专利名称：麻疯树辐射诱变的复合处理方法
技术领域：
本发明属于植物辐射诱变处理技术领域，具体涉及一种麻疯树辐射诱变的复合处 理方法。
背景技术：
麻疯树生长快，适应性强，耐干旱瘠薄，种子含油量高、品质好，是目前最有发 展潜力的生物质能源树种之一。其产业的发展得到了国际上一些政府、国际组织、研 究机构和企业的广泛关注和重视。国内外研究表明培育出高产、优质的麻疯树品种是 该产业能更好发展的重要因素之一。因此，为了满足该产业对优良品种的需要，研究 开发快速、高效的品种培育及育种材料创新技术具有重要意义。
植物育种从技术方面大体可分为杂交育种、选择育种、生物技术育种和辐射诱变 育种等。其中杂交育种和生物技术育种要获得优良品种一般需要长达数年或数十年的
研究，不仅过程漫长，且能否成功也无法预料。选择育种方法是在现有资源基础上选 择出优良品种，其花费时间虽然相对较短，但却要受到遗传变异范围窄的限制。
辐射育种技术是利用射线诱发生物遗传性的改变，并经人工选择培育新的优良品 种的技术。该技术具有打破性状连锁、实现基因重组、突变频率高、突变类型多、变
异性状稳定和方法简便等特点。辐射诱变育种应用的射线源有y射线、x射线、e射
线、中子、激光和无线电波等。处理材料包括植物的种子、花粉、无性繁殖器官、组 织培养物(愈伤组织)和活体植株。由于辐射育种能提高变异频率，加速育种进程，大 幅度改良植物的某些性状，变异范围广，因而可创造人类需要的变异类型，从中选择
培育出优良的生物品种。近年来，在园林植物育种中利用Co60-Y射线照射培育出不少 新品种(种子，2008年，第27巻，第12期，63-67页)。目前，全世界通过辐射诱变 育成的植物品种达到2271个(现代农业科技，2008年，第13期，14-15页)。虽然辐 射诱变育种技术有诸多优点，但在人们多年研究中也发现其还是存在一些明显的缺陷 有利变异少，须大量处理材料；诱变的方向和性质不能控制；改良数量性状效果较差， 具有一定的盲目性。
麻疯树育种研究开展较晚，种质资源改良滞后，野生资源利用研究进展缓慢，有研究者曾经开展过麻疯树种间杂交，但没有获得优良品种(Genetic Resources and Crop Evolution, 2003， 50:75-82)。目前，麻疯树辐射育种研究的报道也较少，主要是对 麻疯树种子的60Co- y射线辐射敏感性及半致死剂量进行了研究，其结果表明麻疯树种 子半致死剂量在130-200Gy,其中未见有种子产量高、含油率高的优良株系的研究报道 (南方医科大学学报2009年，29: 506-508)。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种麻疯树辐射诱变的复合处理 方法。
本发明提供的麻疯树辐射诱变的复合处理方法，是将成熟带壳的麻疯树种子先用 60Co-y射线辐射处理，然后取出其中的种胚在培养基中进行组织培养，其后用紫外线 照射种胚，最后继代到培养基中继续培育至长出麻疯树组培苗即可移栽至大田种植。
以上方法具体是按以下步骤和条件进行处理
(1) 用1. 0-2. 0Gy/min剂量率的60Co- y射线辐射处理1-2小时；
(2) 将辐射处理后剥去种壳的种仁放入消毒液中消毒，用无菌水冲洗4-7次，再 用无菌水浸泡24-48小时后，在无菌条件下取出种仁并吸干表面的水份，剥出带有两 片白色子叶的种胚，并接种在pH为5. 8-6. 0的MS培养基中培养10-24小时；
(3) 将组织培养中的种胚用250-290nm波长范围的紫外线照射24-72小时后，继 代到pH为5.8-6.0的培养基MS+生长素+细胞分裂素中，在温度为26-30'C，光照度 2000LX,光照时间10 14h/d的组培室内继续培育10-20天即可。
上述方法所述的消毒液为质量浓度0.1-0. 5%的氯化汞溶液或体积浓度70%乙醇溶 液与质量浓度0.1-0. 5%氯化汞溶液或质量浓度10%次氯酸钠溶液。当选用质量浓度 0.1-0. 5%的氯化汞溶液消毒时，处理8-15分钟。当选用乙醇溶液和氯化汞溶液组合消 毒时，先用体积浓度70%的乙醇溶液消毒处理20秒，然后再用质量浓度为0.1 0. 5% 的氯化隶溶液消毒处理7-10分钟。当选用质量浓度10%次氯酸钠溶液消毒时，处理 25-30分钟。
上述方法所述的生长素为质量浓度0.1-0.2mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、 B引哚乙酸(IM)或a-萘乙酸(NM)中的任一种。
上述方法所述的细胞分裂素为质量浓度0.1-0. 2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)。 本发明具有以下积极效果
1、由于本发明在充分利用60Co-y射线核辐射对麻疯树基因组改变的基础上，通过组织培养对60Co- y辐射进行缓冲，并选择辐射相对柔和的紫外线在种胚萌动时进行 照射，因而激发了麻疯树体内的调节机制，不仅与以往报道的单纯用60Co-y射线核辐 射处理其它植物的诱变率(通常在1%以下)相比，大大增加了 (最高增加至8%)，且 部分处理方案还可形成有利的变异，使有利变异率可达1. 33%,从而拓宽了麻疯树种质 资源，为麻疯树高产、优质品种的选育奠定了基础，可大大推动麻疯树生物能源产业 的原料生产。
2、 由于本发明提供的复合诱变技术在处理麻疯树种子时在多年对麻疯树生长环境 分析的基础上，利用60Co-y核辐射技术，采取复合诱变处理技术对麻疯树进行辐射， 因而能提高有利变异率，克服辐射育种中有利变异少的缺点。
3、 由于本发明采用了复合诱变技术处理麻疯树种子，因而可得到种子含油率和产 量均高的优良株系，其中采用1.5 Gy/min剂量率的Co60-y射线处理120分钟，组织 培养24小时，250-290nm波长紫外线照射48小时，与对照组相比其后代种子含油率平 均提高2%、单株种子产量提高8%。
具体实施例方式
下面给出实施例以对本发明作进一步说明，但所给出的实施例不能理解为对本发 明保护范围的限制，因而本专业的技术人员根据上述本发明的内容和设计思想所作出 的非本质的改进和调整也应属于本发明的保护范围。
另外，值得说明的是为了保证原初材料具有相同的遗传背景，便于分析诱变率， 以下实施例所用种子都是在同一棵树采集的成熟麻疯树种子。其中取一部分，不做任 何处理，与处理过的种子种植在同一地块种植作对照组。观察各处理种子的植株性状 变化，种子产量和含油率，同时利用该植株的扩增片段长度多态性分子标记(ALFP) 来检测处理组与对照组基因差异，从而确定辐射后种子和种胚的植株是否发生变异， 进而计算出该处理的诱变率(诱变率=变异植株数/处理种子数><100%),当处理组植株 比对照组植株的麻疯树种子含油率高3%以上或种子单株产量高7%以上时，确定为麻疯 树的有利变异，计算出有利变异率(有利变异率=有利变异植株数/处理种子数乂100%)。 种子含油率参考国标GB/T 14488.1-2008进行测定；单株种子产量采用收获单株种子, 30'C下烘48小时统一称重测量。
实施例1
将采集的成熟麻疯树种子用1.0Gy/min剂量率的60Co- y射线辐射处理1小时；将 剥去种壳的种仁先放入体积浓度70%的乙醇中消毒处理20秒，然后放入质量浓度0.1%的氯化汞溶液中消毒处理15分钟，取出用无菌水冲洗4次，再用无菌水浸泡24小时 后，在无菌条件下取出种仁并吸干表面的水份，剥出带有两片白色子叶的种胚，并接 种在pH为5. 8的MS培养基中培养10小时；将组织培养中的种胚用250-290nm波长范 围的紫外线照射24小时后，继代到含质量浓度0. lmg/L的2, 4-D 、质量浓度0. 2mg/L 的6-BA ，且pH为5. 8的培养基MS中，在温度为26°C ，光照度2000LX，光照时间10h/d 的组培室内继续培育15天即可。
通过本发明方法处理的种子的后代变异率为1. 33%，后代平均单株产量增加1.1%。
实施例2
将采集的成熟麻疯树种子用1. 5Gy/min剂量率的60Co- Y射线辐射处理1. 5小时； 将剥去种壳的种仁先放入体积浓度70%的乙醇中消毒处理20秒，然后放入质量浓度 0.5%的氯化汞溶液中消毒处理8分钟，取出用无菌水冲洗4次，再用无菌水浸泡48小 时后，在无菌条件下取出种仁并吸干表面的水份，剥出带有两片白色子叶的种胚，并 接种在pH为5.9的MS培养基中培养20小时；将组织培养中的种胚用250-290nm波长 范围的紫外线照射48小时后，继代到含质量浓度0. 2mg/L的2, 4-D 、质量浓度0. 2mg/L 的6-BA ，且pH为5. 8的培养基MS中，在温度为26°C ，光照度2000LX，光照时间12h/d 的组培室内继续培育10天即可。
通过本发明方法处理的种子的后代变异率2%，后代平均单株产量增加1. 2%。
实施例3
将采集的成熟麻疯树种子用1. 5Gy/min剂量率的60Co- Y射线辐射处理2小时;将 剥去种壳的种仁放入质量浓度0. 3%的氯化汞溶液中消毒处理10分钟，取出用无菌水冲 洗7次，再用无菌水浸泡30小时后，在无菌条件下取出种仁并吸干表面的水份，剥出 带有两片白色子叶的种胚，并接种在pH为6.0的MS培养基中培养24小时；将组织培 养中的种胚用250-290nm波长范围的紫外线照射48小时后，继代到含质量浓度0. 2mg/L 的2， 4-D 、质量浓度0. lmg/L的6-BA ，且pH为5. 9的培养基MS中，在温度为27°C， 光照度2000LX,光照时间14h/d的组培室内继续培育10天即可。
通过本发明方法处理的种子的后代变异率跳，有利变异率1. 33%,后代平均种子 含油率增加2%,后代平均单株产量增加8%。
实施例4
将采集的成熟麻疯树种子用1. 5Gy/min剂量率的60Co-Y射线辐射处理1. 5小时； 将剥去种壳的种仁放入质量浓度0.1%的氯化汞溶液中消毒处理12分钟,取出用无菌水冲洗5次，再用无菌水浸泡24小时后，在无菌条件下取出种仁并吸干表面的水份，剥 出带有两片白色子叶的种胚，并接种在pH为6.0的MS培养基中培养18小时；将组织 培养中的种胚用250-290nm波长范围的紫外线照射72小时后，继代到含质量浓度 0. lmg/L的2， 4-D 、质量浓度0. lmg/L的6-BA ，且pH为6. 0的培养基MS中，在温度 为27'C，光照度2000LX，光照时间14h/d的组培室内继续培育10天即可。
通过本发明方法处理的种子的后代变异率2. 67%,后代平均种子含油率增加2%。
实施例5
将采集的成熟麻疯树种子用2. OGy/min剂量率的60Co- Y射线辐射处理1小时；将 剥去种壳的种仁放入质量浓度0.5%的氯化汞溶液中消毒处理10分钟，取出用无菌水冲 洗5次，再用无菌水浸泡48小时后，在无菌条件下取出种仁并吸干表面的水份，剥出 带有两片白色子叶的种胚，并接种在pH为5.8的MS培养基中培养20小时；将组织培 养中的种胚用250-290nm波长范围的紫外线照射24小时后，继代到含质量浓度0. lmg/L 的IM、质量浓度0. 2mg/L的6-BA ,且pH为6. 0的培养基MS中，在温度为28°C,光 照度2000LX，光照时间14h/d的组培室内继续培育15天即可。
通过本发明方法处理的种子的后代变异率2. 67%，后代平均单株产量增加1. 2%。
实施例6
将采集的成熟麻疯树种子用1. OGy/min剂量率的60Co- Y射线辐射处理2小时；将 剥去种壳的种仁放入质量浓度10%的次氯酸纳溶液中消毒处理8分钟，取出用无菌水冲 洗6次，再用无菌水浸泡36小时后，在无菌条件下取出种仁并吸干表面的水份，剥出 带有两片白色子叶的种胚，并接种在pH为5.8的MS培养基中培养20小时；将组织培 养中的种胚用250-290nm波长范围的紫外线照射24小时后，继代到含质量浓度0. 2mg/L 的IM、质量浓度0. lmg/L的6-BA ，且pH为5. 9的培养基MS中，在温度为29'C,光 照度2000LX，光照时间12h/d的组培室内继续培育20天即可。
通过本发明方法处理的种子的后代变异率1. 33%，后代平均单株产量增加1. 2%。
实施例7
将采集的成熟麻疯树种子用2. OGy/min剂量率的60Co- Y射线辐射处理1. 5小时； 将剥去种壳的种仁放入质量浓度10%的次氯酸纳溶液中消毒处理10分钟，取出用无菌 水冲洗6次，再用无菌水浸泡48小时后，在无菌条件下取出种仁并吸干表面的水份， 剥出带有两片白色子叶的种胚，并接种在pH为5.9的MS培养基中培养24小时；将组 织培养中的种胚用250-290nm波长范围的紫外线照射24小时后，继代到含质量浓度0. lmg/L的NM、质量浓度0. lmg/L的6-BA ，且pH为5.8的培养基MS中，在温度为 30°C，光照度2000LX,光照时间12h/d的组培室内继续培育20天即可。
通过本发明方法处理的种子的后代变异率4.67%，有利变异率1.33%，后代平均种 子含油率增加5. 2%。
实施例8
将采集的成熟麻疯树种子用2. OGy/min剂量率的60Co- y射线辐射处理2小时；将 剥去种壳的种仁放入质量浓度10%的次氯酸纳溶液中消毒处理15分钟，取出用无菌水 冲洗7次，再用无菌水浸泡24小时后，在无菌条件下取出种仁并吸干表面的水份，剥 出带有两片白色子叶的种胚，并接种在PH为5.9的MS培养基中培养18小时；将组织 培养中的种胚用250-290nm波长范围的紫外线照射48小时后，继代到含质量浓度 0. 2mg/L的NM、质量浓度0. 2mg/L的6-BA ，且pH为6. 0的培养基MS中，在温度为 30°C,光照度2000LX，光照时间12h/d的组培室内继续培育20天即可。
通过本发明方法处理的种子的后代变异率1. 33%,后代平均种子含油率增加2%。
权利要求
1、一种提高麻疯树诱变率的辐射诱变复合处理方法，该方法是将成熟带壳的麻疯树种子先用60Co-γ射线辐射处理，然后取出其中的种胚在培养基中进行组织培养，其后用紫外线照射种胚，最后继代到培养基中继续培育至长出麻疯树组培苗即可移栽至大田种植。
2、 根据权利要求1所述的提高麻疯树诱变率的辐射诱变复合处理方法，该方法具 体是按以下步骤和条件进行处理(1) 用1. 0-2.0Gy/min剂量率的60Co- Y射线辐射处理1-2小时；(2) 将辐射处理后剥去种壳的种仁放入消毒液中消毒，用无菌水冲洗4-7次，再 用无菌水浸泡24-48小时后，在无菌条件下取出种仁并吸干表面的水份，剥出带有两 片白色子叶的种胚，并接种在pH为5. 8-6. 0的MS培养基中培养10-24小时；(3) 将组织培养中的种胚用250-290nm波长范围的紫外线照射24-72小时后，继 代到pH为5.8-6.0的培养基MS+生长素+细胞分裂素中，在温度为26-3CTC，光照度 2000LX,光照时间10-14h/d的组培室内继续培育10-20天即可。
3、 根据权利要求2所述的提高麻疯树诱变率的辐射诱变复合处理方法，该方法所 述的消毒液为质量浓度0.1-0.5%的氯化汞溶液或体积浓度70%乙醇溶液与质量浓度 0.1-0. 5%氯化汞溶液或质量浓度10%次氯酸钠溶液。
4、 根据权利要求3所述的提高麻疯树诱变率的辐射诱变复合处理方法，该方法中 用质量浓度0.1-0. 5%的氯化汞溶液消毒处理8-15分钟。
5、 根据权利要求3所述的提高麻疯树诱变率的辐射诱变复合处理方法，该方法中 用体积浓度70%的乙醇溶液先消毒处理20秒，然后再用质量浓度为0.1 0. 5%的氯化 汞溶液消毒处理7-IO分钟。
6、 根据权利要求3所述的提高麻疯树诱变率的辐射诱变复合处理方法，该方法中 用质量浓度10%的次氯酸钠溶液消毒处理25-30分钟。
7、 根据权利要求2-6中任一项所述的提高麻疯树诱变率的辐射诱变复合处理方法， 该方法所述的生长素为质量浓度0.1-0.2mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、吲哚乙酸或a-萘乙酸中的任一种。
8、 根据权利要求2-6中任一项所述的提高麻疯树诱变率的辐射诱变复合处理方法,该方法所述的细胞分裂素为质量浓度0.1-0. 2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤。
9、根据权利要求7所述的提高麻疯树诱变率的辐射诱变复合处理方法，该方法所 述的细胞分裂素为质量浓度0.1-0. 2mg/L的6-节氨基腺嘌呤。
全文摘要
本发明公开提高麻疯树诱变率的辐射诱变复合处理方法，该方法是将成熟带壳的麻疯树种子先用60Co-γ射线辐射处理，然后取出其中的种胚在培养基中进行组织培养，其后用紫外线照射种胚，最后继代到培养基中继续培育至长出麻疯树组培苗即可移栽至大田种植。由于本发明在充分利用60Co-γ射线核辐射对麻疯树基因组改变的基础上，通过组织培养对60Co-γ辐射进行缓冲，并选择辐射相对柔和的紫外线在种胚萌动时进行照射，因而激发了麻疯树体内的调节机制，大大提高了诱变率，使有利变异率可达1.33％，从而拓宽了麻疯树种质资源，为麻疯树高产、优质品种的选育奠定了基础。
文档编号A01H1/06GK101606485SQ20091005999
公开日2009年12月23日 申请日期2009年7月15日 优先权日2009年7月15日
发明者军 吴, 琳 唐, 莺 徐, 王胜华, 放 陈 申请人:四川大学