混合粒子中的所占比例随着辐照动量在300～1500Mev/c之间变动也在变动；平均而言，电子、和质子在各种辐照动量下的所占比例较高。图1～4展示了不同的粒子数目随辐照动量变化的数量关系。
将辐照靶室划分成从5°～40°共10个不同处理位点，以硫酸亚铁剂量计刻度每一角度的辐照剂量。辐照时间分别为24h(No.1)和48h(No.2)。图5反映了辐照角度与辐照剂量间的数量关系。
2.2 高能混合粒子场辐照小麦生物效应与适宜剂量结合定点剂量刻度，先后对小麦、水稻、紫花苜蓿、草坪草、番茄、青椒、黄瓜和花卉等植物种子以及植物组织离体培养物进行混合粒子辐照处理，并与相应剂量的60Coγ射线处理作对比分析。从幼苗苗高、根长等生物损伤效应初步分析发现，混合粒子辐照处理比60Coγ射线处理生物损伤大，相对生物效应高(表1和2)。
混合粒子辐照处理小麦种子具有明显的剂量效应，主要表现为随着辐照处理剂量的增加，对幼苗及根系的生长损伤增加。以半致矮效应为指标，初步确定出混合粒子辐照处理小麦、大麦、水稻、玉米的适宜剂量范围为200～300Gy；番茄、青椒、黄瓜和花卉种子的适宜剂量范围为150～200Gy。
表1 混合粒子辐照处理小麦对种子萌发与幼苗生长的影响
表2 混合粒子辐照处理小麦对M1代主要农艺性状的影响
实施例21 材料与方法1.1 材料小麦品种中原9号和中优9507。
1.2 实验方法1.2.1 辐照处理利用BEPC直线加速器引出的1.5Gev的电子束打铜靶产生高能混合粒子场处理中原9号和中优9507，辐照剂量分别为0、79Gy、109Gy、145Gy、195Gy、284Gy和560Gy，各处理400粒种子。同时以60Co-γ射线处理作为对照，处理剂量和种子数量与高能混合粒子场处理相同。
1.2.2 发芽实验发芽试验采用发芽盒法，在21℃的恒温箱中培养。将处理种子和对照(未处理种子)分别的随机各选取50粒种子发芽，在第三天时统计发芽势，第七天时统计发芽率，第10天时测量幼苗根长和苗高。
1.2.3 根尖细胞学检测及幼苗叶片DNA多态性分析小麦干种子经75％酒精杀菌，在25℃下萌发露白，低温0-4℃处理24小时，然后在25℃恒温箱中待根长至1-2cm时取下根尖，在α-溴萘饱和液中预处理5小时，用卡诺固定液(酒精∶醋酸＝3∶1)固定，孚尔根法染色，卡宝品红液复染压片。每个处理观察8-10个根尖，每个根尖随机观察大约600个细胞，对各变异数记录。DNA多态性分析采用SSR方法(高睦枪等我国部分冬小麦新品种(系)SSR标记遗传差异的研究，农业生物技术学报，2001，9(1)49-54.)。
1.2.4 M2代突变谱与突变频率M1代单株收获后按照每穗留取3-5粒种子混合后构建M2代群体，单株点播，行长2m，行距30cm，每20个株行设一个原品种对照，每行点播50粒。M2代主要考察株高、株型、蜡质、穗型、芒性和育性的变化，并筛选突变个体，计算突变频率。
2.结果与分析2.1 混合粒子场对M1代种子发芽的辐射效应研究发现，经混合粒子场辐照处理之后，中原9号和中优9507种子的发芽势均受到抑制，发芽率降低。中原9号的发芽势最低只有54％，发芽率最低只有82％；中优9507的发芽势最低只有40％，发芽率最低只有68％。在0-560Gy的剂量范围内，随着剂量的增大种子的发芽势、发芽率降低。这表明经过混合粒子场辐照处理之后，种子细胞受到了损伤，生理活动和代谢调节受到了抑制，影响了种子的发芽势和发芽率。
混合粒子场和γ射线辐照处理中原9号和中优9507种子之后，从种子发芽产生的生物损伤分析，在0-560Gy的剂量范围内，剂量相同的情况下，混合粒子场产生的辐射损伤比γ射线大。在剂量109Gy比较，混合粒子场对中优9507发芽势、发芽率的生物损伤为42.11％和27.66％，而γ射线对中优9507发芽势、发芽率的生物损伤为2.63％和8.51％。
2.2 混合粒子场对M1代幼苗生长的辐射效应经过混合粒子场辐照处理之后，中原9号、中优9507M1代幼苗高度降低，幼根长度缩短。在0-560Gy的剂量范围内，随着剂量的增加中原9号、中优9507M1代生物损伤上升，幼苗高度降低，幼根长度缩短，在剂量为560Gy时损伤最大，幼苗高度最低，幼根长度缩到最短。经过混合粒子场辐照处理之后，中原9号和中优9507的幼苗高度、幼根长度相比对照都有显著的降低，这表明辐照处理引起了分生组织的损伤，抑制了M1代幼苗的正常生长。
从混合粒子场和γ射线辐照处理对幼苗的生物损伤分析，在剂量相同的情况下，混合粒子场产生的辐射损伤比γ射线大，会引起更加强烈的抑制作用。在109-284Gy的剂量范围内，混合粒子场对中原9号根长的生物损伤从24.77-77.39％，而γ射线的生物损伤从0.33-41.40％。在109-284Gy的剂量范围内，混合粒子场对中优9507苗高的生物损伤从33.08-77.94％，而γ射线的生物损伤从23.27-70.47％。
以幼苗高度、幼根根长降低到对照的高度和长度的50％为标准，中原9号和中优9507中混合粒子场对γ射线的相对生物学效应RBE值均大于1，这表明用混合粒子场处理较小剂量就能达到γ射线较大剂量的辐射生物学效应，混合粒子场对小麦的生物损伤能力有可能优于γ射线。
2.3 混合粒子场对M1代根尖细胞染色体的畸变效应混合粒子场处理对冬小麦M1代根尖细胞有明显的致畸效应，不但强烈地抑制根尖细胞的有丝分裂活动，而且引起根尖细胞染色体的畸变。诱发突变M1代可观察到的细胞学效应主要是微核变异和染色体畸变。根尖细胞在有丝分裂间期出现了微核(包括单微核，多微核)等细胞畸变类型，其中单微核所占的比例最大，与剂量相关性达到极显著水平。随着辐射剂量的加大(0-560Gy)畸变率呈上升趋势。细胞分裂中期出现了染色体断片、环状染色体等畸变类型，细胞分裂后末期出现了单桥、双桥、多桥、落后染色体、游离染色体等类型。染色体畸变与剂量相关性达到极显著水平。随着辐射剂量的加大染色体畸变率呈上升趋势。染色体畸变与小麦幼苗生长有直接的关系，严重的染色体畸变导致幼苗苗高变矮、根长变短。
混合粒子场诱发染色体畸变的种类和频率上都高于γ射线，200-300GY是合适的处理剂量范围。M1代的单微核畸变率与染色体总畸变率相关性达到极显著水平，可以利用单微核畸变率研究混合粒子场对有丝分裂中染色体的损伤。中优9507受到照射后染色体总畸变率、染色体畸变类型都大于中原9号，对诱变因素的反应敏感。
2.4 混合粒子场诱发冬小麦M1代的SSR分析利用93对SSR引物对M1代DNA损伤的多态性分析结果表明，其中48对获得了良好的扩增，有11对引物获得了良好的多态性，扩增条带较之对照减少的最多。SSR多态性频率随剂量增加而上升。
在109-284GY的剂量范围内，有10对引物在中原9号M1代处理中表现出良好的多态性；有9对引物在中优9507M1代处理中表现出良好的多态性。混合粒子场处理的M1代SSR多态性频率高于γ射线，说明混合粒子场对冬小麦DNA的损伤效应大于γ射线。引物组合起来能完整的区分混合粒子场和γ射线对小麦的损伤效应。
2.5 混合粒子场对冬小麦M2代的诱变效应混合粒子场处理后，中原9号和中优9507的M2代群体中出现了多种包括穗形、芒性、蜡质、矮杆、高杆及育性等性状的变异。M2代群体中出现的突变类型及突变频率各不相同，差异明显。混合粒子场和γ射线两种诱变源引起的突变类型相差不多，突变谱相当，但混合粒子场引起的总突变频率、有益突变频率都比γ射线要高。
中优9507总突变率和有益突变都比而中原9号大。中原9号蜡质、芒性、高杆突变的频率大于中优9507，矮杆、穗型、育性突变频率小于中优9507。混合粒子场诱变处理小麦的适宜剂量范围是200-300Gy。
权利要求
1.一种植物辐射育种方法，其特征是将待处理的植物种子或离体培养物置于地面模拟的高能混合粒子辐射场环境进行处理，然后进行种植筛选或培养。
2.根据权利要求1所述的植物辐射育种方法，所述高能混合粒子辐射场环境是能量为1.1～1.5Gev的电子束轰击金属靶产生的混合粒子场，包括派介子、谬子、正、负电子、质子、中子和伽马。
3.根据权利要求2所述的植物辐射育种方法，所述高能混合粒子场处理植物种子的剂量范围在100～500Gy。
4.根据权利要求3所述的植物辐射育种方法，所述高能混合粒子场的剂量范围在150～300Gy。
5.根据权利要求2所述的植物辐射育种方法，所述高能混合粒子场处理离体培养物的适宜剂量范围为15～20Gy。
6.根据权利要求1所述的植物辐射育种方法，所述植物包括粮食作物、蔬菜、牧草和花卉。
7.根据权利要求1所述的植物辐射育种方法，所述离体培养物是花药、幼胚及其愈伤组织。
8.根据权利要求1所述的植物育种方法，所述置于地面模拟的高能混合粒子辐射场环境处理是在室温下进行的。
全文摘要
一种地面模拟宇宙粒子辐射育种方法，利用地面模拟的高能混合粒子辐射场环境处理植物种子和离体培养物。所述植物包括粮食作物、蔬菜、牧草和花卉。本方法为探索空间环境诱变机理、开展地面模拟空间环境诱变育种，进行品种改良开辟了一种新的途径。
文档编号A01H1/06GK1729760SQ200510012010
公开日2006年2月8日 申请日期2005年6月24日 优先权日2005年6月24日
发明者刘录祥, 郭会君, 李家才, 韩微波, 赵林姝, 赵世荣, 王晶 申请人:中国农业科学院作物科学研究所