专利名称：油菜多目标性状重组的设计及重组产物的鉴定方法
技术领域：
本发明属于植物育种方法领域，具体涉及植物多特异性状的重组设计及重组产物的鉴定方法，以及该鉴定方法在鉴别正品油菜多性状重组体中双9号及其衍生品种中的应用。
背景技术：
农作物生产的增产、增收有赖于优良品种的选育与推广应用，而新品种的选育与适当的选育方法及携带有优良性状基因的特异资源的发掘、利用等密切相关。传统的育种技术依赖于杂交后代的自交重组，这需要有很大的分离群体、可靠的环境条件、准确的筛选技术及较长的试验周期。现代转基因技术可以对特定的植物群体进行改良，但改良的目标性状数量有限。
长期以来，物种的进化及人为操纵等使得植物形成了各自特定基因群结构。利用多个植物材料进行多目标性状重组可以满足人类生产及特定时期生活需求。当前，国内外油菜育种一直依赖来源于欧洲的双低资源。这种单一资源的利用方式使得育成品种的遗传基础变窄，从而限制了新品种(包括杂交组合)增产、增收潜力。此外，国内外油菜资源(包括育成品种)中抗(耐)倒伏及菌核病、病毒病等能力十分有限，而菌核病、倒伏等是影响油菜高产优质的重要不利因素。具有高产、优质、高抗病性、广适应性油菜品种一直为农民看好。
知识产权保护及农作物种苗市场等常常需要进行品种的鉴别。通常可用于作物品种的鉴定方法主要有利用形态学标记法、生化标记法和分子标记鉴定法等。形态学标记数量很少，易受环境影响，生化标记数量亦十分有限，且具有组织特异性，在品种数量日益增多及人们对作物产品品质要求日益严格的情况下，这两种标记的应用范围及能力日显不足。分子标记是基于物种DNA指纹特征的标记技术，它不易受环境影响，理论上数量可以是无限的。由于不同品种材料具有不同特征的指纹，因此它不仅可以用于品种的鉴别，而且可以用于品种(组合)的纯度鉴定。目前，RFLP、AFLP、SSR、RAPD、SCAR等标记技术已用于水稻、玉米、大豆等作物DNA指纹分析及品种(杂种)鉴定。
发明内容
本发明的目的是提供一种超高产、高抗病、高抗倒伏、高含油量、高蛋白质含量、低芥酸、低硫甙含量等多项性状优异的油菜新品种的重组方法及重组产物的鉴定方法。
本发明提供了一种油菜的重组设计(育种)方法，包括步骤(1)以中油821作母本，中间材料84004作父本杂交，得到杂种F1；(2)以杂种F1作母本，常规品种中双4号的变异株系作父本进行复合杂交，获得综合目标性状的基因群；(3)对综合目标性状基因群的分离世代进行品质、抗性和农艺性状的综合鉴定和筛选，获得目标性状优异的材料；(4)对早期世代表现优异的初选材料进行小孢子培养、染色体加倍和夏繁加代，使优良基因型纯合、稳定，获得油菜新品种。
本发明所述方法育成油菜品种中双9号。
本发明还提供了中双9号的鉴定方法，包括步骤(1)选取待测品种植物幼嫩组织，-70℃保存；总DNA的提取采用SDS法进行；DNA纯化采用苯酚-氯仿-异戊醇法；纯化后的DNA-20℃保存以用于分子鉴定。
(2)以待测品种DNA为模版，进行SSR鉴定，其中10对SSR引物如下上游引物5’TGG GAC GTA GTC AGT CAA CAA 3’
下游引物5’CCA AGT GCG AGA AGA GGA AG 3’；上游引物5’ACC GTT GAG ATC AAT CCC TAT 3’下游引物5’CAT CTT CCT TAA TCG AAA CCC 3’；上游引物5’TCC ATT AGC TCT CGT CCT C 3’下游引物5’TTT TTA GAA CAG TGC CTT GAC 3’；上游引物5’ATC TCA GGC TGG CGA ATA CA 3’下游引物5’CGA CAA GTC AAT CCG AAT CAA 3’；上游引物5’AAT TTA AAC CTC ATT TTC TTC 3’下游引物5’ACC TCC ATT GTG TCT GAT 3’；上游引物5’CAC CGT CGG AGT CTG AAT 3’下游引物5’GAG CCG TTAAAC C(AGCT)T AGT GTG 3’；上游引物5’ATT GGG TTC TGA CCT TTT CTC 3’下游引物5’TTT TCC TTC ATC GCT ACC AC 3’；上游引物5’TCG GGG TTT GTT GTG AGG 3’下游引物5’GAG GAG GAT GCT AAG AGT GAG C 3’；上游引物5’ACC AAA ATG TGT GAA GCC AC 3’下游引物5’CTT GTG GCC AGA TTC ATC AC 3’；上游引物5’ATT CAA ATC AAG GGT CTG GTC 3’下游引物5’GCT GCG TGC CAT CTT C3’。
PCR反应体系如下1×扩增缓冲液，2mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTPs，0.5U Taq酶，上下游引物各2.5mmol/L，50ng模板DNA，加入ddH2O(双蒸水)至终体积10μL；PCR热循环程序为95℃ 2min；1个循环；
94℃ 1min；60℃ 30s，每循环降0.5℃；72℃ 45s；10个循环；94℃ 1min；55℃ 30s；72℃ 45s；30个循环；所得扩增产物冷藏保存备用。
(3)扩增产物加等体积的变性上样缓冲液，95℃变性3min后冷却，进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；优选地，扩增产物加等体积的变性上样缓冲液，95℃变性3min后立即冷却，然后在6％的变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE，38×32.5cm)上电泳45～60min，电压1800V。
(4)电泳后的凝胶用冰醋酸溶液固定，ddH2O漂洗，再用硝酸银溶液染色，ddH2O漂洗，用无水碳酸钠溶液显色，用冰醋酸溶液终止显影，显影后的凝胶漂洗、风干备用；优选地，电泳完成后，凝胶用10％冰醋酸溶液固定30min，取出用ddH2O漂洗2次(每次5～10min)，再用0.1％硝酸银溶液染色30min，取出用ddH2O漂洗10～15s，然后用3％无水碳酸钠溶液显色，最后用10％冰醋酸溶液终止显影。显影好的凝胶经漂洗、风干，用于中双9号与其它品种的鉴别。
(5)选取中双9号植物组植，提取DNA，以中双9号DNA为模版，进行上述步骤(2)-(4)，获得中双9号的SSR扩增带型。
(6)将步骤(4)所得的待测品种的SSR扩增带型与步骤(5)所得的中双9号的SSR带型进行比较鉴定。
若10对SSR引物扩增的带型与对照(中双9号)完全相同，表明该品种为中双9号，若存在差异，则为异品种。
NCBI GENBANK中与植物芥酸合成有关的基因资源包括5个FAE基因(GeneID分别为1795811、1797097、79071、2178、170439)和160个FAE核苷酸片断序列(登录号为AJ716156、AJ716158、NM 004333、NM 024090、AY888044、AY888043等)。基因库检索和序列对比分析结果表明，中双9号品种控制芥酸合成的关键基因FAE1(GENBANK登录号为AY888037)与其它已公布的FAE基因或核苷酸片段序列的不同之处在于存在由4个碱基的缺失导致的移码突变，由此造成编码蛋白质合成提前终止，其编码蛋白质的第282位氨基酸为丝氨酸(与一般的高芥酸品种相同)，而迄今为止发现的低芥酸油菜的FAE基因都是在编码蛋白质的第282位氨基酸为苯丙氨酸。也即中双9号的芥酸合成基因FAE1序列位于5’-TTAAAGCCCCTAAAGC-3’(互补链为5’-GCTTTAGGGGCTTTAA-3’)中的GCC与CCT间缺失TGAC(互补链AGG与GGC间缺失GTCA)四个碱基。
有鉴于此，本发明还提供了另一种中双9号的鉴定方法，其特征在于，利用中双9号特有的芥酸基因(位于缺失的TGAC两端)设计引物，以鉴定、区别中双9号及其衍生品种与其他油菜品种，包括步骤(1)选取待测品种植物组织；优选地，选取待测试品种植株的幼嫩叶片，-70℃保存；总DNA的提取采用SDS法进行；DNA纯化采用苯酚-氯仿-异戊醇法；纯化后的DNA-20℃保存以用于鉴定。
(2)以待测品种DNA为模版，进行PCR反应，其中引物如下上游引物5’TTG ACA TTG TTT AGA GCC ACC CA 3’下游引物5’GAG AAG GAA CCT AGC CCT AGC ACC 3’；上游引物5’AGA GCC GTG ATT GAT GTG CTA GAG A 3’下游引物5’CCA CCC AAA CTG CAC TGT TAC ACT T 3’；上游引物5’AGC CGT GAT TGA TGT GCT AGA GAA G 3’下游引物5’CCA CCC AAA CTG CAC TGT TAC ACT T 3’；PCR反应体系含有的组分为1×扩增缓冲液，0.2mmol/L dNTPs，1U Pyrobest DNA多聚酶，上下游引物各2mmol/L，100ng模板DNA，加ddH2O至终体积50μL；PCR热循环程序为
94℃ 4min；1个循环；94℃ 30s；复性30s，复性温度根据所用引物的TM值确定；72℃ 45s；35个循环；72℃ 10min；1个循环；所得扩增产物冷藏保存备用；(3)将扩增产物进行片段测序分析，若序列中缺失TGAC(互补链缺失GTCA)四个碱基，则为中双9号或其衍生品种，否则为伪品种。
本发明与背景技术相比，具有的有益效果是建立了一种快速有效的油菜重组技术体系，并以此培育出携带有不同于欧洲双低基因、抗倒伏性和抗(耐)菌核病性明显改善的新种质材料(中双9号)；建立了客观、科学、准确的油菜品种鉴定技术体系，为保护油菜育种产权、登录新品种、鉴别和检测油菜品种的真实性、规范油菜经营市场等提供了技术保障。
图1油菜的重组设计(育种)方法流程图。
图210对SSR引物的中双9号SSR指纹图谱。
图3引物上游引物5’ATT CAA ATC AAG GGT CTG GTC 3’下游引物5’GCT GCG TGC CAT CTT C 3’检测结果，其中箭头所指为中双9号。
具体实施例方式
实施例1利用高产、稳产、抗菌核病及广适应性的高芥酸、高硫甙含量油菜品种中油821作母本，低芥酸、低硫甙、高产、抗倒、高含油量的中间材料84004作父本杂交，得到杂种F1。次年春，以上述杂种F1作母本，用低芥酸、低硫甙、高蛋白质含量、抗病毒病的常规品种中双4号的变异株系作父本进行复合杂交，获得复合杂交F1，即获得综合目标性状的基因群。对所构建的综合目标性状基因群的分离世代进行品质、抗性和农艺性状的综合鉴定和筛选，获得了一批目标性状优异的材料。同时，对早期世代表现优异的初选材料进行小孢子培养和染色体加倍并结合夏繁加代加速优良基因型的纯合与稳定。
对多个基因DH系进行综合鉴定，编号为93256的品系表现十分突出，进行多点鉴定，结果产量、品质、抗性等突出。两年平均亩产165.48kg，比对照中油821增产15.33％，达极显著水平；种子含油量41.97％，蛋白质含量32.83％，居同轮区试首位，比对照高1.55％；种子芥酸含量0.22％，商品籽硫甙含量16.65μmol/g(饼)；抗倒性、抗菌核病能力、抗病毒病能力均居参试品种第一位。定名为中双9号。
实施例2选取待测试品种植株的幼嫩叶片，提取DNA；总DNA的提取采用SDS法进行；DNA纯化采用苯酚-氯仿-异戊醇法；纯化后的DNA-20℃保存以用于分子鉴定。
以待测品种DNA为模版，进行SSR鉴定的PCR反应，其中10对SSR引物如下上游引物5’TGG GAC GTA GTC AGT CAA CAA 3’下游引物5’CCA AGT GCG AGA AGA GGA AG 3’；上游引物5’ACC GTT GAG ATC AAT CCC TAT 3’下游引物5’CAT CTT CCT TAA TCG AAA CCC 3’；上游引物5’TCC ATT AGC TCT CGT CCT C 3’下游引物5’TTT TTA GAA CAG TGC CTT GAC 3’；上游引物5’ATC TCA GGC TGG CGA ATA CA 3’下游引物5’CGA CAA GTC AAT CCG AAT CAA 3’；上游引物5’AAT TTA AAC CTC ATT TTC TTC 3’
下游引物5’ACC TCC ATT GTG TCT GAT 3’；上游引物5’CAC CGT CGG AGT CTG AAT 3’下游引物5’GAG CCG TTA AAC C(AGCT)T AGT GTG 3’；上游引物5’ATT GGG TTC TGA CCT TTT CTC 3’下游引物5’TTT TCC TTC ATC GCT ACC AC 3’；上游引物5’TCG GGG TTT GTT GTG AGG 3’下游引物5’GAG GAG GAT GCT AAG AGT GAG C 3’；上游引物5’ACC AAA ATG TGT GAA GCC AC 3’下游引物5’CTT GTG GCC AGA TTC ATC AC 3’；上游引物5’ATT CAA ATC AAG GGT CTG GTC 3’下游引物5’GCT GCG TGC CAT CTT C3’。
PCR反应体系各组分为1×扩增缓冲液，2mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTPs，0.5U Taq酶，上下游引物各2.5mmol/L，50ng模板DNA，加入ddH2O至终体积10μL；PCR热循环程序为95℃ 2min；1个循环；94℃ 1min；60℃ 30s，每循环降0.5℃；72℃ 45s；10个循环；94℃ 1min；55℃ 30s；72℃ 45s；30个循环；将扩增产物加等体积的变性上样缓冲液，95℃变性3min后立即冷却，然后在6％的变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE，38×32.5cm)上电泳45～60min，电压1800V。
电泳完成后，凝胶用10％冰醋酸溶液固定30min，取出用ddH2O漂洗2次(每次5～10min)，再用0.1％硝酸银溶液染色30min，取出用ddH2O漂洗10～15s，然后用3％无水碳酸钠溶液显色，最后用10％冰醋酸溶液终止显影。显影好的凝胶经漂洗、风干，备用。
选取中双9号植株的幼嫩叶片，提取DNA，以中双9号DNA为模版DNA，进行上述步骤，获得中双9号的SSR扩增带型。
将待测品种的SSR扩增带型与中双9号的带型进行比较鉴定。若10对SSR引物扩增的带型与对照(中双9号)完全相同，表明该品种为中双9号，若存在差异，则为异品种。
实施例3选取待测试品种植株的幼嫩叶片，提取DNA；总DNA的提取采用SDS法进行；DNA纯化采用苯酚-氯仿-异戊醇法；纯化后的DNA-20℃保存以用于分子鉴定。
以待测品种DNA为模版，进行PCR反应，其中引物如下上游引物5’TTG ACA TTG TTT AGA GCC ACC CA 3’下游引物5’GAG AAG GAA CCT AGC CCT AGC ACC 3’；上游引物5’AGA GCC GTG ATT GAT GTG CTA GAG A 3’下游引物5’CCA CCC AAA CTG CAC TGT TAC ACT T 3’；上游引物5’AGC CGT GAT TGA TGT GCT AGA GAA G 3’下游引物5’CCA CCC AAA CTG CAC TGT TAC ACT T 3’；PCR反应体系为1×扩增缓冲液，0.2mmol/L dNTPs，1U Pyrobest DNA多聚酶，上下游引物各2mmol/L，100ng模板DNA，加ddH2O至终体积50μL；PCR热循环程序为94℃ 4min；1个循环；94℃ 30s；复性30s，复性温度根据所用引物的TM值确定；72℃ 45s；35个循环；72℃ 10min；1个循环；
将扩增产物进行片段测序分析，以进行品种鉴定。
若序列中位于GCC与CCT间处缺失TGAC(互补链AGG与GGC间缺失GTCA)四个碱基的为中双9号及其衍生品种。
权利要求
1.一个油菜多目标性状重组及筛选方法，包括步骤(1)以中油821作母本，中间材料84004作父本杂交，得到杂种F1；(2)以杂种F1作母本，常规品种中双4号的变异株系作父本进行复合杂交，获得综合目标性状的基因群；(3)对综合目标性状基因群的分离世代进行品质、抗性和农艺性状的综合鉴定和筛选，获得目标性状优异的材料；(4)对早期世代表现优异的初选材料进行小孢子培养、染色体加倍和夏繁加代，使优良基因型纯合、稳定，获得油菜品种。
2.根据权利要求1所述方法，其重组筛选的产物为油菜品种中双9号。
3.一种权利要求1或2所述油菜品种中双9号的鉴定方法，包括步骤(1)选取待测品种植物幼嫩组织，提取DNA；(2)以待测品种DNA为模版，进行SSR鉴定的PCR反应，其中10对SSR引物如下上游引物5’TGG GAC GTA GTC AGT CAA CAA 3’下游引物5’CCA AGT GCG AGA AGA GGA AG 3’；上游引物5’ACC GTT GAG ATC AAT CCC TAT 3’下游引物5’CAT CTT CCT TAA TCG AAA CCC 3’；上游引物5’TCC ATT AGC TCT CGT CCT C 3’下游引物5’TTT TTA GAA CAG TGC CTT GAC 3’；上游引物5’ATC TCA GGC TGG CGA ATA CA 3’下游引物5’CGA CAA GTC AAT CCG AAT CAA 3’；上游引物5’AAT TTA AAC CTC ATT TTC TTC 3’下游引物5’ACC TCC ATT GTG TCT GAT 3’；上游引物5’CAC CGT CGG AGT CTG AAT 3’下游引物5’GAG CCG TTA AAC C(AGCT)T AGT GTG 3’；上游引物5’ATT GGG TTC TGA CCT TTT CTC 3’下游引物5’TTT TCC TTC ATC GCT ACC AC 3’；上游引物5’TCG GGG TTT GTT GTG AGG 3’下游引物5’GAG GAG GAT GCT AAG AGT GAG C 3’；上游引物5’ACC AAA ATG TGT GAA GCC AC 3’下游引物5’CTT GTG GCC AGA TTC ATC AC 3’；上游引物5’ATT CAA ATC AAG GGT CTG GTC 3’下游引物5’GCT GCG TGC CAT CTT C3’。PCR反应体系含有1×扩增缓冲液，2mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTPs，0.5U Taq酶，上下游引物各2.5mmol/L，50ng模板DNA，加入ddH2O(双蒸水)至终体积10μL；PCR热循环程序为95℃ 2min；1个循环；94℃ 1min；60℃ 30s，每循环降0.5℃；72℃ 45s；10个循环；94℃ 1min；55℃ 30s；72℃ 45s；30个循环；所得扩增产物冷藏保存备用；(3)扩增产物加等体积的变性上样缓冲液，95℃变性3min后立即冷却，进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；(4)电泳后的凝胶用冰醋酸溶液固定，ddH2O漂洗，再用硝酸银溶液染色，ddH2O漂洗，用无水碳酸钠溶液显色，用冰醋酸溶液终止显影，显影后的凝胶漂洗、风干备用；(5)选取中双9号植物幼嫩组织，提取DNA，以此为模版，进行上述步骤(2)-(4)，获得中双9号的SSR扩增带型；(6)将步骤(4)所得的待测品种的SSR扩增的带型与步骤(5)所得的中双9号的扩增带型进行比较鉴定。
4.一种权利要求1或2所述油菜品种中双9号的鉴定方法，其特征在于，利用中双9号含有特异的芥酸合成基因设计引物，通过PCR扩增及产物的序列分析，以鉴定、区别中双9号及其衍生品种与其他油菜品种，包括步骤(1)选取待测品种植物幼嫩组织，提取DNA；(2)以待测品种DNA为模版，进行PCR反应，其中引物如下上游引物5’TTG ACA TTG TTT AGA GCC ACC CA 3’下游引物5’GAG AAG GAA CCT AGC CCT AGC ACC 3’；上游引物5’AGA GCC GTG ATT GAT GTG CTA GAG A 3’下游引物5’CCA CCC AAA CTG CAC TGT TAC ACT T 3’；上游引物5’AGC CGT GAT TGA TGT GCT AGA GAA G 3’下游引物5’CCA CCC AAA CTG CAC TGT TAC ACTT 3’；PCR反应体系各组分为1×扩增缓冲液，0.2mmol/L dNTPs，1U Pyrobest DNA多聚酶，上下游引物各2mmol/L，100ng模板DNA，加ddH2O至终体积50μL；PCR热循环程序为94℃ 4min；1个循环；94℃ 30s；复性30s，复性温度根据所用引物的TM值确定；72℃ 45s；35个循环；72℃ 10min；1个循环；所得扩增产物冷藏保存备用；(3)将扩增产物进行片段测序分析，以进行品种鉴定。
全文摘要
本发明提供了一种超高产、高抗病、高抗倒伏、高含油量、高蛋白质含量、低芥酸、低硫甙含量等多项性状优异的油菜新品种的重组方法及重组产物的鉴定方法。它选用中油821和中间材料84004为亲本材料，得到的杂种F
文档编号A01H1/02GK1887060SQ200510012028
公开日2007年1月3日 申请日期2005年6月28日 优先权日2005年6月28日
发明者王汉中, 刘贵华, 郑元本, 王新发, 沈金雄, 卢长明, 杨向东, 金河成, 陈吾新, 杨庆 申请人:中国农业科学院油料作物研究所