用于器官冷藏和灌注的组合物的制作方法

专利名称：：用于器官冷藏和灌注的组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药领域，特别涉及实体器官和组织的移植。本发明提供了一种用于在低温下保存来自人和动物的供体器官和组织(特别是肝和肾)的新型灌注溶液和方法。
背景技术：
：器官移植当前被广泛应用于多种器官，例如心脏、肺、胰、肠(结肠)，特别是应用于肾和肝。对器官需求量的增长和供体器官的短缺使得等待移植的名单越来越长，由此也引起了人们对于使用亚最适供体来源器官的兴趣。对供体器官活力的保存是移植过程中一个重要的方面。从尸体获得的待移植器官必须被储存并且在医院和/或移植中心之间运输。还需要时间来检测供体和受体的组织相容性，以及对受移植患者进行准备工作。在从供体取得和移植到受体的过程中，器官需要特殊的方法保存。器官和组织在体外保存时间的长度有所不同，这依赖于器官种类、供体的年龄和健康状况、保存方法、保存溶液和温度。目前，保存大多数供体器官的标准临床方法是低体温缺血保存法。将器官用冷藏液灌洗后从尸体供体上采集得到。因此器官是无血的，血液被保存液所取代，优选的是模仿生理条件的保存液。为了替代所述器官的血和氧的支持，也为了将所述器官保存在最适条件下，有时会对器官，如肾，实施低体温保存液的机械灌注(W002/41696，US5,599,659和US5，843，024)。机械灌注使得可以提供保持器官活力的化合物和氧，也可以去除废物和有毒化合物，如代谢产物。已经表明机械灌注优于静态保存，虽然机械灌注有一些可能的缺点，比如需要特殊的设备和经过训练的人员，此外还需要用到M液。在低体温、静态条件下用于供体器官保存的最常用溶液有特别适于肝和肾保存的威斯康星大学溶液(UV)(Janssenetal，TransplantInternational2003，vol16，no7，p515-522)、用于心脏保存的Celsior以及用于肺保存的Euro-Collins或Perfadex。用于机械灌注时，已经将它们改为例如UW-葡萄糖酸(BelzerMPS)。本发明提供了一种适用于机械灌注的新的器官保存溶液，用于保持器官、器官的部分以及组织的活力。该溶液被设计为可以克服供体器官(特别是来自亚最适供体的器官，特别是来自非心跳供体的器官)的低体温机械灌注所带来的多种问题。该溶液可防止或尽量减小由缺血、缺氧、能量和营养耗竭、酸化、低体温和再灌注损伤所导致的副作用，对于用于移植目的的器官，特别是来自亚最适供体的器官，都会遇到上述的副作用。本发明的保存溶^t氨基酸、维生素、抗氧剂、高分子量添加剂提高沐"变并优化它们的平衡，以及提高緩冲能力，从而优于当前常用的保存溶液，特别适用于保存和灌注来自亚最适供体的器官。另夕卜，本发明的保存溶液具有最适的物理和化学性质，并且采用了容易获得的、价格低廉的、经过药理学测试可接受的化合物，降低了制备成本，并且有助于本发明溶液的临床准入。具体实施方式定义正常体温是在正常的生理环境下，机体、器官和/或组织的温度，对于人类，这个温度大致在341C到421C之间，优选大约371C。低体温低于生理温度，即低于34匸。对于器官保存来说，0~201C，特别是0~10"，被i人为是低体温。缺血是向肢体、器官或组织的氧供应不足，这通常是由动脉阻塞从而阻断血流所引起，但也会在将器官从供体中取出后发生，从而导致氧分压降低等等，即p(M氐于生理上可忍耐的水平，这将导致器官或肢体的组织的损伤。灌注通过或围绕器官、器官的一部分或者组织的恒定或者脉动的血流或者本发明范围内的代替血液的人工器官保存和灌注液,优选通过脉管系统进行。亚最适供体和从亚最适供体获得的器官从亚最适条件的供体，如非心跳供体、脂肪变性肝供体或者年老的供体获得的器官。在非心跳供体中，心脏不可逆地停止最少IO分钟时间(在正常体温下)，并由医师据此确认死亡。脂肪变性肝是包括30%以上脂肪变性肝细胞(即在肝细胞中积累脂肪酸)的肝脏(在所有潜在的供体中发生30%)。年龄超过60岁的供体被认为是年老的供体，但该年龄限度可延伸至甚至70岁或者更高的年龄。本申请中，"器官、组织及其部分"这一表述包括目前或将来可移植的、哺乳动物机体的所有部分。本说明书中，某些参数如渗量、温度、膨胀压等的"生理浓度"或者"生理值"是指与哺乳动物在健康状态下的生理环境中，该哺乳动物机体中该参数的生理值相仿的浓度。渗量是一种溶液通过理想半透膜(允许水自由通过而完全阻止溶质运动的膜)相对于纯水所施加的渗透压的量度。渗量与溶液中颗粒的数量有关，而与颗粒的性质无关。膨胀压在血浆中，溶解的化合物产生膨胀压。总渗透压中的一小部分是由大的蛋白质分子的存在而引起；这就M体渗透压，或者称为膨胀压。因为大的血浆蛋白质不能容易地穿过毛细血管壁，所以它们对毛细血管内部的渗透压的影响将会在某种程度上抵消掉流体漏出毛细血管的倾向。在血浆蛋白质减少的愔况下，例如由于损失于尿中(蛋白尿)或者由于营养不良，或者为移植之用M体中取出并保存于流体中的器官的情况下，低膨胀压可导致水肿一一组织中积累过多的流体。膨胀压以mmHg(亳米汞柱压强)表示。因为水可透过毛细血管壁，但较大的血浆蛋白质基本上无法透过，所以这些分子可产生渗透压。而且，因为这些蛋白质带负电，所以它们易于留住血浆其他的正离子(Gibbs-Donnan效应)，这进一步增加了血浆和间质液(ISF)之间的渗透压梯度。这些效应(渗透压效应和Gibbs-Donnan效应)的结合产生一种使水从间质流向血浆的压力。该压力被定义为胶体膨胀压(常简称为膨胀压)。该压力与血浆和ISF之间的蛋白质浓度差成正比。与纯盐水相比，人血浆产生约28mmHg的膨胀压，而ISF只有约3咖Hg。因此净膨胀压约25咖Hg。在多数毛细血管床的长度方向上，该值大致保持恒定。在本文中，緩冲液被定义为"一种物质，它存在于溶液中时可增加为引起pH的单位改变而必须添加的酸或碱的量，"。因此，緩冲液是器官保存和灌注溶液中的非常重要的组分，因为它可以维持氢离子在生理范围内的恒定浓度。通过緩冲体系，哺乳动物血液的pH保持在7.38左右，所述緩冲体系例如H2P04-"O^HPO/"，CQ2<=>H2C03,以及多种有机酸、有机碱和蛋白质。本发明的溶液中普适的、生物学上可接受的緩冲液必须具有下列属性水溶性，不干扰生物过程并且没有已知的与金属离子形成复合物的倾向，无毒并且不干扰生物膜(例如穿透、溶解、吸附于膜表面)。緩沖容量受温度以及组合物中其他溶质的影响。根据如下反应式，活性和盐效应对溶液的pH值产生显著影响pH=pKa，+1og[B]/[BH](1)其中，pKa，=pKa+校正因子溶液的离子强度定义为I=1/2￡(d.z2)其中，Ci为种类i的浓度，z为相应的电荷。它可由实验^lt非常容易地计算得出。緩沖容量为强碱或强酸的增量与pH改变的比值。B=AB/厶pH=加入緩冲溶液中的每升强碱(或酸)的克当量的微小增量与pH的改变ApH之间的比值。5=(2,3xCxKa[If])/(Ka+[Br])25-2.3Ca(l-a)C=[酸]+[盐]或者C=[碱]+[盐]单价种类的最大緩冲容量P-max在pH=pKa，，即实际pK值时出现。根据下式，可计算pH在3~11范围内的p-max:P-max=0.576c其中c为緩冲物质的总浓度。因此，可用的緩冲容量在pKa士l单位的pH范围内。如果必须实现大于最大緩冲容量的50%,那么相应的范围仅为pKa，士0.75单位。溶液的緩冲容量也可以Slykes单位表示。以slykes量度的緩冲容量被定义为滴定1克湿重肌肉/组织将其pH改变1pH单位(即pH为6到7的范围)所需碱的毫摩尔数(VanSlyke，.Biol.Chem.52，525-570,1922)。在本申请中，P被定义为改变l克组织的pH—个单位，即从6到7或者从6.5到7.5，所需要的氢氧化钠或者氯化氢的微摩尔数。组织培养基包括流体，所述流体可维持体外培养的哺乳动物细胞的生长和保存，它包括生物学上可接受的緩冲液、盐、营养物如碳源、氨基酸、养分、维生素，以模拟机体中关于pH、渗量和膨胀压的生理条件。本领用的培养基的不完全列举最小必需培养基Eagle(MEM)、Dulbecco政良Eagle培养基(DMEM)、RPMI1640培养基、DMEM/F-12培养基、HamsF-IO、HamsF12、Iscove改良Dulbecco培养基、LeibovitzL-15培养基和带有Earle盐的最小必需培养基，以及WilliamsE培养基。实施方案在第一个实施方案中，本发明提供一种基于组织培养基的器官保存和灌注溶液，它非常平衡地向器官提供足量的维生素和营养物质。许多组织培养基在本领域中已知、已有详尽记载并可从多个提供商购得。最小必需培养基Eagle(MEM)、Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、RPMI1640培养基、DMEM/F-12培养基、HamsF-10、HamsF12、Iscove改良Dulbecco培养基、LeibovitzL-15培养基和带有Earle盐的最小必需培养基，以及WilliamsE培养基(CurrentProtocolsincellbiology,www.interscience.wiley.com)可用作本发明的器官保存溶液的基础，但本领域已知的其他细胞或组织培养基也可使用。特别地，WilliamsE对于本发明的器官保存和灌注溶液来说是非常适合并优选的。组织培养基包括生理条件的盐和緩冲化合物，保持渗量和pH于生理条件，即大约300-350mOsmol和pH范围为7.O到7.8。在大多数确定成分和不确定成分的组织培养基中还提供营养物(糖、维生素、氛基酸)。本发明人发现，为了使用作器官保存溶液的组织培养基最优化，以同时适于在低温下保存和灌注器官，应该对该溶液进行一些调整和添加一些成分。已经证明，这些调整对于从一般情况下非优选的、亚最适供体获得的器官的保存和灌注来说特别有用。本发明的器官保存和灌注溶液针对低于生理温度的条件优化，并优选用于〗氐于生理温度的条件，所述低于生理温度的条件为从大约o'c到大约20€,优选在41C到IOIC之间。在较低温度下保存的器官对氧和营养物的需求减少，例如18X:时的代谢仅为大约37'C的生理温度时的代谢速率的10到15%。然而，本发明人发现，即使代谢活性较低时，营养物如葡萄糖、#^酸和维生素等仍然被消耗，应该足量提供。本发明人发现，即使在低温下和在体外人工培养基(如本发明的保存和灌注溶液)中的减弱的灌注或流动条件下，提高^J^酸和其他营养物的剂量/浓度可帮助细胞充分吸收。已经证明，提高氨基酸和维生素的浓度对于从非心跳供体获得的器官的保存来说特别有用。在一个优选的实施方案中，在WilliamsE培养基中，使下组氨基酸的浓度高于标准氨基酸浓度精氨酸、天冬酰胺、胱氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸和色氨酸。高度优化的本发明溶液的非限制实例在对比例1中给出。本发明的器官保存和灌注溶液还具有[Na+]和[K+]浓度的特定的、优化的平衡。在正常的生理环境中，细胞内[K+]浓度显著高于细胞内[Na+]浓度，而在间质腔(interstitiallumen)中情况刚好相反。本发明的器官保存和灌注溶液被配制成模拟细胞外的生理浓度，以便帮助器官、组织和细胞保持[Na+]/IT]的生理平衡，该平衡为驱动钠泵进行离子转运等过程所必需。细胞内外[Na+]和[K+]浓度的不平衡导致在质膜两侧形成了电梯度和化学梯度。这不仅对于细胞至关重要，在许多情况下，这对于跨上皮细胞层的流体和电解质的定向运动也是必不可少的。Na+-1T-ATP酶是一种高度保守的整合膜蛋白(integralmembraneprotein),它在高等生物的几乎所有细胞中表达。它为几种帮助运载体(facilitatedtransporter)提供驱动力，这些运载体可将葡萄糖、M酸和其他营养物栽入细胞中。本发明人进行的实验证实，这种转运对于低温保存和灌注器官，特别是从非心跳供体获得的器官来说是至关重要的。将钠从上皮的一侧转运到另一侧可形成渗透梯度，该梯度又驱动水分的吸收，这种现象的重要实例可见于水分吸收，例如从小肠的内腔中以4肾中。因此，重要的是，本发明的组合物模拟的细胞外[Na+]/[K+]生理平衡至少为2:1、更优选为3:1、最优选为5:1。本发明的器官保存和灌注溶液中极为优选的添加剂是高分子量化合物，以提供所需的膨胀压。可有利地用于器官保存和灌注溶液的几种高分子量添加剂在本领域中已知，例如聚乙二醇(PEG)及其改性物(US4，938，961和US5，599，659)、葡聚糖、血清蛋白如清蛋白、羟乙基淀粉(HES)以及其他高分子糖和在pH中性的溶液中带净负电荷的生物相容的聚合物。因为大的血浆蛋白质不能容易地穿过毛细血管壁，所以它们对毛细血管内部的渗透压的影响将会在某种程度上抵消掉流体漏出毛细血管的倾向。在血浆蛋白质减少的情况下，例如为移植之用从机体中取出并保存于保存流体中的器官的情况下，过4氐的膨胀压可导致水肿一一组织中积累过多的流体。这个问题需要解决，特别是对于常处于较差状态的从非心跳M获得的器官。因此，加入带负电荷的高分子量分子，以维持生理膨胀压，所述膨胀压以咖Hg(亳米汞柱压强)表示。优选地，本发明的器官保存和灌注溶液产生20到30咖Hg的膨胀压，优选大约生理水平，接近25咖Hg。在一个优选的实施方案中，将PEG用作本发明的器官保存溶液的高分子量添加剂。在一个最优选的实施方案中，使用分子量为25，000到50，OOO道尔顿的PEG，优选的浓度范围为10到50克/升，最优选在20到35克/升之间。然而，其他高分子量化合物如服S、清蛋白和葡聚糖也可有利地用于产生膨胀压，任选地与PEG结合^^用。控制pH以及防止细胞内pH升高是器官保存和灌注溶液的关鍵性质。缺血、缺氧、能量耗竭和低体温是已知导致pH水平下降的因素，并可导致待移植细胞、组织和器官的酸化。酸化是普遍认识到的对细胞和组织的危害，它会很快地使待移植的器官的状态恶化(BaicuandTaylor,2002Cryobiology45p.33-48)。特别是对于从非心跳供体获得的器官，酸化更是需要解决的问题，因为这些供体已经经历了缺血、缺氧和营养耗竭。本发明的保存溶液为解决和克服这些问题进行了优化。为了防止M在低温下并且没有或者有较少人工灌注的器官酸化，提供额外的緩冲容量是本发明的器官保存和灌注溶液的另一关键特征。尽管组织培养基具有针对大约371C的生理温度、pH7.0到7.8之间(优选地pH约7.4)的生理pH优化的生物学上可接受的緩冲液，但是出于上述原因，仍需额外的緩冲容量。本发明所提供的用于低温(OIC到20C之间)的器官保存和灌注溶液，其緩冲系统的最小容量(P)为至少20，更优选25、30、35、40、50、100到250,最优选至少30到35,以上均以Slykes单位(Slykes单位-(每改变一个pH单位，所加入的酸的毫摩尔数))度量。以slykes表示的緩沖容量(0)被定义为为使l克肌肉或组织的pH改变1pH单位(即pH为7到6的范围)所需强酸的毫摩尔数(由VanSlyke定义，JBC，1922)。强酸可为HCL，将pH从6改变为7的强碱，可4吏用NaOH。具有合适的pKa范围、可有利地用于本发明的溶液中的生物学上和生理学上可接受的緩冲液选自HEPES、PIPES、MOPS、TES、BES、N，N-二(羟乙基)甘氨酸(Bicine)、三(羟曱基)甲基甘氨酸(Tricine)、Tris、柠檬酸盐、组氨酸、KH2P04、K2HP04、NaHC03和其他磷酸盐-、杼檬酸盐-和碳酸盐-緩冲液，这些本领域中均为已知并4皮详尽记载(CurrentProtocols,WileyInterscience，2004)。HEPES是本发明的溶液中最优选的緩沖液，可提供所需的(额外的)緩冲容量，优选的浓度在1000-10000mg/L之间，最优选在2500和7500mg/L之间。器官保存液的pH值可使用Mg(0H)2、NaOH、K0H、Ca(0H)2或其组合调节至室温下7到8之间的最终pH值，优选大约7.5。不管是用于器官保存和/或灌注之前还是在其期间，都极其优选使用含氧气体混合物来使器官保存溶液发生氧合。优选使用具有高含量氧甚至纯氧的气体混合物，以便进一步有助于防止在M或灌注的器官中，器官保存溶液被C02和其他酸化源酸化。本发明的器官保存和灌注溶液的渗量优选在300到400mOsm之间，更优选在320到350mOsm的生理范围，最优选大约340mOsm。在本发明的另一个优选的实施方案中，向器官保存和灌注溶液中另外加入非透膜体(impermeant)。非透膜体是较高分子量的物质，它们不能穿过膜或者只能以很低的速率穿过膜，将它们加入后可提高渗量，而不显著改变溶液的电解质组成(例如加入盐就会改变溶液的电解质组成)。本发明的溶液中可用的非透膜体选自棉子糖、海藻糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、木糖醇、乳糖酸盐(lactobionate)和葡糖酸(结合有镁、钾或钠)。在一个优选的实施方案中，将棉子糖和海藻糖用作非透膜体，优选的浓度范围为海藻糖和棉子糖分别为1000到5000mg/L，最优选在1200和2500mg/L之间。使用的葡糖酸的浓度优选在1000到5000mg/L的范围，最优选在1200和2500mg/L之间。在本发明另一个优选的实施方案中，器官保存和灌注溶液含有能够抑制或防止氧化应激后果，特别是氧以及其他自由基活性的化合物。器官的再灌注损伤从缺血过程中的生化事件开始，导致形成氧自由基。再灌注损伤通常对于所有移植器官都是一个问题，尤其对于已经因为缺血、缺氧和营养耗竭而出现损伤的、从非心跳供体获得的器官来说，更是一个严重的问题。细胞中正常产生的自由基由以下物质除去清除剂，即能够中和自由基的化合物；以及酶，例如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、生育酚。优选加入本发明的溶液中的限制氧化应激的化合物包括但不限于次黄嘌呤、谷胱甘肽、别嘌呤醇、trolox、维生素E、亚甲蓝、抗坏血酸。本发明的溶液中优选使用谷胱甘肽、维生素E和抗坏血酸，浓度范围分别优选为谷胱甘肽0.7-1.8g/1，维生素E0.00001-0.001，抗坏血酸0.01-0.1g/1。硒是主要与作为抗氧剂的酶有关的重要元素。三种含硒酶是抗氧剂过氧化物酶，第四种含竭酶涉及甲状腺激素的产生。硒与维生素E—起，有助于产生抗体，保持心脏健康。它还有助于维持胰、肝和肾的功能，为组织提供弹性，并帮助细胞免受氧化损伤。维生素E是一种重要的脂溶性维生素。它作为抗氧剂，保护细胞膜、脂蛋白、脂肪和维生素A免受氧化破坏。它还可保护红细胞，对于神经和肌肉的正常功能也非常重要。硒是与维生素E密切合作的重要无机物。在本发明的器官保存和灌注溶液的一个优选的实施方案中，提供了硒源，以提供额外保护，免受氧化应激和再灌注损伤。已经证实，这对于从非心跳供体获得的器官以及经历缺血和缺氧的器官来说特别有利。毒性是硒比大多数营养物都严重的问题，硒的浓度要小心调节至从0.00001到0.001g/1的范围，优选从0.00003到0.0001g/1。有机和无机形式的硒可能有不同的性质。有机形式包括硒蛋氨酸、硒代半胱氨酸、M酸螯合物，并且可掺入本发明的溶液中。无机形式包括亚硒酸钠和硒酸钠，是本发明的器官保存和灌注溶液的优选的硒源。在本发明的另一方面，提供了一种*、冲洗和/或灌注器官的方法，包括使用本文公开的保存和灌注溶液在缺少血液供应的条件下保存细胞、组织和器官，防止或尽量避免在保存过程中的器官、活组织和活细胞的损伤。该溶液适用于所有可移植的哺乳动物器官，包括心脏、肺、胰和肠。在一个最优选的实施方案中，保存器官的方法涉及冷灌注和M肾和肝器官。本发明的溶液可用于从心跳供体获得的器官的移植过程，特别适用于从亚最适供体获得的器官的移植过程。优选地，保存溶液和待保存的器官置于(TC到20。C的温度范围，最优选在2n和IO"C之间。该溶液优选用于对器官的连续灌注或脉动灌注，最优选通过机械灌注。优选通过器官的脉管系统对器官进行灌注，使用器官移植(特别是人肝和肾移植)领域的技术人员公知的方法和设备。本发明的器官保存方法以及冷藏和灌注溶液的其他优点是采用了容易获得的、价格低廉的、经过药理学测试可接受的化合物，降低了制备成本，并且有助于本发明溶液的临床准入及其临床应用。图1:用于24小时MP以及60分钟再灌注的双重灌注系统。该系统包括一个贮液器，通过滚子泵将灌注溶液从贮液器泵入玻璃充氧器。氧合并除去气栓后，在热交换器中将溶液冷却或加热。经过流量探头之后，溶液通过门静脉导管灌注肝脏，通过腔静脉自由流出，ii^灌注液贮液器。在i^v贮液器之前，可提取样本用于评估肝损伤和功能。图2:使用KHB在60分钟的正常体温再灌注过程中的灌注液ALT水平。在所有时间点，MP的ALT水平都比CS低。使用POLYSOL的MP肝脏中的ALT释放量，在RP过程中的t=lO-20-30-40-60分钟时务欣于UW中的CS,使用UW-G的MP肝脏中的ALT释放量，在RP过程中的t=0-10分钟时^f氐于UW中的CS。数值(N-5)表示为平均值士SEM。图3:使用KHB在60分钟的正常体温再灌注过程中的灌注液LDH水平。显示出MP的LDH水平要比CS低。使用POLYSOL进行MP的值，在RP过程中的t-10分钟时JH氐于UW中的CS。数值(N-5)表示为平均值土SEM。图4:使用KHB在60分钟的正常体温再灌注过程中的灌注液AST水平。在24小时MP之后，AST的释放量要比UW中的CS低。使用UW-G进行MP之后的AST释放量，在t=10时显著低于U￥中的CS。使用POLYSOL进行MP之后的AST水平，在RP过程中的t=40-50-60分钟时显著低于使用UW-G进行MP。数值(N=5)表示为平均值±SEM。图5:使用KHB在60分钟的正常体温RP过程中的灌注液oc-GST水平。在使用POLYSOL进行24小时MP之后，ot-GST水平要显著低于使用UW-G进行MP。数值(N-5)表示为平均值土SEM。图6:使用KHB在60分钟的正常体温再灌注过程中的胆汁产量。使用POLYSOL进行MP之后，胆汁产量高于UW中的CS和使用UW-G进行MP。数值(N=5)表示为平均值±SEM。图7a、b、c:使用KHB在60分钟的正常体温再灌注之后的组织病理学形态a)24小时CS后窦状空间加宽("O，1-3区形成空泡(Q)，固缩和坏死区域；b)使用UW-G进行24小时MP之后窦状空间减小(—)，3区形成空泡(〇)，没有坏死；c)使用P0LYS0L进行24小时MP之后正常的窦状结构和肝细胞，没有空泡或者坏死。图8:再灌注后肝脏活组织检查样本的干/湿重比(^5)。CS组的干/湿重比(％)高于MP-UW-G组和MP-Polysol组。数值表示为平均值±SEM。图9:对大鼠肝脏进行24小时低体温MP过程中的肝酶释放量。不管是对于AST还是ALT水平，在使用UW-G进行MP过程中观察到的损伤都要多于4吏用Polysol。图10:对大鼠肝脏进行24小时低体温MP过程中的灌注液流量。在前几个小时中未观察到差异，然而在t=20小时时，使用UW-G灌注的肝脏的流量显著低于使用Polysol灌注的肝脏。图11:使用Krebs-Henseleit緩冲液对大鼠肝脏进行60分钟正常体温再灌注过程中的肝酶释放量。在MP组中观察到酶的释放量显著减少。当测量AST时，这些差异比测量ALT时更加明显。在UW-G和Polysol之间未观察到显著差异。图12:对大鼠肝脏进行60分钟正常体温再灌注过程中的灌注液流量。MP-UW-G组的流量显著低于CS-UW组和MP-Polysol组。而且，在t=45和60分钟时，Polysol组的灌注液流量显著高于CS组。图13:再灌注过程中的胆汁产量。使用Polysol进行MP之后，产生的胆汁显著多于CS和MP-UW-G。CS和MP-UW-G之间的差异不显著。图14:再灌注过程中的氨清除率和脲产量。在灌注液中加入5mM氯化铵来攻击肝脏以测试功能。MP-UW-G之后，氨清除率和脲产量显著低于Polysol。图15:再灌注过程中的乳酸盐产量。图16:使用Krebs-Henseleit緩冲液进行再灌注后的ATP含量。使用Polysol进行MP之后的ATP量高于CS和MP-UW-G。图17:肝脏活组织检查样本的组织学评分。对H&E染色的切片进行半定量评估，使用Polysol保存的肝脏的平均得分为2.4±0.3。该分数显著好于使用UW-G的CS和MP。图18:再灌注后获取的活组织检查样本的干/湿重比。使用Polysol进行MP之后的干/湿重比显著低于UW中的CS和使用UW-G的MP。实施例对比例1本发明的器官保存和灌注溶液的优选的实施方案的典型实例，与广泛使用的组织培养勤目比组分无机盐CaCl2(无水)CuSOa■5fl20Fe(N03)3'9H2OKC1MgS04(无水)MgS04-7H20MnCl2.4H20NaClWilliamsE培养基液体200.000.000.00400.00400.00200，00O，OOOl6800*00液体30.00IOO，OO100.00CL0001液体mg/L22.575*0075.000，000075720.00NaHC03NaH2P04'H20ZnS047fl20KIaOH10NHC1IN2200.00140.000.0002x1400，000.00062,65ml2,55ml其他组分葡萄糖1500.00谷胱甘肽(iE^-型)1500.002000.00亚油酸甲酯酚红衲800.0310,0025.001.842000.000.050*03IO，OO25.00900,000，0225x18.75x90.0050,0020，<3030.0040.0020.0050.0050*0015*0050*0075，0087.5015』090,00250，0030.0040.0060.0050.0050*00980.0050*0075.0087.5045,00€7,5187.59022,50304537-5037.50735.0037,5056，2533,75L-笨丙氨酸L-脯氨酸L-丝氨酸L-苏氨酸L—色氨酸L-酪氨酸L-纈氨酸25-0030,00IO，OO40，0010,0035，0050，0050,0090眉300040.00180,0035-0050*0037*5067*5022，5030,00135,002U537.50抗坏血酸d-"生物素D-泛酸钩氯化純麦角钙化醇叶酸i-肌g甲〗&，盐睃欢嗜搭DL-辨酸生育酚钠核黄素6酸維生素A维生素B122.000.501-001.500.101.002.00()01LOO1.000.010.101.000*100.2020.000.501,001.500.101.0012.000,011.001.000.031.0010*000.100.2015.000,3750.751.1250.0750.759.000，00750.750,750.02250.757,500*0750.15潘*浙MgCl2.6%KH2K)4.H20腺苷腺咪呤别嘌呤醇棉子糖海藻糖,2H20D-葡糖酸钠D-葡糖酸钾MacrogolPEG300.05731*881360-90337.0010ml/li0.501340,00680.001S3，202000,0016358*0025000.00<120<25mM<50鹏<340mosmol25mmHg7-4(K0375548.9147",001020.S7252.757*5斑1/10*3751005510.00122*401200.00ISOO，OO12268.503513-0020000.00实施例2本实施例的目的是评估使用P0LYS0L-1(实施例1中描述的本发明的器官保存溶液)对大鼠肝脏进行的机械灌注(MP),并将结果与使用POLYSOL和UW-G(这两种都与使用UW的金标准冷藏(CS)法相关)的机械灌注结果相比较。为此，保存方法和MP溶液都在从心跳供体获得的分离的灌注大鼠肝脏模型(IPRL)中评估。材料和方法动參々手,将重350g(+/—50g)的雄性Wistar大鼠(Harlan，TheNetherlands)用作肝脏供体。这些动物在标准化条件下飼养，提供12/12小时黑暗/光照周期，无限制供应水和标准pelletchow食物(HopeFarms,Woerden，TheNetherlands),直到实验之前。所有的动物处理都才艮据荷兰法规和动物保护原则进行，并经过阿姆斯特丹大学动物伦理委员会(theAnimalEthicalCommitteeoftheUniversityofAmsterdam)批准。将大鼠使用02/空气/异氟烷(1L/min:1L/min:3%)以及,内注射0.1ml/100g体重的FFM(Hypnorm/Dormicum/aquadest:1:1:2)进行麻醉。手术过程中，通过面罩吸入02/空气/异氣烷来保持麻醉。中线剖腹并向两侧肋缘下切口之后，移动肝脏，在胆管中插入0.9咖导管(B-Braun,Melsungen，Germany),在将导管插入门静脉之前，通过腔静脉以O.lml肝素(5000IU/ml，LeoPharma，Malm6，Denmark)将该动物肝素化。通过门静脉导管(0.8fr，enteralfeedingtube,Vygon，Valkenswaard，theNetherlands)以50mlRingerLactate(37XH，10cmH20,Baxter,Utrecht,theNetherlands)洗涤肝脏。在洗涤过程中，通过在腹部的腔静脉切口而放出动物血液。将0.6fr的导管(Vygon)插入肝上腔静脉，连接肝下腔静脉，清理周围组织后，切下肝脏并称重。双重机械灌注系统由MedicalTechnicalDevelopmentDepartmentoftheAcademicMedicalCenter(AMC，Amsterdam,theNetherlands)开发，该系统能够在一个装置(图1)中进行MP和再灌注(RP)阶段。在连接切下的肝脏之前，将回路用200ml无菌aquadest液洗涤，然后用50ml保存溶液洗涤。压控灌注系统包括一个贮液器，贮液器中含有400ml无菌MP溶液。将肝脏与该系统连接之后，收集最早的100ml灌注溶液。剩下的250ml溶液通过滚子泵(Ismatec，Glattbrugg，Switzerland)进行再循环。在玻璃充氧器中，使用卡波金(carbogen,95%02/5%C02，1L/min，HoekloosMedical,TheNetherlands)对灌注溶液进行氧合，使肝前(preh印atic)氧张力大约为700mmHg。在气泡捕捉器中除去系统中的气栓，然后使用热交换器(HMT-200,Heto，Breda，theNetherlands)使溶液冷却。灌注溶液经过一个线内流量表(HT-207,TransonicSystemsInc，Maastricht,theNetherlands),通过门静脉导管进入肝脏，再经肝上腔静脉导管自由流入贮液器中。沿如上所勤目同的回路进行再灌注，但这次使用第二个贮液器，该贮液器含有37'C的400mlKrebs-Henseleit緩冲液(KHB)溶液。在重新连接肝脏前，使用200ml无菌aquadest液和50mlKHB洗涤系统。重新连接肝脏后，放掉最早的100ml以防止它重新进入回路中。剩下的250ml灌注液使用卡波金进行氧合。从紧邻肝前或肝后的管处获得样本。由放置于肝下的探头(Lam6ris，TheNetherlands)"^录温度。每次操作后，洗涤回路并进行蒸汽消毒(134*C,16分钟)。錄力、妙絲錯本研究包括3个实验组1)CS-UW(N=5);2)MP-UW-G(N-5)以及3)MP-P0LYS0L(N=5)。分离的肝脏通过CS或MP保存24小时，然后进行再灌注。使用RL(4TC)洗涤后，将肝脏在原位置使用保存溶液冲洗。将CS肝脏使用50mlUW(41C)冲洗，放置于盛有IOOmlUW的无菌杯中，在冷室(41C)中融冰上保存24小时。MP肝脏在洗涤并取出后立即通过门静脉连接到灌注系统，使用100mlUW-G或POLYSOL沖洗，并在4'C下使用该溶液连续灌注24小时。M阶段结束后，所有的肝脏在37X:下^吏用氧合的KHB再灌注60分钟。絲絲冷藏时，使用威斯康星大学保存溶液(Viaspan，BristolMyersSquibb)。用于MP的冊-G溶液根据Belzer的方法制备(pH7.4，330mosmol/kg)(PienaarBHetal.，Transplantation1990:49:258-260)。MP保存溶液POLYSOL(pH7.4，330mosmol/kg)由AMC的外科实验室开发。再灌注时，使用不含牛血清清蛋白的Krebs-Henseleit緩沖液(KHB)(pH7.4，320mosmol/kg)。UW-G、POLYSOL和KHB均在我们的实验室中制备，制名—吏用的是购自下列厂商的分析试剂级别(或更好的)的化学药品Sigma-Aldrich(Zwijndrecht，TheNetherlands)，Merck(Haarlem,TheNetherlands)，Cambrex(Verviers，.Belgium),Centrafarm(Etten-Leur，TheNetherlands)和NovoNordisk(AlphenaandenRijn，TheNetherlands)。幾乙基淀粉(HES)购自Fresenius(Taunusstein，Germany),使用前，溶液通过0.45的ampul滤器(DowCorning，Allesley，UnitedKingdom)和0.22jim滤器(Millipack60，Millipore，Amsterdam,theNetherlahds)过滤除菌。^餅勿薦務辦赠在60分钟的RP过程中，每10分钟取样，用于肝细胞损伤的评估。在肝后灌注液样本中直接分析天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)和乳酸脱氢酶(LDH)来评估肝损伤(LaboratoryofClinicalChemistry,AMC，theNetherlands),使用大鼠oc-GSTELISA试剂盒(Biotrin，Dublin,Ireland)来测定a-GST(a-谷胱甘肽-S-转移酶)水平。在60分钟的RP过程中，通过监控胆汁的产生来评估肝功能。而且，在再灌注过程中还测定了表明无氧糖酵解的乳酸盐产量(LaboratoryofClinicalChemistry,AMC，theNetherlands)以及灌注液pH值(ABL，Radiometer,Zoetermeer，TheNetherlands)。逾欢夢#于/湿#^;:在RP阶段结束时，M状叶和右侧叶^C得活组织检查样本。将活组织检查样本保存于甲醛(10%)并包埋于石蜡中。石蜡切片(4pm)使用苏木精和伊红(H&E)染色，并用光学显^t镜检查。使用9个等级对肝损伤的形态学进行分类，分为等级l(好)到等级9(差)(MartinH，etal.，Cryobiology2000:41:135-144，以及TojimbaraTetal,，LiverTransplSurg1997:3:39-45)。1.正常矩形结构，2.圆形肝细胞，窦状空间增大，3.3区形成空泡，4.2区形成空泡，5.1区形成空泡，6.3区形成空泡和核固缩，7.2区形成空泡和核固缩，8.l区形成空泡和核固缩，以及9.坏死。为获得干/湿重比，肝脏活组织检查样本在再灌注后立即称重，然后保存于60'C温箱中。将活组织检查样本每隔7天再次称重，直到肝重不再减少。使用下式计算肝水肺的量1-(干重/湿重)x100%。財夢为、浙使用Kruskal卜Wallis检验法对三组数据进行总体比较。如果显示出显著性差异，则使用非参数MannWhitney检验法来评估每个组之间的差异。文中和图中的结果表示为平均值士SEM。统计学显著性定义为p<0.05。结果在各实验组之间，肝重没有显著性差异(16.53±0.53克)。在低体温MP和正常体温RP过程中，灌注压保持恒定在20cmH20(重力控制)。低体温MP过程中灌注流量最大达到1ml/min/克肝脏。正常体温RP过程中，记录到的最大流量为4ml/min/克肝脏。低体温MP过程中的氧合使得灌注液p02大约为700nimHg,在正常体温RP过程中，由于温度较高，p02大约为500咖Hg。正常体温RP过程中记录到的温度为37.13±0.41"C。#雄微与使用UW-G的MP相比，使用UW进行CS后，在24小时冷缺血时间之后ALT的釋，放量显著增高，所述释放的时间分别是t=0，(4.6±5.37vs0.4±0.55)以及t-10，(5.4±3.85vs1.4±0.55U/L)(图2)。然而，当CS-UW与MP-POLYSOL相比时，除t-0，和t=50，之外的所有时间点，MPPOLYSOL后ALT水平都显著降低。24小时CS-UW后LDH水平显示升高，但不显著。与使用UW-G或POLYSOL进行MP相比，CS-UW后t=10，时LDH显著升高(图3)。灌注液流量、pH和乳酸盐的产量没有显著差异(数据未给出)。当两种MP溶液进行比较时，24小时MP-POLYSOL后观察到的损伤较少，这表现为AST水平较低(图4X尽管在所有时间点，Polysol的趋势总是比较好，但ALT、LDH、流量、pH和乳酸盐没有显著差异。t=40时，MP-P0LYS0L后a-GST的释放量(图5)低于CS-Uf(分别为125.5±10.51和46.35±9.11，p<0.02)和MP-UW-G(分别为101.6士11.99和46.35±9.11，p<0.02)。麟,赠MP-P0LYS0L后胆汁的产量高于MP-UW-G之后或者CS-UW之后(分别为355±82.31和256±26.19和180±61.89m1)。然而，并没有达到显著性(图6)。逸欢夢对肝切片进行组织病理学评分之后，与CS-UW肝脏(4.5士0.87分)相比，使用UW-G和POLYSOL的MP组具有更好的平均得分(分别为2.0±0.55和1,6士0.40分)(对于UW-G，p=0.06;对于POLYSOL，p=0.03)。MP组之间没有显著性差异(图7)。肝切片的干/湿重比在MP.组中最高，^兌明水肿的百分比最低(图8)。百分比分别为76±1.0和72±0.5和72±0.7。潜论对于肾的临床MP,通常使用改良的威斯康星大学溶液(UW-葡糖酸盐)。通过以棉子糖替换甘露醇，该溶液被进一步改良以应用于肝脏的MP。制得的溶液已经广泛用于实验肝脏保存(KimJSetal.，TransplantProc1997:29:3452-3454，PienaarBHetal"Transplantation1990:49:258-260,SouthardJHetal.，TransplantProc2000:32:27-28)(卜3)，但不能从市场上购得。根据本发明的用于肝和肾MP的新的保存溶液POLYSOL已经过检验，它含有本发明人所认为的支持41C下被抑制的代谢所必需的营养物。虽然我们的最终目标^1保存临界状态的器官和非心跳供体的器官(这在实施例3中说明)，但我们首先在完善的心跳供体模型中测试POLYSOL,以获得基线值。在本实施例中，我们已经在心跳供体大鼠肝脏模型中展示了MP相对于CS的优点。在MP保存的肝脏中，肝细胞损伤显著减少。这可通过灌注系统的持续氧合和MP过程中持续供应营养物来解释。而且，以胆汁产量表示的肝脏功能在24小时MP后也有提高。使用P0LYS0L进行MP后导致肝细胞损伤值降低，保存后功能改善(以胆汁产量论)。我们提高了本发明溶液的緩沖容量，优化了氧自由基清除剂含量，并针对氨基酸、能量和脂肪代谢加入了特定的营养物。而且，制备的该溶液pH为7.4，但与氧合的肝脏连接后，pH降为7.2。总之，与冷藏相比，通过机械灌注来保存心跳供体大鼠肝脏可^f吏M肝脏的质量提高。与UW-G相比，使用本发明的新的、成分增加的保存溶液P0LYS0L-1进行机械灌注，可使保存肝脏的质量提高。在本实施例中使用的Polyso卜l如实施例1所定义。Polysol指的是polysol-l。实施例3本实施例的目的是比较通过使用UW进行CS、使用UW-G进行MP以及使用Polysol-l进行MP来保存非心跳供体(NHBD)大鼠肝脏。对于最适供体肝脏，选择的常规保存方法是冷藏.然而最近的研究表明，通过持续的低体温机械灌注(MP)进行保存，在保存24小时后可使肝损伤减小，肝功能增强(KimJSetal.，TransplantProc1997;29(8):3452-3454，SouthardJHetal"TransplantProc2000'，32(1):27-28，XuH.etal.,Transplantation2004;77(11):1676—1682)(4-6)。MP的优点在于向供体器官供应营养物和氧，以及能够在^过程中和植入前进行活力评估。另一个优点是NHBD器官可能复苏。这些缺血损伤的器官难以用CS保存，导致保存后肝脏损伤，并且肝功能减弱。在实验条件下，用于肝脏机械灌注的保存溶液是改良的威斯康星大学溶液UW-葡糖酸盐(UW-G)。(MarshDC,etal.，Cryobiology1989;26(6):524-534，Pie眼rBH，etal.，Transplantation1990;49(2):258-260。)该溶液含有胶体羟乙基淀粉，可导致微循环障碍，并且难以获得且价格昂贵。UW-G无法向肝脏提供足量的营养物，以维持低温(如4t:)下减弱的代谢。因此，我们基于胶体聚乙二醇，开发了本发明的新的保存溶液，以用于肝和肾的MP,该溶液含有组织培养基，组织培养基中含有足量必需的营养物以供肝脏在低温下吸收，该溶液的緩冲容量增大，抗氧化合物增多，以防止再灌注损伤，尽量避免从非心跳供体获得的器官所经历的缺血、缺氧、酸化和营养耗竭。表l:UW、UW-G和Polysol中最重要的组分<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>材料和方法參參将重275g(+/-25g)的雄性Wistar大鼠(Harlan,TheNetherlands)用作肝脏供体。这些动物在标准化条件下饲养，提供12/12小时黑暗/光照周期，无限制供应水和标准pellet食物(HopeFarms,Woerden)。所有的动物处理都根据荷兰法规和动物保护原则进行。阿姆斯特丹大学动物伦理委员会(theAnimalEthicalCommitteeoftheUniversityofAmsterdam)批准了该项动物实验。微为、妙錄絲斧通过使用UW进行CS(n=6)、使用UW-G进行MP(n=6)或者使用Polysol进行MP(n=6),将NHBD肝脏保存24小时。使用RingerLactate在37。C进行体内冲洗后，再使用低体温保存溶液(4*C)冲洗肝脏肝脏使用50mlUW、UW-G或Polysol沖洗。进行CS时，使肝脏漂浮于盛有100ml低体温UW的塑料无菌杯中，置于4X:的冷室中的融冰上。进行MP时，将肝脏与装有250ml保存溶液的再循环标准灌注设备相连接，该设备通过滚子泵从贮液器开始循环，以卡波金(95%02/5%(;02)氧合，由热交换器将流入温度降低至4度。流出的灌注液通过腔静脉收集，再重新i^贮液器。在MP以及再灌注(RP)过程中，提取样本用于评估肝脏损伤和功能。糸郝濕如实施例2。手对蕃如实施例2。欢械渗,^鍵如实施例2。用于肝细胞损伤和功能评估的灌注液样本在MP和RP过程中提取。在MP过程中，样本在t=0，1,2，22，23,24小时时每小时提取一次。在RP阶段，在60分钟的时间内每隔15分钟提取样本。在再灌注阶段结束时，使用冷冻钳(freezeclamp)从肝副叶提取用于ATP评估的肝脏样本，以便立即冷冻。还从肝尾叶和肝右叶取得肝脏样本，并在福尔马林(10%，溶于PBS)中处理。用于透射电子显微镜检查的肝脏样本从中叶获得，并保存于MacDowall溶液中。最后，从左叶提取肝脏样本用于干/湿重分析。賴郝辦海雜鄉如实施例2。源傻肝脏损伤通过对天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)进行分光光度分析来评估。在MP和RP过程中测量灌注液流量以反映血管的完整性。《教肝脏功能通过(在RP阶段)测量胆汁产量、氧消耗量、氨清除率、脲产量和ATP再生来评估。氧消耗量通过肝前和肝后的血气样本中氧张力差来测定(ABL，Radiometer,Zoetermeer，TheNetherlands)。为了观4定胆汁产量，每隔15分钟通过胆管导管来收集胆汁。为了测定氨清除率和脲产量，向肝脏施加5mM氯化铵(Sigma-Aldrich,Zwijndrecht，TheNetherlands)。在RP过程中的t--5，0，15，30，45和60分钟时提取样本。为了分析氨清除率，将样本使用磷酸盐緩冲液稀释U0x)并用0.275%的HC1酸化，然后置于水上。使用微量扩散法，以溴甲酚绿作为指示剂。以比色法分析脲产量，该分析基于丁酮肟和某些含氮化合物(如脲、甲基脲、瓜氨酸)之间的反应(Sigma-Aldrich)。ATP值在冷冻钳的生物活组织检查样本中测定，该样本在液氮中研磨，以高氯酸(14"稀释，然后加入己糖激酶和G6PD进行分析。逸织夢如实施例2，除了用于透射电子显微镜检查(TEM)的肝脏活组织检查样本(1mm)从左侧叶获取。为进行超微结构研究，活组织检查样本在McDowells固定剂中固定至少48小时。然后使用磷酸盐緩冲液(0.1M，pH7.4)冲洗，1%0s04后固定，梯度乙醇和环氧丙烷脱水。最后将样本包埋于环氧树脂(epon)中，使用ReichertUltracutE切成超薄切片(80nm),使用乙酸铀酰和柠檬酸铅进行对比染色。使用lOOkV下的PhilipsEM420研究切片；使用SISMegaviewD相机来获得图像。鍵^夢》、浙.'使用Kruskall-Wallis检验法对所有组进行比较。如果出现显著性结果，则使用非参数MannWhitney-U检验法来评估每个組之间的差异。对于氨清除率，贝'H吏用Bonferroni的post-hoc检验法对重复的测量结果进行分析。文中和图中的结果表示为平均值士SEM。统计学显著性定义为p<0.05。结果实验组内大鼠重量和肝脏重量没有发现差异。各组间再灌注温度没有差异。麟戯務,在MP过程中，在t-0、1、2和22小时时，使用UW-G时的AST释放量显著高于使用Polysol。在所有的时间点，使用UW-G时的ALT释放量显著高于使用Polysol(图la、b)。与MP-Polysol相比，MP-UW-G组中MP过程中的灌注液流量减少，导致在t=22、23和24小时时的流量较低(p=0.01)(图2)。，勿^源務与CS相比，在t=30和t=45时，MP-UW-G之后AST释放量较低(图3a)(p<0.05)。若使用Polysol,则该释放量在所有时间点均较低(p<0.005)。与CS相比，MP-Polysol的ALT释放量显示出相同的趋势(图3b)，但只有t=60时达到显著性(24.67土7.30和6.00±1.26IU/L，p=0.05)。与CS相比在t-45和60时，与MP-UW-G相比在所有时间点，使用MP-Polysol进行RP过程中的灌注液流量都有显著性优势(图4)。另夕卜，在所有时间点，CS组的灌注液流量都优于MP-UW-G组(p<0.05)。胜,颠""使用Polysol进行MP后，胆汁产量高于使用UW的CS以及UW-G的MP(分别为390士23和34士19和153士55iil/小时，p<0.01)。CS-UW和MP-冊-G之间未观察到显箸性差异(图5)。最高的氨清除率发生于使用Polysol进行MP之后，在t=15、45和60时显著优于使用UW-G,在t=15时显著优于使用CS。在所有时间点，Polysol组的脲产量都显著高于UW-G组。Polysol和CS之间没有差异，然而在t-45时，CS组的脲产量高于UW-G组(图6a、b)。在t=0和15时，使用Uf-G进行MP之后的乳酸盐产量都高于使用Polysol进行CS和MP。在较晚的时间点未观察到差异(图7)。所有组在再灌注阶段的氧消耗都相等(数据未给出)。，浙f潜果..使用Polysol进行MP之后，在再灌注阶段结束时的ATP含量显著高于使用UW进行的CS和使用UW-G进行的MP(分别为7.53±0.55和4.05士0.75和2.46±0.57jnMol/克湿重)(图8)。如图9所示对H&E染色的切片进行半定量评估，使用Polysol保存的肝脏的平均得分为2.4±0.3。该分数显著好于CS和使用UW-G进行的MP(分别为3.9±0.24和4.3±0.48)。再灌注后提取的活组织检查样本表明，使用Polysol进行MP恭萍之后，在再灌注后的干/湿重比要显著低于在UW中CS以及使用UW-G进行MP(分别为73±0.01和77±0.01和75士0.01%)(图10)。结论在本实施例中，比较了NHBD大鼠肝脏的三种保存方法当前常用的金标准，即使用UW进行的CS;使用UW-G进行的MP;以及使用本发明的新开发的MP保存溶液Polysol-1进行的MP。不管是对于肝脏损伤还是肝脏功能来说，使用Polysol-l进行MP24小时后，结果都显著好于CS和使用UW-G进行的MP。因此得出结论，使用本发明的新开发的保存溶液Polysol-1对NHBD肝脏进行24小时机械灌注，结果与在UW中冷藏和使用UW-G进行机械灌注相比，肝脏损伤更少，肝脏功能更强。在本实施例中，使用的polysol-1制剂如实施例1所定义，polysol指的是polysol-l。实施例4本研究的目的是在猪肝M模型中评估Polysol的可行性。为此，将使用Polysol的MP与使用Celsior的CS进行比较。在本实施例以及随后的实施例5和6中，^^吏用实施例1所定义的polysol-2制剂。材料和方法动參^M^辨法重35-45kg的长白(Landrace)母猪用作肝脏供体。将动物在标准化条件下，无限制供应标准实验食物和水的情况下饲养7天，以使之适应实验室环境。用于实验之前，使猪禁食一夜，可自由饮水。所有的动物处理都根据荷兰法规和动物保护原则进行。M究获得了阿姆斯特丹大学动物伦理委员会批准。麻醉前给予氯胺酮(10mg/kg)、多美康(1mg/kg)和阿托品(0.1mg/kg)之后，通过吸入02/^0和异氟烷(1-3%)来实施麻醉。进行气管内插管以控制机械通气。通过给予柠檬酸舒芬太尼(sufentanilcitrate)(20mg/L)和氯胺酮(20g/L)来保持麻醉。为了接入静脉，将导管插入耳静脉。动脉血压通过锁骨下动脉监测，并通过补液来控制。中线剖腹并将导管(0.8Fr，enteralfeedingtube,Vygon，Valkenswaard,TheNetherlands)插入胆总管之后，进行肝脏的血管分离.将腔静脉的肝下部分和肝上部分切开3-5cm,将门静脉在靠近胰脏上边界的远端切开，将肝动脉向下切开，直到脾动脉从腹腔干分出的分支点。使用250IU/kg肝素(5000IU/ml，LeoPharma，Malm6，Denmark)将猪肝素化之后，在门静脉中插入硅酮管。然后使用5L水冷的RingerLactate(乳酸根29mmol/L，Na+131咖ol/L，K+5.4,ol/L，Ca"1.8画1/L，CI—111画1/L，Baxter,Utrecht，TheNetherlands)体内冲洗肝脏,通过滚子泵(GambroInstrumentsAB，Lund,Sweden)使RingerLactate以100-200ml/min的流量流it^f脏。在该冲洗过程中，将肝脏切下放入器官保存室中.随后，将肝脏使用lL冰冷的Celsior冲洗以用于CS,或者使用Polysol冲洗以用于MP，然后使用各自的方法进行24h低体温保存。漆濕CS保存溶液Celsior(pH7.3，320mOsm/kg)是从ImtixSangstat(Lyon，France)获得的。我们的MP保存溶液Polysol是在SurgicalLaboratoryoftheAcademicMedicalCenter(Amsterdam,TheNetherlands)开发的(pH7.4，312m0smol/kg)。Polysol由Cambrex(Verviers，Belgium)生产。Krebs-Henseleit緩冲液(KHB)是在我们实验室使用购自Sigma-Aldrich(Zwijndrecht，TheNetherlands)和Merck(Haarlem,TheNetherlands)的分析纯试剂级化学药品配制而成。KHB通过0.22pm的滤器(Millipack60，Millipore，Amsterdam,TheNetherlands)来灭菌。冷Jf希錄傳温在械渗;^谈务..冲洗后，将CS组的肝脏(n-5)置于装有1L冰冷的Celsior的无菌保存室中，在4。C下保存。为进行使用Polysol的MP(n-5)，将肝脏置于4匸下的器官保存室中，该器官保存室同时也作为贮液器，可4吏灌注液与门静脉相连。Polysol通过滚子泵(200ml/min，GambroInstrumentsAB，Lund,Sweden)进行再循环，通过毛细管式氧合器(lL/min，100%医用氧，HoekloosMedical,Amsterdam,TheNetherlands)氧合至氧张力为800-1000咖Hg。Polysol在ii^肝脏之前先流经一个流量传感器(HT-207，TransonicSystemsInc，Maastricht,TheNetherlands)和一个腔内压传感器(Baxter,Utrecht,TheNetherlands),从腔静乐，流出的灌注液自由流入贮液器中。将一个温度探头(Lam6ris，Nieuwegein，TheNetherlands)置于肝门(liverhilum)中。灌注液样本从肝前获取。_z￡,傳温对錄，存,;^遂备z在24小时保存和30分钟复温之后，使用氧合的KHB进行正常体温再灌注。以与MP同样的设备进行再灌注(见上文)，但现在通过热交换器,-200，Heto，Breda,TheNetherlands)将体系加热到39X3。5&液器中装有正常体温的KHB，使用MedosHilite800充氧器(Stolberg，Germany),以卡波金(lL/min，95/5%02线，HoekloosMedical,Amsterdam,TheNetherland)使灌注液发生氧合。灌注液流量设置为大约500ml/min。分析研究在每隔15分钟取样的肝前灌注液样本(7)中，以分光光度法测定天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)和乳酸脱氢酶(LDH)水平。从灌注液流量(F，以ml/min计)和腔内压(P,以mmHg计)来计算血管内阻力(R)(R=P/F)。血管内阻力是窦状内皮细胞损伤和血管完整性的参数。母谢教在再灌注过程中，通过收集15分钟内产生的胆汁来测定胆汁产量。为了测定氨清除率和脲产量，在再灌注开始时向肝脏施加单一剂量的5mM氯化铵(Sigma-Aldrich,Zwijndrecht，TheNetherlands)。在再灌注过程中的,t-0，l5，30，45和60分钟时提取样本。为了分析氨清除率，将样本使用磷酸盐緩沖液稀銜10x)并用HC1酸化(终浓度0.45%m/v),然后置于冰上。使用一种酶促法，该方法基于由谷氨酸脱氢酶催化的、在氨、酮戊二酸和NADPH之间的反应(8)。以比色法分析脲产量，该分析基于脲与丁酮肟(Sigma-Aldrich)之间的反应(9)。以分光光度法测定灌注液样本中的乳酸盐产量。使用Radiometer血气计(Zoetermeer，TheNetherlands)来测量灌注液的pH值。使用GraphPadPrism软件的Windows下第4版(GraphPadSoftware,SanDiego，California,USA),通过非参数MannWhitney-U检验法来比较各实验组。对于氨清除率和脲产率，则使用Bonferroni的post-hoc检验法对重复的测量结果进行分析。文中和图中的结果表示为平均值±SEM。统计学显著性定义为p<0.05。结果絲.'CS组和MP组之间的猪体重没有差异(分别为41±3和37±1kg)。冲洗后CS组和MP组的肝重分别为1100±65和950±38g。平均灌注温度在两组中相似(分别为37.3±0.2和37.8±0.l'C)。使用Celsior进行CS后，AST水平显著高于4吏用Polysol进行MP(图IA)。ALT的结果与此相似(图1B)。对于LDH释放，可以发现Polysol表现更好，但结果没有显著性(图1C)。在再灌注的t=0min时，经过24小时使用Polysol的MP之后的血管内阻力显著低于使用Celsior进行的CS。当在再灌注过程中比较这些组的总体阻力时，CS组的阻力同样显著较低(分别为0.13±0.01和0.16±0.01mmHg/ml/min)。两个实验组中都没有胆汁产生。然而，所有的氨在60分钟的再灌注过程中都被清除，转化为脲(图3)。实验组间未观察到差异。在再灌注结束时，两组中都观察到高水平的乳酸盐，CS和MP组间没有差异(8.6±2.3和9.5±1.1咖ol/L)。两组中都出现pH值降低(6.9±0.1和6.8±0.1)。潜论通过新开发的机械灌注保存溶液Polysol来保存猪肝，可获得与使用Celsior的冷藏法相比，相同或更好的*质量。Polysol作为猪肝的机械灌注保存溶液看来是可行的。实施例5过去几年中，肝移植的适应证增加，而可用的供体器官却没有同步增加，导致肝移植的等候名单越来越长。在等待供体肝脏过程中，有14%的患者死亡(10)。为缩短等待名单，已经尝试了几种可选措施，包括活M肝移植、劈裂式肝移植、改变器官捐献的政治体制以及使用临界状态的供体肝脏(ll-14)。后者包括老年供体、肝纤维化或脂肪变性的供体或者非心跳供体(NHBD)(15-17)。在NHBD中，在器官切取前就已经发生循环停止。当前所选的用于保存最适的心跳供体肝的方法是冷藏法(CS)。然而最近的研究表明，通过连续低体温机械灌注(MP)来保存，在保存24小时后可使肝损伤较少，肝功能较强(18-20)。MP的优点有助于持续向供体器官供应营养物和氧，可使NHBD器官复苏。另一个优点是可在保存过程中对活力进行评估。CS对于保存缺血损伤的NHBD器官来说效果较差，这是因为在冷缺血过程中，肝损伤进一步增加，肝功能进一步降低。在临床和实验条件下，用于肝脏机械灌注的保存溶液主要是改良的威斯康星大学溶液，即UW-葡糖酸盐(UW-G)(21，22)。该溶液含有胶体羟乙基淀粉(HES)，可导致微循环障碍(23)，并且难以获得且价格昂贵。UW-G无法向肝脏提供特定的营养物，以维持肝脏在4'C下的代谢活性，尽管在该温度下代谢已经显著减弱(24)。为了克服这些缺点，我们开发了用于肝和肾的MP的新的保存溶液除了胶体聚乙二醇，它还含有肝脏所需的营养物，例如葡萄糖和氨基酸(附加1)。在前面的研究中我们已经报道，在心跳供体模型中，使用Polysol保存的肝脏质量要高于UW-G(25)。在大鼠肝脏模型中，在24小时连续低体温MP之后，使用Polysol的MP可使肝损伤较少，肝功能较强。本研究的目的是将使用UW进行CS来保存NHBD大鼠肝脏，与使用UW-G或Polysol进行MP相比较。材料和方法动#将重275g(+/-25g)的雄性Wistar大鼠(Harlan，Horst，TheNetherlands)用作肝脏供体。这些动物在标准化条件下飼养，提供12/12小时黑暗/光照周期，无限制供应水和标准pellet食物(HopeFarms,Woerden),直到开始实验。所有的动物处理都根据荷兰法规和动物保护原则进行。阿姆斯特丹大学动物伦理委员会(theAnimalEthicalCommitteeoftheUniversityofAmsterdam)批准了该项动物实验。为、妙絲#^通过使用UW进行CS(n-6)、使用UW-G进行MKn-6)或者使用Polysol进行MP(n=6)，将NHBD肝脏保存24小时。使用50mlRingerLactate(乳酸根29画1/L，Na131mmol/L，K5.4画1/L，Ca1.8画1/L，CI111画1/L，Baxter,Utrecht,TheNetherlands)在37n进行原位冲洗后，再使用低体温保存溶液(41C)冲洗肝脏，使用50mlUW、UW-G或Polysol在15mmHg压强下冲洗。进行CS时，使肝脏浸入于盛有100mlUW的塑料无菌杯中，置于41C的冷室中的融水上。进行MP时，将肝脏与装有250ml保存溶液的再循环标准灌注设备相连接。在MP以及再灌注过程中，提取样本用于评估肝脏损伤，用于评估肝脏功能的样本在再灌注过程中提取。絲叙用于CS的UW溶液从DuPont(Viaspan,pH7.4，320mOsmol/kg，Bristo卜MyersSquibb,NewYork,USA)获得。用于MP的UW-G溶液根据Belzer的方法制备(pH7.4，330mOsmol/kg)(26)。我们的MP保存溶液POLYSOL由AcademicMedicalCenter的夕卜科实验室(Amsterdam,TheNetherlands)开发(pH7.4，330mOs血ol/kg)。UW-G、Polyso卜2和Krebs-Henseleit緩冲液(KHB)均在我们的实验室中制备，制名一吏用的是购自下列厂商的分析试剂级别(或更好的)的化学药品Sigma-Aldrich(Zwijndrecht，TheNetherlands),Merck(Haarlem,TheNetherlands),Cambrex(Verviers，Belgium),Centrafarm(Etten-Leur，TheNetherlands)和NovoNordisk(AlphenaandenRijn，TheNetherlands)。HES购自Fresenius(Taunusstein,Germany),溶液通过0.45滤器(DowCorning,Allesley，UnitedKingdom)和0.22jam滤器(Millipack60，Millipore，Amsterdam,theNetherlands)过滤除菌。手叙在将大鼠以02/空气/异氟烷(1L/min:1L/min:3W麻醉。中线剖腹并向两侧肋缘下切口之后，通过腔静脉以0.1ml肝素(5000IU/ml，LeoPharma,Malm6，Denmark)将该动物肝素化。两分钟后，进行膈切除(phrenotomy)以处死该动物。血液停止流向肝脏后，开始温缺血时间(thewarmischemictime,WIT)。在WIT过程中，移动肝脏，在胆管中插入0.9咖静脉导管(B-Braun，Melsungen，Germany)。30分钟WIT后，通过门静脉导管(2.7mm，enteralfeedingtube,Vygon，Valkenswaard，TheNetherlands)以50mlRingerLactate(371C,8咖HG)冲洗肝脏。在沖洗过程中，通过切断肝下腔静脉来防止肝脏'淤血。然后在肝上腔静脉中插入2mm导管(Vygon)，连接肝下腔静脉，清理周围组织后，取出肝脏并称重。欢谢'渗;^,秀遂我们的机械灌注系统由MedicalTechnologyDepartmentoftheAcademicMedicalCenter(Amsterdam,theNetherlands)开发。在连接肝脏之前，将回路用无菌aquadest液和保存溶液洗涂。压力驱动系统(15mmHg)包括一个贮液器，贮液器中含有350ml无菌MP溶液(4t;)。将肝脏连接之后，最早的100ml溶液自由流出，不再进入系统。剩下的250ml溶液通过滚子泵(Ismatec，Glattbrugg，Switzerland)进行再循环。通过玻璃充氧器对溶液进行氧合，向器官输送超过700mmHg的氧压力。在气泡捕捉器中除去系统中的气栓，然后使用热交换器(HMT-200，Heto，Breda,theNetherlands)使溶液冷却至4n。溶液经过一个流量表(HT-207，TransonicSystemsInc，Maastricht,theNetherlands),然后通过门静脉导管进入肝脏。溶液经肝上腔静脉导管自由流回贮液器中。在30分钟的复温阶段后，使用Krebs-Henseleit緩冲液(KHB)进行再灌注，以模拟肝脏植入受体的过程。在再灌注快要开始前，加入氯化铵以进行功能测定。以与MP同样的设备进行再灌注，除了贮液器装有350mlKHB以及温度调节到371C。在连接肝脏之前，使用无菌Aquadest液和KHB洗涤系统。在连接肝脏后，同样最早的IOOml自由流出，不再进入回路。溶液通过热交换器加热，流过流量计，然后通过门静脉导管ii^肝脏。用于评估肝损伤和肝功能的样本从肝后收集。通过置于肝下的温度探头(Lameris，Nieuwegein，TheNetherlands)来效'J量肝脏温度。每次操作前后均用乙醇(700和无菌水(Aquadest)清洗系统。用于肝细胞损伤和肝功能评估的灌注液样本在MP和再灌注过程中提取。在MP过程中，样本在t=0，t=l，t=2，t=22，t-23以及t-24小时时每小时提取一次。在再灌注阶段，在60分钟的时间内每隔15分钟提取样本。在再灌注阶段结束时，使用冷冻钳(freezeclamp)从肝副叶提取用于三磷,苷(ATP)评估的肝脏样本，以便立即冷冻组织。还从肝尾叶和肝右叶取得肝脏样本，并在福尔马林(10%,溶于磷酸盐緩冲液)中处理。用于透射电子显微镜检查的肝脏样本从中叶获得，并保存于McDowells溶液中。最后，从左叶提取肝脏样本用于干/湿重分析。賴務M潔鄉肝损伤通过对天冬氨酸转氨敏AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)进行分光光度分析来评估(27)。在MP和再灌注过程中测量灌注液流量以评估徵血管的完整性。肝功能通过测量胆汁产量、氧消耗量、氨清除率、脲产量和ATP再生来评估。为了测定胆汁产量，在再灌注过程中通过胆管导管来收集胆汁。氧消耗量通过肝前和肝后的血气样本中氧浓度(niMol/L)差来测定(ABL，Radiometer,Zoetermeer,TheNetherlands),氧消耗量与灌注液流量和肝湿重有关。为了测定氨清除率和脲产量，向肝脏施加5mM氯化铵(Sigma-Aldrich，Zwijndrecht,TheNetherlands)。在再灌注过程中的t--5，t=0，t=15,t=30，t=45和t=60分钟时提取样本。为了分析氨清除率，将样本使用磷酸盐緩冲液稀释(10x)并用HC1酸化(终浓度0.45%m/v),然后置于水上。使用一种酶促法，该方法基于由谷氨^氢酶催化的、在氨、酮戊二酸和NADPH之间的反应(28)。以比色法分析脲产量，该分析基于脲与丁酮坊之间的反应(Sigma-Aldrich)(29)。ATP值在冷冻钳的生物活组织检查样本中测定，该样本在液氮下研磨，以水冷的HC104(终浓度3.5%m/v)提取。使用微量离心机在4"C下快速离心，除去沉淀的蛋白质，上清液使用2MK0H和0.3MMOPS的混合物中和到pH7。使用葡萄糖、NADP+、葡萄糖6-磷酸脱氢酶和己糖激酶，以荧光分析法测定ATP。逸欢夢将用于组织学检查的肝脏活组织检查样本保存于甲醛(10%，溶于磷酸盐緩沖液)中，包埋于石蜡中，并切成4pm的切片。使用苏木精和伊红染色后，用光学显微镜检查对切片进行评估，使用由Tojimbara和Martin改良的9个等级半定量损伤评分(31，32)。从左侧叶获取活组织检查样本用于评估干/湿重比肝脏在再灌注后立即称重。然后将这些活组织检查样本保存于6or;温箱中。将活组织检查样本每隔3~5天再次称重，直到重量不再减少。使用下式度量干/湿重比100%x(l-(干重/湿重))。为进行超微结构研究，将用于透射电子显微镜检查(TEM)的肝脏活组织检查样本(1腿3)在McDowells固定剂中固定至少48小时。然后使用Na-磷酸盐緩冲液(0.1M,pH7.4)沖洗，用1%0s04后固定，使用水冲洗，梯度乙醇(70-80-90-96-100%)和环氧丙烷脱水。最后将样本包埋于环氧树月旨(印on)中。使用ReichertUltracutE切成超薄切片(80咖)，使用乙酸铀酰和柠檬酸铅进行对比染色。使用100kV下的PhilipsEM420研究切片；使用SISMegaviewn相机来获得图像。使用Kruskall-Wallis检验法对所有组进行比较。如果出现显著性结果，则使用非参数MannWhitney-U检验法来评估每个组之间的差异。对于氨清除率脲产率，则使用Bonferroni的post-hoc枱r验法对重复的测量结果进行分析。文中和图中的结果表示为平均值土SEM。统计学显著性定义为p<0.05。结果絲平均大鼠体重和肝重分别为289±7g和14.8±0.3g(n=18)。M(Vt7J过在吵^^勿虑源務和,j^遂谅f在MP过程中，在t-0、t=l、t-2和t-22小时时，使用UW-G时的AST释放量显著高于使用Polysol。在所有的时间点，使用UW-G时的ALT释放量显著高于使用Polysol(图1A、B)。与MP-Polysol相比，MP-UW-G组中MP过程中的灌注液流量减少，导致在t-22、t-23和t=24小时时的流量较^f氐(p=0.01)(图2A)。4渗;^(^7t7J3趕#^^勿^"#務々凜^濕谅#与CS相比，在t=30和t=45分钟时，MP-UW-G之后AST释放量较低(图3A)(p<0.05)。若使用Polysol，则该释放量在所有时间点均较低(p<0.005)。与CS相比，MP-Polysol的ALT释放量显示出相同的趋势(图3B),但只有t=60分钟时达到显著性(9.7士2.4和47.2±14.2IU/L，p<0.05)。与CS相比在t-45和60分钟时，与MP-UW-G相比在所有时间点，使用MP-Polysol进行再灌注过程中的灌注液流量都显著较高(图2B)。另外，在所有时间点，CS組的灌注液流量都好于MP-UW-G组(p<0.05)。存渗a使用Polysol进行MP后，胆汁产量高于使用UW的CS以及UW-G的MP(分别为390±23和34±19和153±55^1/小时，p<0.01)。CS-UW和MP-UW-G(表l)之间未观察到显著性差异。使用Polysol进行MP后，氧消耗量在所有时间点均高于使用UW-G的MP，在t=60时高于使用UW的CS(图4)。最高的氨清除率发生于使用Polysol进行MP之后，在t=15、t=45和t=60分钟时显著优于使用UW-G，在t-15分钟时显著优于使用CS。在所有时间点，Polysol组的脲产量都显著高于UW-G组。Polysol和CS之间没有差异，然而在t-45分钟时，CS组的脲产量高于UW-G组(图5A、B)。使用Polysol进行MP之后，在再灌注阶段结束时的ATP含量显著高于使用UW进行的CS和使用UW-G进行的MP(分别为7.5±0.6和4.0±0.8和2.5±0.6jiMol/克干重)。对苏木精和伊红染色的切片的损伤进行半定量评估，使用Polysol保存的肝脏的平均得分为2.2±0.2。该分数显著好于CS和使用UW-G进行的MP(分别为3.7±0.3和4.4±0.3)。再灌注后提取的活组织检查样本表明，使用Polysol进行MP保存之后，千/湿重比要显著低于(因此组织水肿要少于)在UW中CS以及使用UW-G进行MP(分别为72.6±0.8和77.1±1.1和75.2±0.9%)。因此得出结论，使用新开发的保存溶液Polysol对NHBD大鼠肝脏进行24小时机械灌注保存，结果与在UW中冷藏和使用UW-G进行机械灌注相比，肝脏损伤更小，肝脏功能更强。在本实施例中，使用的是实施例l中所定义的polysol-2制剂。实施例6肝移植是末期肝疾病患者所选的治疗方法(33,34)。肝移植的质量与许多因素有关，其中包括保存方法以及保存时间长短，即冷缺血时间等。当前肝脏M的金标准(35)是使用适当的保存溶液冲洗肝脏，然后冷藏(CS)，使得人肝脏异体移植物可安全地保存长达16h(36)。这种情况下，在保存阶段之后就将肝脏植入受体，而对移植物的活力没有任何客观了解。缺少一种在静态冷藏的器官中，事先评估肝细胞损伤和肝功能的可靠方法。供体病史、肉^J见察和肝脏活组织检查分析只能给出冷藏的肝移植物的活力的迹象(37)。CS在保存多数腹器官的应用中已经达到了极限。作为替代方法，肝脏的机械灌注保存(MP)又一次成为了实验研究的焦点。MP已经于60年代早期得到应用(38-40)。在冲洗除去残余血液后，将肝脏与再循环机械灌注系统相连接，在该系统中，以低体温保存溶液来灌注运输中的肝脏。已推测MP相对于CS有几项优点l)持续供应氧和营养物，2)除去代谢终产物，3)保存过程中评估肝脏存活状况(41)，以及4)缺血损伤器官如非心跳供体(NHBD)器官可能复苏(42)。实验研究表明，MP后的肝脏在移植后的功能要好于CS后的肝脏(43-45)。该结果可解释为，尽管器官被冷却到41C,但仍然保持了原来代谢的7-35%(46)。该代谢虽然已经减弱，但仍能从能量底物和氧中获得益处，而能量底物和氧只能通过持续氧合的MP来提供。改良的威斯康星大学溶液(UW-葡糖酸盐UW-G)在实验MP中最为常用，它缺少用于肝脏能量、糖类和脂肪代谢的底物(47-51)。尽管论述营养物在低体温器官保存溶液中的作用的文献非常罕见(52-54)，但我们仍然推测，富含营养物的灌注溶液可使肝脏保存的质量更好。这促使我们开发了新的保存溶液Polysol,Polysol含有肝代谢所需的营养物，以及强力緩沖液和自由基清除剂。使Polysol区别于其他MP保存溶液的组分有氨基酸(如谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸和精氨酸)和维生素(如抗坏血酸和OC-生育酚)等等。^研究的目的是评估使用Polysol对大鼠肝脏进行的MP,并将结果与使用UW-G的MP的结果相比较(并将这两种都与使用冊的金标准CS法相比)。为此，保存方法和MP溶液都在分离的灌注大鼠肝脏模型(IPRL)中评估。材料和方法动參々手^将重350g(+/-50g)的雄性Wistar大鼠(Harlan,Horst,TheNetherlands)用作肝脏供体。这些动物在标准化条件下饲养，提供12/12小时黑暗/光照周期，无限制供应水和标准pelletchow食物(HopeFarms,Woerden，TheNetherlands),直到实验之前。所有的动物处理都根据荷兰法规和动物保护原则进行，并经过阿姆斯特丹大学动物伦理委员^(theAnimalEthicalCommitteeoftheUniversityofAmsterdam)批准。将大鼠使用02/空气/异氟烷(1L/min:1L/min:3%)以及,内注射0.1ml/100g体重的FFM(Hypnorm/Dormicum/aquadest:1:1:2)进行麻醉。手术过程中，通过面罩吸入02/空气/异氣烷来保持麻醉。中线剖腹并向两侧肋缘下切口之后，移动肝脏，在胆管中插入0.9mm导管(B-Braun，Melsungen，Germany).在将导管插入门静脉之前，通过腔静脉以0.1ml肝素(5000IU/ml，LeoPharma，Malm6，Denmark)将该动物肝素化。通过门静脉导管(0.8fr，enteralfeedingtube,Vygon，Valkenswaard，theNetherlands)以50mlRingerLactate(37X3,10cmH20，Baxter,Utrecht,theNetherlands)洗涤肝脏。在洗涤过程中，通过在腹部的腔静脉切口放出动物血液。将0.6fr的导管(Vygon)插入肝上腔静脉，连接肝下腔静脉，清理周围组织后，切下肝脏并称重。在嫌濟;^遂；双重机械灌注系统由MedicalTechnicalDevelopmentDepartmentoftheAcademicMedicalCenter(AMC，Amsterdam,theNetherlands)开发，该系统能够在一个装置(附加2)中进行MP和再灌注(RP)阶段。在连接切下的肝脏之前，将回路用200ml无菌aquadest液洗涤，然后用50ml^溶液洗涤。压控灌注系统包括一个贮液器，贮液器中含有350ml无菌MP溶液。将肝脏与该系统连接之后，收集最早的100ml灌注溶液。剩下的250ml溶液通过滚子泵(Ismatec，Glattbrugg，Switzerland)进行再循环。在玻璃充氧器中，使用卡波金(95%02/5%C02，1L/min，HoekloosMedical,TheNetherlands)对灌注溶液进行氧合，使肝前氧张力大约为700mmHg。在气泡捕捉器中除去系统中的气栓，然后使用热交换器(腹T-200，Heto，Breda,theNetherlands)使溶液冷却。灌注溶液经过一个线内流量表(HT-207,TransonicSystemsInc，Maastricht:theNetherlands),通过门静脉导管进入肝脏，再经肝上腔静脉导管自由流入贮液器中。沿如上所勤目同的回路进行再灌注，但这次使用第二个贮液器，该贮液器含有37"C下的400mlKrebs-Henseleit緩冲液(KHB)溶液。在重新连接肝脏前，使用200ml无菌aquadest液和50mlKHB洗涤系统。重新连接肝脏后，放掉最早的100ml以防止它重新i4^回路中。剩下的250ml灌注液使用卡波金进行氧合。从紧邻肝前或肝后的管处获得样本。由放置于肝下的探头(Lam6ris，Nieuwegein，TheNetherlands)记录温度。每次操作后，洗涤回路并进行蒸汽消毒(134*C，16分钟)。錄为、#絲絲本研究包括3个实验组1)CS-UW(N=5);2)MP-UW-G(N-5)以及3)MP-POLYSOL(N=5)。分离的肝脏通过CS或MP保存24小时，然后进行再灌注。使用RL(41C)洗涤后，将肝脏在原位置使用保存溶液沖洗。将CS肝脏使用50mlUW(4"C)冲洗，放置于盛有100mlUW的无菌杯中，在冷室(41C)中融水上保存24小时。MP肝脏在洗涤并取出后立即通过门静脉连接灌注系统，使用100ml冊-G或POLYSOL冲洗，并在4"C下使用该溶液连续灌注24小时。M阶段结束后，所有的肝脏在37匸下使用氧合的KHB再灌注60分钟。絲叙冷藏时，使用威斯康星大学保存溶液(Viaspan，BristolMyersSquibb,NewYork,USA)。用于MP的UW-G溶液根据Belzer的方法制备(pH7.4,4"C，330mosmol/kg)(55)。MP保存溶液P0LYS0L(pH7.4，4匸，330mosmol/kg)由AMC的外科实验室开发。再灌注时，使用不含牛血清清蛋白的Krebs-Henseleit緩沖液(KHB)(pH7.4，37°C，320mosmol/kg)。UW-G、P0LYS0L和KHB均在我们的实验室中制备，制备使用的是购自下列厂商的分析试剂级别(或更好的)的化学药品Sigma-Aldrich(Zwijndrecht，TheNetherlands)，Merck(Haarlera，TheNetherlands)，Cambrex(Verviers，Belgium),Centrafarm(Etten-Leur，TheNetherlands)和NovoNordisk(AlphenaandenRijn，TheNetherlands)。鞋乙基淀粉(HES)购自Fresenius(Tau謂stein，Germany),使用前，溶液通过0.45jim的ampul滤器(DowCorning，Allesley，UnitedKingdom)和0.22jnm滤器(Millipack60,Millipore，Amsterdam,theNetherlands)过滤除菌。一餅勿詹资辦赠..在60分钟的RP过程中，每10分钟取样，用于肝细胞损伤的评估。在肝后灌注液样本中直接分析天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)和乳酸脱氢酶(LDH)来评估肝损伤(LaboratoryofClinicalChemistry,AMC，theNetherlands)(56)。使用大鼠ot-GSTELISA试剂盒(Biotrin，Dublin,Ireland)来测定oc-GST(a-谷胱甘肽-S-转移酶)水平。在60分钟的RP过程中，通过监控胆汁的产生来评估肝功能。而且，在再灌注过程中还测定了乳酸盐产量(LaboratoryofClinicalChemistry,AMC，theNetherlands)以及灌注液pH值(ABL，Radiometer,Zoetermeer，TheNetherlands)。逸欢穸和f/湿,竑在RP阶段结束时，从尾状叶和右侧叶取得活组织检查样本。将活组织检查样本保存于曱醛(10%)并包埋于石蜡中。石蜡切片(4pm)使用苏木精和伊红(H&E)染色，并用光学显微镜检查。使用9个等级对肝损伤的形态学进行分类，分为等级l(好)到等级9(差)(57,58)。1.正常矩形结构，2.圆形肝细胞，窦状空间增大，3.3区形成空泡，4.2区形成空泡，5.1区形成空泡，6.3区形成空泡和核固缩，7.2区形成空泡和核固缩，8.1区形成空泡和核固缩，以及9.坏死。为获得干/湿重比，肝脏活组织检查样本在再灌注后立即称重，然后保存于60'C温箱中。将活组织检查样本每隔7天再次称重，直到肝重不再减少。使用下式计算肝水肿的量l-(干重/湿重)x100%。财夢》、浙使用Kruskall-Wallis检验法对三组数据进行总体比较。如果显示出显著性差异，则使用非参数MannWhitney检验法来评估每个组之间的差异。文中和图中的结果表示为平均值土SEM。统计学显著性定义为p<0.05。结果在各实验组之间，肝重没有显著性差异(16.5±0.5克)。在低体温MP和正常体温RP过程中，灌注压保持恒定在20cmH20(重力控制)。低体温MP过程中灌注流量最大达到1ml/min/克肝脏。正常体温RP过程中，记录到的最大流量为3ml/min/克肝脏。低体温MP过程中的氧M得灌注液p02大约为700咖Hg，在正常体温RP过程中，由于温度较高，p02大约为500咖Hg。正常体温RP过程中记录到的温度为37.1±0.4*C。与使用UW-G的MP相比，使用UW进行CS后，在24小时冷缺血时间之后ALT的释放量显著增高，所述释放的时间分别是tH)min(4.6±2.4和0.4±0.2IU/L)以及t=10min(5.4士1.7和1.4±0.2IU/L)(图1A)。然而，当CS-UW与MP-POLYSOL相比时，除t=0min和t-50min之外的所有时间点，MP-POLYSOL后ALT水平都显著降低。24小时CS-UW后LDH水平显示升高，但不显著。与使用W-G或POLYSOL进行MP相比，CS-UW后t=10min时LDH显著升高(图1B)。灌注液流量、pH和乳酸盐的产量没有显著差异(数据未给出)。当与两种MP溶液相比时，24小时MP-POLYSOL后观察到的损伤较少，这表现为AST水平较低(图1C)。尽管在所有时间点，Polysol的趋势总是比较好，但ALT(图1A)、LDH(图1B)、灌注液流量、pH和乳酸盐产量(数据未给出)没有显著差异。t-40min时，MP-POLYSOL后a-GST的释放量(图2)低于CS-UW(分别为125.5±10.51和46.4±9.1，p<0.02)和MP-UW-G(分别为101.6±12.0和46.4±9.1，p<0.02)。，雄潔MP-POLYSOL后胆汁的产量高于MP-UW-G之后或者CS-UW之后(分别为355±82,3和256±26.2和180±61.99yl/h)。然而，并没有达到显著性(图3)。逸欢夢对肝切片进行组织病理学评分之后，与CS-UW肝脏(4.5±0.9分)相比，使用UW-G和POLYSOL的MP组具有更好的平均得分(分别为2.0±0.6和1.6±0.4分)(对于UW-G，p=0.06;对于POLYSOL,p=0.03)。MP组之间没有显著性差异(图4)。肝切片的干/湿重比在MP组中最高，说明水肿的百分比最低(图5)。百分比分别为76±1.0和72±0.5和72±0.7。总之，与冷藏相比，通过机械灌注来保存心跳供体大鼠肝脏可使M肝脏的质量提高。与UW-G相比，使用新的、成分增加的保存溶液POLYSOL-2进行机械灌注，可使保存肝脏的质量相同或提高。在本实施例中使用的Polysol-2制剂如实施例1所定义。Polyso1指的是polysol-2。参数文献列表1.KhnJSBoudjemaD'AlessandroA，SouthardJH.Machineperfusionofthelivenmdntenanceofmitochondrialftinctionafter48-hourpreservation,TransplantProc1997:29:3452-3454.2.FienaarBH，lindellSL，V朋Gu股T，SouthardJH，BdzerFO.Sev啤-two-hourpreservationofthecani加liverbymachineperfiiskm.Transplantation1990:49:258-260,3.SouthardJH,LindellS,AmetaniM，RicherJP，VosAW.Kupffo*cellactivationinliverpreservation:coldstoragevsmachineperfusion.TransplantProc2000:32:27-28.4.KimJS，BoudjemaD，AkssandroA，SouthardJH.Machinepo"ftisionoftheliver:maintenanceofmitochondrialfimctbnafter48-hourpresCTvatioiLTransplantftoc1997:29:3452-3454.5.SouthardJH,LindellS，Ame加iM，RicherJP,VosAW.Kupflfercellactivatkminliv红preservation:coldstoi^evsmachineperfusion.TransplantProc2000:32:27-28*6.XuH，LeeCY，Clem咖MG，ZhangJX.Pronloiigedhypothermicmachineperfiiskmjpr欲rveshepatocellularfiinctkmbutpotentiatesendothelialcelldysftmctioninmtlivers.TKmspl幼tation2004:77:16764682.7.BergmeyerHU,St旭dardizatkmofenzymeassays.CMnCh咖1972:18:1305-13U.8.F加seca-WollheimF.[Diiectdet^minationofplasmaammoniawithoutdqoteinizatioiit.Animprovedenzj^nicdeteiminationofammoiiHn(犯thor'stransl).Z幻inChemKlinBfochem1973:11:426431.9.CrockerCL.Rapiddeterminationofur幼ni加geninserumotplasmawithoutdeproteinizatioii.AmJMedTechnol1967:33:361-365.10.UnitedNetworkforOrganSharing.Lanc改2003:340:1373-1376.11.GridelliB，SpadaM，拘tzWetal.Split-livertransplantationeliminatestheneedforliving-donorKvertraiKpl節tationinchildreDwithend-stagecholestaticliverdisease.Transplantation2003:75:1197-1203-12.Neub^gerJM，LuceyMR.Living-relatedliverdonation:theinevitabledonordea也shighlightedtheneedforgreatertransparency.Transpl油tatkm2004:77:489-490.13.NunezA，Go<K%)astorSE，GossJA，WashburnWK^HalffGA.Enlargementofthecadaveric-liverdo加rpoolusingin-situsplit-liv改transplantetiondespitecomplexhepaticarterialanatomy.Transplantation2003:76:1134-1136.14.OtteJB.Donorcomplicationsandoutcomesinlive-livertransplantation.Transpantetion2003:75:1625-1626.i5.FukumoriT，KatoT，IxviDetal.Useofoldercontrollediion-heart-beatingdo加rsfiwlivertransplantation,Tmn^plantetion2003:75:1171-1174.16.OhSanfeyHA，PelletierSJ,SawyerRG，McCulloughCS，PraettTL.Iirplicationofadvanceddonoragecmtheoutcomeoflivertransplantetion.ClinTransplant2000:14:386-3卯.17.VerranD，KusykT,PainterDetal.Clinicalexperiencegainedfromtheuseof120欲eatoticdonorliv鹏fororthotopiclivertran印kntetioiLLiverTranspl2003:9:500-505.18.KimJS,BoudjemaKjD'AlessaodroA,SouthardJH,MachineperAisionoftheliver:maintenanceofmitochondrialfimctkmaiter48-hourpreservation.Tr幼spl肌tPmc1997:29:3452-3454.19.SouthardJH，LindellS,AmetaniM，RicherJP，VosAW.Kupffercellactivatioiiinliverpre幼rvatkra:coldstoragevsmachineperfusion.TransplantProc2000:32:27-28.20.H,LeeCY，demensMG，Zh加gUCPronl加gedhypothermicmachineperfosionpreserveshepatocellularfimctionbutpotentiatesendothelialcelldysftoictkminratlivers.Txa啤lantation2004:77:1676-1682.21.MarshDC,LindellSL,FoxBelzerFO，SouthardJH.Hypothermicpreservationofh邻atocytes.LRoleofcellswelling.Ciyobiology1989:26:524-534.22.PienaarBH，LindellSL,VanGulikT，SouthardJH，Bel微FO.Seventy-two-hourpreservationofthecanineliverbymachineperfiisi肌T咖splantotion1990:49:258掘.23.MorariuAM，VdP入OeverenVet^1.HyperaggregatingeffectofhydroxyethylstarchcomponentsandUniversityofWisconsinsolutionoahumanredbloodcells:ariskofimpairedgraftperfiiskminorganprocurementTransplantation2003:76:3743.24.RuWnskyB,Mndplesoflowtemperaturecellpreservation.HeartFaUTRev2003:8:277-284.25.BessemsM，DoorschodtBM^vanVHetA.KL，VanGulikT.ImprovedratliverpreservationbyhypothermiccontinuousmacW加perfusion腿itigPolysolanew,enrichedpreservatkmsolution.LiverTranspl2005:11:539-546.26.PienaaiBH，LindeUSL，VanGuHkT，SouthardJH，BelzerFO.Seventy-two"hourpieseavationofthecani加Kv枕bymachineperfiision.Transplantation1990:49:258-260,27.B改gmeyerHU.Standardirationofenzymeassays.ClinChem1972:18:1305-1311,28.Fonseca-WollheimF.[DirectdeterminationofplasmaammoniawithoutZOnCh咖KlinBiochem1973:11:42"31.29.CrockerCL.Rapiddbterminatkmofureanitrogeninsmimorplasmawithoutd邻rotei11i2ati(m,AmJMedTechnol1967:33:361-365.30.Willia咖cmJR，CorkeyBE.Assayofcitricacidcycleintermediates幼drelatedcon^ounds-updatewithtissuemetabolitelevelsandintracellulardistribution.MethodsEnzymol1979:55:200-222.31.MartinH，Boumiq股B，SarsatJP，AlbaloiejoV，Lerche-LangrandC.Cryopreservedratliverslices:acriticalevaluationofceMviability,histologicalintegrity,抑ddrag-咖tebolizii^enzymes.Ciyobiology2000:41:135-144.32.TojimbaiaT,WicombWN，Garcia-KennedyRetaLLivertransplan祖tionftcmi加n-heartbeatingdo加rsinrate:influenceofviscosityandteiqperatureofinitialflushingsolutb加o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通过对氨基酸、维生素、抗氧剂、高分子量添加剂提高浓度并优化它们的平衡，以及提高缓冲能力来实现。文档编号A01N1/02GK101098622SQ200580046317公开日2008年1月2日申请日期2005年11月11日优先权日2004年11月12日发明者B·M·多尔肖特,M·贝西姆斯申请人:多尔灿德气动股份有限公司