耐受胁迫的棉花植物的制作方法

专利名称：耐受胁迫的棉花植物的制作方法
如下发明涉及修饰的棉花植物，其具有比相应未修饰的棉花植物对不利生长条件尤其非生物性胁迫条件的更高抗性，其中所述不利生长条件例如但不限于低温或高温、干旱、高光照强度、化学污染、洪水、高盐度、高光照强度、高UV辐射。此类耐胁迫棉花植物可以通过降低，尤其在胁迫条件下降低棉花内源性parp2基因的表达，通过修饰棉花内源性parp2基因的活性，通过将棉花内源性parp2基因与提供更好胁迫耐性的parp2基因的另一个等位基因交换，或通过其任意组合而获得。
相关技术领域描述聚ADP核糖聚合酶(PARP)，又称作聚ADP核糖转移酶(ADPRT)(EC2.4.2.30)，是一种存在于大多数真核生物内的细胞核酶，其中所述真核生物包括脊椎动物、节肢动物、软体动物、黏菌、甲藻、除酵母之外的真菌和其它低等真核生物。酶活性还已在多种植物中得到证实(Payne等，1976；Willmitzer和Wagner，1982；Chen等，1994；O′Farrell，1995)。
PARP催化源自NAD+的ADP-核糖部分主要转移至靶蛋白中的谷氨酸羧基，并且随后发生ADP核糖聚合作用。主要的靶蛋白是PARP自身，不过也已证实组蛋白、高速泳动族(high mobility group)染色体蛋白质、拓扑异构酶、内切核酸酶和DNA聚合酶也显示受到这种修饰。
来自动物的PARP蛋白是113-120kDa的核蛋白，在大多数细胞类型中含量丰富，其由三个主要功能域组成含有两个锌指结构域的氨基端DNA结合结构域、羧基端催化结构域和受到自我修饰(auto-modified)的内部结构域(de Murcia和Ménissier de Murcia，1994；Kameshita等，1984；Lindahl等，1995)。体外(in vitro)酶活性在酶结合至DNA中的单链断口时明显提高。体内(in vivo)活性由最终引起DNA断裂的条件诱导(Alvarez-Gonzalez和Althaus，1989；Ikejima等，1990)。中央结构域的自我修饰似乎起到负反馈调节PARP的作用。
植物细胞中的PARP活性首先由检测来自标记NAD+的3H掺入根尖细胞的细胞核加以证实(Payne等，1976；Willmitzer和Wagner，1982)。酶活性还从玉米幼苗中得以部分纯化并且发现与表观分子量113kDa的蛋白质相关，这提示植物PARP可能与来自动物的这种酶相似(Chen等，1994；O′Farrell，1995)。
Chen等(1994)报道了玉米细胞核内的PARP活性并且将这种酶活性与玉米细胞核的提取物中存在的大约114kDa蛋白质相关联。
O′ Farrel(1995)报道在分离自玉米的RNA上开展的RT-PCR扩增(使用基于最高度保守序列的简并引物)产生300bp的片段，其在氨基酸水平显示与人PARP蛋白60％的同一性。
Lepiniec等(1995)已经分离并克隆来自拟南芥菜(Arabidopsisithaliana)的全长cDNA，其编码与脊椎动物PARP的催化结构域具有高度相似性的72kDa蛋白质。该蛋白质的氨基端结构域未显示与来自脊椎动物的PARP相应结构域的任何序列相似性，但是由与多种核蛋白和DNA结合蛋白的氨基端显示相似性的四段氨基酸序列(称作A1、A2、B和C)组成。A1和A2的预测二级结构是螺旋-环-螺旋结构。
Mahajan和Zuo(1998)描述了玉米聚(ADP)核糖聚合酶的纯化和cDNA克隆。该酶是由2943bp可读框编码的大约115kD(980个氨基酸)的单链多肽。推导的氨基酸序列显示对已知脊椎动物PARP序列40至42％的同一性以及大约50％的相似性。PARP分子的模块结构特征如两个锌指、推测的核定位信号、自我修饰结构域和NAD+结合结构域在这种玉米酶中保守。
Babiychuk等(1998)描述在植物中发现两种聚ADP核糖聚合酶同系物，为典型的含锌指聚合酶和缺乏特征性氨基端锌指结构域的结构不典型的PARP蛋白。
目前的命名将典型的含锌指聚合酶称作PARP1蛋白(以及相应的parp1基因)，而结构不典型的PARP蛋白目前称作PARP2(以及相应的parp2基因)。
可以确定如下数据库项，其显示已实验性证实的和推测的聚ADP核糖聚合酶蛋白序列、其部分或同源序列BAD53855(稻(Oryza Sativa))；BAD52929(稻)；XP_477671(稻)；BAC84104(稻)；AAT25850(玉米(Zeamays))；AAT25849(玉米)；NP_197639(拟南芥菜(Arabidopsis thaliana))；NP_850165(拟南芥菜)；NP_188107(拟南芥菜)；NP_850586(拟南芥菜)；BAB09119(拟南芥菜)；AAD20677(拟南芥菜)；Q11207(拟南芥菜)；C84719(拟南芥菜)；T51353(拟南芥菜)；T01311(拟南芥菜)；AAN12901(拟南芥菜)；AAM13882(拟南芥菜)；CAB80732(拟南芥菜)；CAA10482(拟南芥菜)；AAC79704(玉米)AAC19283(拟南芥菜)；CAA10888(玉米)；CAA10889(玉米)；CAA88288(拟南芥菜)。
Amor等(1998)描述PARP在植物中参与氧胁迫应答。作者证实在培养的大豆细胞中，PARP通过介导DNA修复和程序性细胞死亡过程分别参与对温和的和严重的非生物性胁迫的应答。
WO 99/37789描述了用于影响植物细胞代谢状态的组合物和方法。组合物包含聚ADP核糖聚合酶基因及其部分，尤其是玉米聚ADP核糖聚合酶基因以及用于聚ADP核糖聚合酶基因的反义核苷酸序列。发现了该核苷酸序列在转化植物细胞以改变所转化的植物和植物细胞的代谢状态中的用途。
WO 00/04173描述通过导入影响内源性聚ADP核糖聚合酶(PARP)基因表达和/或表观活性的调节PCD的嵌合基因在真核细胞和生物，尤其植物细胞和植物中调节程序性细胞死亡(PCD)的手段和方法。程序性细胞死亡可以受到抑制或激发。本发明尤其涉及编码具有PARP活性的蛋白质的核苷酸序列的用途，用于调节PCD、用于增强生长速率或用于产生耐受胁迫的细胞和生物。
现有技术因此在提供用于修饰棉花内源性PARP基因以得到抗胁迫棉花植物的特定棉花PARP基因方面有缺陷。
发明概述本发明的一个方面是产生耐受胁迫的棉花植物的方法，包括以下步骤将嵌合基因导入棉花细胞以产生转基因的棉花细胞，该嵌合基因包含有效连接的植物可表达启动子；包含第一DNA区域和第二DNA区域的可转录DNA区域，其中第一DNA区域包含20个连续核苷酸中至少19个的核苷酸序列，所述的20个连续核苷酸选自棉花物种或与棉花祖先物种相关的物种parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列；第二DNA区域包含选自第一DNA区域中至少19个或50个或200个连续核苷酸的核苷酸序列；其中第一DNA区域和第二DNA区域彼此处于反向重复的方向并且其中转录自可转录区域的RNA分子能够在转录自第一DNA区域的RNA区域和转录自第二DNA区域的RNA区域之间形成双链RNA区；和包含在植物中有功能的转录终止和聚腺苷酸化信号的DNA区域；将转基因棉花细胞再生以得到转基因棉花植物；以及例如使用纤维组织培养试验法，使用冷萌发测定法，通过测定任一活性氧类、NAD或ATP的浓度或通过任何其它胁迫测定法鉴定比非转化棉花植物更抵抗非生物性胁迫条件的转基因棉花植物。parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列可以包含任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No18、SEQ ID No.19或SEQ IDNo.20的核苷酸序列或编码包含氨基酸序列SEQ ID No13、SEQ ID No21或SEQ ID No22的蛋白质或其变体的核苷酸序列。
本发明的另一个目的是提供产生耐受胁迫的棉花植物的方法，包括以下步骤向棉花植物的细胞提供一种或多种双链RNA分子，其中双链RNA分子包含两条RNA链，一条RNA链基本上由选自棉花物种或与棉花祖先物种相关的物种parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列中20至21个连续核苷酸的RNA核苷酸序列组成；以及鉴定比不包含该双链RNA分子的相同棉花植物更抵抗非生物性胁迫条件的包含该双链RNA分子的棉花植物。双链RNA可以通过嵌合基因整合入细胞的基因组而提供给细胞，该嵌合基因包含处于反义方向或有义方向的有效连接至植物可表达启动子的DNA区域，该DNA区域包含选自棉花物种或与棉花祖先物种相关的物种parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列中至少20个连续核苷酸，和包含在植物中有功能的转录终止和聚腺苷酸化信号的DNA区域。parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列可以包含任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No18、SEQ ID No.19或SEQ ID N0.20的核苷酸序列或编码包含氨基酸序列SEQ ID No13、SEQ ID No21或SEQ IDNo22的蛋白质或其变体的核苷酸序列。
本发明的又一个目的是提供鉴定棉花parp2 DNA片段的方法，包括以下步骤提供能够自棉花物种如陆地棉(Gossypium hirsutum)、海岛棉(Gossypium barbadense)、树棉(Gossypium arboreum)或草棉(Gossypiumherbaceum)或者自棉花祖先物种相关的棉花物种如雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)、三裂棉(Gossypium trilobum)、拟似棉(Gossypiumgossypioides)得到的基因组DNA或cDNA；选择如下的手段用作探针的DNA片段，其包含编码氨基酸序列SEQ ID No13的核苷酸序列；用作探针的DNA片段，其包含任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ IDNo12、SEQ ID No18、SEQ ID No19或SEQ ID No 20的核苷酸序列；用作探针的DNA片段或寡核苷酸，其包含由选自编码氨基酸序列SEQ IDNo13、SEQ ID No21或SEQ ID No22的核苷酸序列中20至1328个连续核苷酸组成的核苷酸序列；用作探针的DNA片段或寡核苷酸，其包含由选自任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ IDNo18、SEQ ID No19或SEQ ID No 20的核苷酸序列中20至1328个连续核苷酸组成的核苷酸序列；寡核苷酸序列，其具有包含选自编码SEQ IDNo13、SEQ ID No.21或SEQ ID No22的氨基酸序列的核苷酸序列中20至200个连续核苷酸的核苷酸序列；用作PCR反应中引物的寡核苷酸序列，其具有包含选自任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ IDNo8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQID No18、SEQ ID No19或SEQ ID No20的核苷酸序列中20至200个连续核苷酸的核苷酸序列；或用作PCR反应中引物的寡核苷酸序列，其具有任一SEQ ID No1、SEQ ID No2、SEQ ID No3或SEQ ID No4、SEQ IDNo16或SEQ ID No.17的核苷酸序列；并且利用这种手段，通过使用基因组DNA或cDNA和引物实施PCR或通过使用基因组DNA或cDNA和探针实施杂交而鉴定片段。所鉴定的片段随后可以得到分离并且用于获得耐受胁迫的棉花细胞。
本发明还提供鉴定与增加的胁迫耐性有关的棉花parp2等位基因的方法，包括以下步骤提供不同的棉花植物品系或与棉花祖先植物相关的植物品系的群体，任选地是经诱变群体；根据权利要求21所述的方法鉴定群体中每一植物品系的parp2等位基因；分析群体中每一植物品系的胁迫抗性并鉴定这些棉花植物品系，以及将植物品系中增加的胁迫抗性与存在特定parp2等位基因相关联。棉花parp2等位基因可以导入选择的棉花植物品系以得到耐胁迫植物。
还提供鉴定抗胁迫棉花植物的方法，包括如下步骤自棉花植物起始纤维组织培养物；使纤维组织培养物受到胁迫条件处理，如提高的温度，优选在45℃至50℃的范围，持续所选的时间期限，优选在2至4小时范围内；并且将培养物中的纤维起始或延伸与从对照植物起始并受到胁迫条件处理的培养物中的纤维起始或延伸进行比较。
本发明又一个目的是提供分离的DNA片段，其编码包含氨基酸序列SEQ ID No13、SEQ ID No20、SEQ ID No21或SEQ ID No15的蛋白质或包含选自任一核苷酸序列SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ IDNo12、SEQ ID No18、SEQ ID No19或SEQ ID No20的核苷酸序列。
本发明还提供包含以下有效连接的DNA片段的嵌合基因植物可表达启动子；包含处于有义方向的第一DNA区域和处于有义方向的第二DNA区域的可转录DNA区域，其中所述第一DNA区域包含选自棉花物种或与棉花祖先物种相关的物种parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列中至少20个连续核苷酸，其中所述第二DNA区域包含选自棉花物种或与棉花祖先物种相关的物种parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列的至少20个连续核苷酸，其中通过可转录DNA区域转录所产生的RNA分子能够通过对应于第一DNA区域的RNA区域和对应于第二RNA区域的RNA区域间的碱基配对形成双链RNA区；和在植物中有功能的转录终止和聚腺苷酸化信号的DNA区域。嵌合基因还可以包含植物可表达启动子；DNA区域，其包含处于有义方向或反义方向的选自来自棉花物种或来自与棉花祖先物种相关的物种parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列中的至少20个连续核苷酸，以及包含在植物中有功能的转录终止和聚腺苷酸化信号的DNA区域。
本发明还提供包含此类嵌合基因的棉花植物细胞以及基本上由此类棉花植物细胞组成的棉花植物，以及其种子。
本发明还涉及编码包含氨基酸序列SEQ ID No13、SEQ ID No.21、SEQ ID No22或SEQ ID No15的蛋白质的核苷酸序列或其包含至少20个连续核苷酸的部分的用途，或涉及任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No18、SEQ ID No19或SEQ ID No20的核苷酸序列或其包含至少20个连续核苷酸的部分的用途，以增加棉花植物的胁迫耐性；涉及鉴定在棉花物种如陆地棉、海岛棉、树棉或草棉中或来自与棉花祖先物种相关的棉花物种如雷蒙德氏棉、三裂棉和拟似棉中的parp2基因或parp2 cDNA；涉及鉴定在棉花物种如陆地棉、海岛棉、树棉、或草棉中或来自与棉花祖先物种相关的棉花物种如雷蒙德氏棉、三裂棉和拟似棉中耐受胁迫的parp2等位基因或涉及在棉花物种中导入耐受胁迫的parp2等位基因。
随着此后将变得显而易见的本发明前述以及其它的目的、优势和特征，本发明的本质可以通过参考如下本发明不同实施方案地详细描述、所附权利要求书和图得到更清楚地理解。
附图简述


图1是T-DNA载体pTMT01的示意图，其包含一旦转录即产生能够减少棉花PARP2基因表达的双链RNA分子的嵌合基因。使用如下缩写LB左T-DNA边界；3’nos来自根癌农杆菌(A.tumefaciens)T-DNA的胭脂氨酸合成酶基因的转录终止和聚腺苷酸化信号；2mepsps来自玉米的双突变的5-烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合成酶合成酶蛋白；TPotpC转运肽；PcsvmvX、Y、Z木薯脉花叶病毒启动子的第一、第二和第三部分；P35S2花椰菜花叶病毒35S启动子；parp2Gh棉花parp2核苷酸序列的部分；Pdk内含子来自三脉黄菊(Flaveria trinervia)的pdk-内含子的内含子2；OCS终止子来自根癌农杆菌T-DNA的章鱼碱合酶基因的转录终止和聚腺苷酸化信号；RB右T-DNA边界；NPTI-片段nptI抗生素耐药基因的部分；ORI ColE1ColE1质粒的复制起点；ORI pVS1pVS1复制子的复制起点。
图2冷萌发测定法的图例说明。对于每一转基因事件(由X轴上的数字和图式显示)，标出在16℃萌发的幼苗的百分数用于纯合(H)和不成对的(h)分离群体。
图3在用于对照棉花植物(◆)或用于包含parp2沉默构建体的转基因棉花品系(■)的不同浓度的百草枯存在下温育后，培养基传导性的图例说明。
图4是对来自棉花的parp2所得到的多种氨基酸序列的比对。GV1由基因组DNA变体一(SEQ ID NO19)编码的氨基酸序列(SEQ IDNO21)；cDNA由cDNA编码的氨基酸序列(SEQ ID NO12)；GV2基因组DNA变体二(SEQ ID NO20)编码的氨基酸序列(SEQ ID NO22)。
本发明不同实施方案的详述本发明基于如此发现，即棉花parp2基因或棉花parp2 cDNA是优良的源头核苷酸序列以便通过修饰棉花内源性parp2基因的活性、通过将棉花parp2基因交换为提供更好胁迫耐性的parp2基因的另一个等位基因或通过其任意组合得到耐受胁迫的棉花植物。
在一个实施方案中，本发明涉及用于通过减少棉花植物细胞中内源性parp2基因表达、通过产生包含嵌合基因的转基因植物而得到耐胁迫棉花植物的方法，其中所述嵌合基因能够产生双链RNA(“dsRNA”)分子，此dsRNA分子的互补性RNA链包含从棉花物种或从与棉花祖先物种相关的物种中所得parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列的部分或包含来自棉花物种或棉花祖先相关的物种的编码PARP2蛋白质的核苷酸序列的部分。
“棉花”，如本文中所用，包括异源四倍体物种陆地棉、海岛棉(AD基因组异源多倍体)和二倍体物种树棉和草棉(A 基因组二倍体)。与棉花祖先相关的棉种是雷蒙德氏棉、三裂棉和拟似棉(D 基因组二倍体)。
从棉花物种或与棉花祖先物种相关的物种中得到的parp2基因或parp2 cDNA指该物种中天然存在的parp2基因或指对应于该物种中天然存在的parp2基因的mRNA的cDNA。类似地，从棉花物种或从棉花祖先物种相关的物种中得到的PARP2蛋白质指该物种中天然存在的蛋白质。
此类棉花或棉花祖先相关的parp2核苷酸序列的实例包括那些包含任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No19或SEQ IDNo20所示的核苷酸序列。此类棉花parp2序列的其它实例包括编码包含例如氨基酸序列SEQ ID No13或SEQ ID No21或SEQ ID No22的棉花PARP2基因的核苷酸序列。
然而，本领域技术人员将迅速明白所例举的核苷酸序列或其部分可以用于在其它棉花植物中、还在除Cooker312以外的棉花变种或在棉花祖先相关植物中鉴定其它parp2基因或parp2 cDNA，并且此类核苷酸序列或其部分还可以用于例如在棉花植物中增加胁迫耐性。所例举的核苷酸序列可以用于选择i)用作探针的DNA片段，其包含编码氨基酸序列SEQ ID No13的核苷酸序列；ii)用作探针的DNA片段，其包含任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No19或SEQ ID No20的核苷酸序列；iii)用作探针的DNA片段或寡核苷酸，其包含由选自编码氨基酸序列SEQ ID No13的核苷酸序列中20至1382个连续核苷酸组成的核苷酸序列；iv)用作探针的DNA片段或寡核苷酸，其包含由选自编码氨基酸序列SEQ ID No21或22的核苷酸序列中20至2000个连续核苷酸组成的核苷酸序列；v)用作探针的DNA片段或寡核苷酸，其包含由选自任一SEQ IDNo5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ IDNo10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No19或SEQ ID No20的核苷酸序列中20至2000个连续核苷酸组成的核苷酸序列；vi)用作PCR反应中引物的寡核苷酸序列，其具有包含选自编码氨基酸序列SEQ ID No13的核苷酸序列中20至200个连续核苷酸的核苷酸序列；vii)用作PCR反应中引物的寡核苷酸序列，其具有包含选自编码氨基酸序列SEQ ID No21或22的核苷酸序列中20至200个连续核苷酸的核苷酸序列；viii)用作PCR反应中引物的寡核苷酸序列，其具有包含选自任一SEQID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No19或SEQ ID No20的核苷酸序列中20至200个连续核苷酸的核苷酸序列；或ix)用作PCR反应中引物的寡核苷酸序列，其具有任一SEQ ID No1、SEQ ID No2、SEQ ID No3、SEQ ID No4、SEQ ID No16或SEQ ID No17的核苷酸序列。
x)使用如vi、vii、viii或ix中所述的寡核苷酸作为引物从棉花基因组或cDNA中能够扩增的片段，如用作探针的包含核苷酸序列SEQ IDNo18的片段。
通过使用来自棉花物种、变种和棉花祖先相关植物的基因组DNA或cDNA以及所提及作为引物的寡核苷酸实施PCR或通过在来自棉花物种、变种和棉花祖先相关植物的基因组DNA或cDNA和所提及的探针之间实施杂交，优选地在严格条件下，可以鉴定和/或分离此类其它的parp2基因或cDNA或其片段。显然为了得到耐受胁迫的棉花植物的目的，可能不需要鉴定所分离DNA片段的实际核苷酸序列。然而任选地，已鉴定和/或分离的DNA片段的核苷酸序列或潜在编码框的氨基酸序列可以对可得到的核苷酸序列或氨基酸序列进行比对。还可以证实在如此得到的序列中存在所谓PARP标签(TGYMFGKG)或编码此DNA序列的核苷酸序列。酶活性(聚腺苷酰核糖基化)可如例如WO 00/04173中所述进行测试。
“严格杂交条件”如本文中所用意指杂交通常于存在至少95％并且优选地至少97％序列同一性下在探针和靶序列之间发生。严格杂交条件的实例为在包含50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性剪切的载体DNA如鲑精DNA的溶液中温育过夜，随后通过在0.1×SSC中在大约65℃洗涤杂交支持物例如大约10分钟(两次)。其它杂交和洗涤条件是众所周知的并且在Sambrook等，Molecular CloningA LaboratoryManual，第二版，ColdSpring Harbor，NY(1989)、尤其第11章中举例。
使用例举的parp2核苷酸序列或PARP2氨基酸序列，还可以通过核苷酸或氨基酸的插入、删除或替换产生序列变体。棉花PARP2蛋白质变体可以描述为这样的蛋白质，其包含基于任一氨基酸序列SEQ ID No13、21或22的氨基酸序列，其中在变异位置处的一个、二个、三个、四个、五个或更多个氨基酸由功能相似的氨基酸序列替代。可区别如下类型的可交换氨基酸-脂族氨基酸(甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、Leu(L)和异亮氨酸(I))
-芳香族氨基酸(苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W))-含羟基的脂族氨基酸(丝氨酸(S)、苏氨酸(T))-碱性氨基酸(赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H))-酸性氨基酸(天冬氨酸(D)、谷氨酸(E))-含酰胺的氨基酸(天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q))认为保守氨基酸残基是如下氨基酸SEQ ID No15在372-380、15、35、63、82、113、115、117、123、163、167、168、172、173、183、189、226、234、242、251、266、271、275、285、289、344、367、368、371、386、394、408、415、429、443和445处的氨基酸。所有其它氨基酸位置可以视为变异位置。因此，PARP2蛋白质变体可以包括SEQ ID No15的氨基酸序列。
其它变体蛋白质是含有来自SEQ ID 13的至少如下氨基酸，其是在来自小鼠、玉米、稻、拟南芥菜和棉花的parp2所编码的蛋白质间的保守氨基酸位置9、11、14、22、31-32、35-36、40-43、47-50、55、57、58、60、67、70-75、78-79、82、91、96、99、100、103、104、106、108、111、114、121、124、126、127、128、154、157、165、166、167、171、175、177、180、186、187、-189、195、198、199、202、203、205、209、217、223、224、225、226、228、229、230、231、232、233、242、244、248、251、256、257、258、259、261、262、264、266、267、278、279、281、286、292、299、306、310、311、314、315、318、319、326、333、337、345-352、353-355、357、358、360、361-363、365、366、367、369、370、371、372-374、376-383、385-389、391-397、406、408-410、412-416、420-422、431、434-435、439、440、442、446、457和460的氨基酸。这些变体蛋白质可以在其它位置具有选自在SEQ ID No15所提供的替代物中的氨基酸或它们甚至可以在那些变异位置具有其它氨基酸。
包含在双链RNA分子的一条链内的parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列的部分应当长至少19个核苷酸，但是可以从长度大约19个核苷酸变化至等同于parp2 cDNA或parp2基因的长度(以核苷酸计)。有义或反义核苷酸序列的总长度因此可以是至少25nt、或至少大约50nt、或至少大约100nt、或至少大约150nt、或至少大约200nt或至少大约500nt。预期对有义或反义核苷酸序列的总长度不存在上限。然而，出于实践原因(例如嵌合基因的稳定性)预期有义或反义核苷酸序列的长度不应当超过5000nt，尤其不应当超过2500nt以及可以限于大约1000nt。
可以理解parp2或parp2 cDNA的部分(有义区或反义区)的总长度越长，对这些区域和其互补于内源性parp2基因中的相应序列之间的序列同性要求的严格性越低。优选地，目的核酸应当具有与相应靶序列至少大约75％、特别至少大约80％、更特别地至少大约85％、相当特别地大约90％、尤其大约95％、更尤其大约100％的序列同一性，非常特别地是与靶序列或其互补序列的相应部分相同。然而，优选目的核酸总是包括具有与靶核酸的相应部分100％序列同一性的大约19个连续核苷酸、特别地大约25nt、更特别地大约50nt、尤其大约100nt、非常特别地大约150nt的序列。优选地，为计算序列同一性和设计相应的有义序列或反义序列，缺口的数量应当最小化，尤其对于较短的有义序列是如此。
为了本发明的目的，两个相关核苷酸序列或氨基酸序列的表述为百分数的“序列同一性”指在两个已优化比对的序列中具有完全相同残基(×100)的位置数除以加以比较的位置数。缺口，即在比对中某残基在一个序列中存在而在另一个序列中不存在的位置。两个序列的比对通过Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch 1970)开展。以上计算机辅助的序列比对可以使用常规软件程序，如作为Wisconsin Package Version10.1(Genetics Computer Group，Madision，Wisconsin，USA)部分的GAP，使用默认计分矩阵，以缺口产生罚分为50和缺口延伸罚分为3常规地开展。
显而易见，每当RNA分子的核苷酸序列通过参考相应DNA分子的核苷酸序列加以定义时，核苷酸序列中的胸腺嘧啶(T)应当由尿嘧啶(U)替代。是否谈及的是RNA分子或DNA分子，这从本申请的上下文显而易见。
已经证实沉默特定靶基因的最小要件是在沉默作用嵌合基因的核苷酸序列中存在长大约20-21个连续核苷酸的对应于靶基因序列的核苷酸序列，其中20-21个连续核苷酸中的至少19个与对应的靶基因序列相同。“20个连续核苷酸中的至少19个”如本文中所用指选自靶基因的20个连续核苷酸具有一个错配核苷酸的核苷酸序列。如本文中所用“耐受胁迫的棉花植物”或“耐受胁迫条件或不利生长条件的棉花植物”是这样的植物(尤其根据本发明方法得到的棉花植物)，当受到不利生长条件作用一段时间后，例如，但不限于干旱、高温、受限的营养物(尤其氮)供应、高光照强度，其比未用本发明方法处理的对照植物生长更好。这通常从植物的整体外观显而易见并且可以例如通过增加的生物质产生、不利条件下的持续营养生长或者更高种子产量进行测量。耐胁迫植物具有更广的生长谱，即它们能够耐受更大范围的气候变化以及其它非生物性变化，而产量不损失。在生物化学上，胁迫耐性可以表现为在胁迫条件下与对照植物相比，耐受胁迫的植物更高的NAD+-NADH/ATP含量及产生较少的活性氧类。胁迫耐性还可以表现为在相同条件下与对照植物相比，耐受胁迫的植物中更高的叶绿素含量、更高的光合作用以及更低的叶绿素荧光。耐受胁迫的棉花植物还可以通过在纤维组织培养物中分析胁迫条件对包括升高的温度在内的胁迫条件下纤维起始和/或延伸的影响加以识别。
显而易见也不需要为了胁迫耐性变得明显，将植物在不利条件下连续培植。通常，本发明的植物或植物细胞与对照植物或对照植物细胞之间在胁迫耐性上的差异甚至仅当生长期间遭遇相对较短时间的不利条件时就会变得明显。
编码减少棉花parp2表达的本发明嵌合基因的dsRNA可以包含内含子，如异源内含子，其根据WO 99/53050(本文中引用作为参考)的公开内容位于例如有义区域和反义RNA区域间的间隔序列内。
近来已经明晰双链RNA分子，如以上所述的一种双链RNA分子在植物细胞中被切割为大约20-21个核苷酸的小RNA片段，其在降解相应mRNA中起到引导序列作用(由Baulcombe，2004综述)。因此，在另一个实施方案中，本发明涉及用于产生耐受胁迫的棉花植物的方法，包括以下步骤
a)向棉花植物的细胞提供一种或多种双链RNA分子，其中双链RNA分子包含两条RNA链，一条RNA链基本上由选自棉花物种或与棉花祖先物种相关的物种parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列中20至21个连续核苷酸的RNA核苷酸序列组成；和b)鉴定比不包含此双链RNA分子的相同棉花植物更抵抗非生物性胁迫条件的包含所述双链RNA分子的棉花植物。
所提到长20-21nt的dsRNA序列还在常规的反义RNA介导的沉默或有义RNA介导的沉默过程中产生。因此，在本发明的另一个实施方案中，提供了用于产生耐受胁迫的棉花植物的方法，包括向棉花植物的细胞提供嵌合基因的步骤，其中嵌合基因包含有效连接的如下DNA片段a)植物可表达启动子；b)DNA区域，其包含处于反义方向或有义方向的选自来自棉花物种或来自与棉花祖先物种相关的物种parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列的至少20个连续核苷酸；c)包含在植物中有功能的转录终止和聚腺苷酸化信号的DNA区域。
所提及的反义或有义核苷酸区域因此可以大致长约21nt至约5000nt，如21nt、40nt、50nt、100nt、200nt、300nt、500nt、1000nt，或甚至大约2000nt或更长。此外，为了本发明的目的，不需要所用的抑制性parp2基因分子或嵌合基因编码区的核苷酸序列与棉花内源性parp2基因完全相同或互补，其靶向棉花内源性parp2基因以便减少内源性parp2基因在棉花植物中的表达。序列越长，对整体序列同一性的严格性要求越低。因此，有义区域或反义区域可以具有对内源性parp2基因或其互补物的核苷酸序列大约40％或50％或60％或70％或80％或90％或100％的整体序列同一性。然而，如所提及，反义区域或有义区域应当优选地包含具有对parp2基因的核苷酸序列大约100％序列同一性的19-20个连续核苷酸的核苷酸序列。优选地大约100％序列同一性的一段序列应当是大约50、75或100nt。
用于反义RNA或有义RNA介导基因沉默的以上所提及的嵌合基因的效率可以通过包含引起未多聚腺苷酸化的异常(aberrant)parp2抑制性RNA表达的DNA元件得以进一步增强。一种适用于此目的的DNA元件是如WO/001133中所述的编码自我剪接的核酶的DNA区域。嵌合基因的效率还可以通过提供如WO 03/076619中所述的已产生的具有核定位信号或核滞留信号的RNA分子得到增强。
例示性的棉花parp2 cDNA核苷酸序列还可以用于在棉花植物或棉花祖先植物的群体内鉴定与增加的胁迫耐性相关的棉花parp2等位基因。棉花植物群体可以为事先经诱变的群体。经鉴定的棉花parp2等位基因随后可以使用常规育种技术导入选择的棉花植物品系。
转化棉花植物的方法也在本领域众所周知。农杆菌介导的棉花转化已经例如在美国专利5,004,863或在美国专利6,483,013中描述并且通过粒子轰击转化棉花例如在WO 92/15675中报道。
所描述的方法和手段可以用于棉花植物，如Coker 312、Coker310、Coker 5Acala SJ-5、GSC25110、FIBERMAX变种如FIBERMAX 819、Siokra 1-3、T25、GSA75、Acala SJ2、Acala SJ4、Acala SJ5、Acala SJ-C1、Acala B1644、Acala B1654-26、Acala B1654-43、Acala B3991、AcalaGC356、Acala GC510、Acala GAM1、Acala C1、Acala Royale、AcalaMaxxa、Acala Prema、Acala B638、Acala B1810、Acala B2724、AcalaB4894、Acala B5002、非Acala“picker”Siokra、“stripper”变种FC2017、Coker315、STONEVILLE506、STONEVILLE825、DP50、DP61、DP90、DP77、DES119、McN235、HBX87、HBX191、HBX107、FC 3027、CHEMBRED A1、CHEMBRED A2、CHEMBRED A3、CHEMBRED A4、CHEMBRED B1、CHEMBRED B2、CHEMBRED B3、CHEMBRED C1、CHEMBRED C2、CHEMBRED C3、CHEMBRED C4、PAYMASTER145、HS26、HS46、SICALA、PIMAS6和ORO BLANCO PIMA以及具有其衍生基因型的植物。
得到的本发明的转化棉花植物或得到的其中内源性parp2基因已由耐受胁迫的parp2等位基因所替代的耐受胁迫的棉花植物可以在常规育种计划中使用以产生更多具有相同特征的植物或在相同或相关的植物物种中或在杂交植物中导入本发明的嵌合基因。从转化的植物中得到的种子含有作为稳定的基因组插入物的本发明嵌合基因并且也由本发明包括。
对本领域技术人员同样显而易见的是parp2 cDNA或parp2基因组DNA，或如本文中所描述的其部分还可以根据WO 00/04173中教授的内容用于提高任何植物的生长速度或在任何植物的细胞中增加胁迫耐性。
此外，已知导入反义RNA、有义RNA或双链RNA或编码性嵌合基因可以引起表型分布，从几乎不抑制或很少抑制靶基因的表达至极其强烈或甚至100％抑制靶基因的表达。然而，本领域技术人员将能够选择引起所需程度的沉默和所需表型的那些植物细胞、植物甚至植物品系。
对本领域技术人员同样显而易见的是分离自不同品种的parp2基因或cDNA，或其部分，可以在核苷酸序列上或在所编码的多肽的氨基酸上不同，然而在特定区域内显著相似或甚至完全相同。换言之，parp2基因的不同变体可以共有20-200个连续核苷酸序列的相似或相同片段。因此，每当说明书或权利要求书提到包含来自特定核苷酸序列或来自编码特定氨基酸序列的核苷酸序列中至少x个连续核苷酸的DNA区域时，显而易见其所指的是此类至少x个连续核苷酸而无需指出核苷酸序列的来源。
如本文中所用将“包含”解释为说明存在如所陈述的特性、整数、步骤或成分，但是不排除一种或多种特性、整数、步骤或成分的存在或加入。因此，包含核苷酸或氨基酸的序列的核酸或蛋白质可以包含比实际所引用的核苷酸或氨基酸更多的核苷酸或氨基酸，即包含在更大的核酸或蛋白质内。经功能性或结构性定义的包含DNA区域的嵌合基因可以包含其它DNA区域等。
如下的非限制性实施例描述用于在棉花中改变胁迫耐性特征的嵌合基因及其用途。在实施例中除非另外说明，所有重组DNA技术根据如Sambrook等(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，NY和美国Ausubel等(1994)Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols的第1卷和第2卷中所述的标准方案开展。用于植物分子操作的标准材料和方法在由BIOSScientific Publications Ltd(UK)和英国BlackwellScientificPublications联合出版的Plant Molecular Biology Labfax(1993)by R.D.D.Croy中描述。
在全部说明书和实施例中，参考了序列表中展示的如下序列SEQ ID No 1适用于扩增部分棉花parp2基因或cDNA的寡核苷酸P1a的核苷酸序列。
SEQ ID No 2适用于扩增部分棉花parp2基因或cDNA的寡核苷酸P1b的核苷酸序列。
SEQ ID No 3适用于扩增部分棉花parp2基因或cDNA的寡核苷酸P1c的核苷酸序列。
SEQ ID No 4适用于扩增部分棉花parp2基因或cDNA的寡核苷酸P1x的核苷酸序列。
SEQ ID No 5棉花parp2基因(含有PARP标签)变体1的部分cDNA序列。
SEQ ID No 6棉花parp2基因(含有PARP标签)变体2的部分cDNA序列。
SEQ ID No 7棉花parp2基因(含有PARP标签)变体3的部分cDNA序列。
SEQ ID No 8棉花parp2基因(部分2)变体1的部分cDNA序列。
SEQ ID No 9棉花parp2基因(部分2)变体2的部分cDNA序列。
SEQ ID No 10棉花parp2基因(部分2)变体3的部分cDNA序列。
SEQ ID No 11棉花parp2基因(部分2)变体4的部分cDNA序列。
SEQ ID No 12(融合的)棉花parp2 cDNA的部分核苷酸序列。
SEQ ID No 13棉花PARP2蛋白质的部分氨基酸序列。
SEQ ID No 14载体pTMT01的T-DNA区域的核苷酸序列。
SEQ ID No 15棉花PARP2蛋白质部分氨基酸序列的变体。
SEQ ID No 16用于制备棉花parp2特异性探针的寡核苷酸引物1。
SEQ ID No 17用于制备棉花parp2特异性探针的寡核苷酸引物2。
SEQ ID No 18棉花parp2特异性探针的核苷酸序列。
SEQ ID No 19包含棉花parp2基因变体1的基因组DNA的核苷酸序列。
SEQ ID No 20包含棉花parp2基因变体2的基因组DNA的核苷酸序列。
SEQ ID No 21可由SEQ ID No 19编码的蛋白质结构的氨基酸序列。
SEQ ID No 22可由SEQ ID No 20编码的蛋白质结构的氨基酸序列。
SEQ ID No 23棉花parp2基因变体1的mRNA的cDNA拷贝。
SEQ ID No 24棉花parp2基因变体2的mRNA的cDNA拷贝。
实施例实施例1分离棉花parp2的cDNA序列在PCR扩增部分棉花parp2基因中待用作简并引物的寡核苷酸序列可以通过比较可得到的来自拟南芥菜、玉米和稻parp2基因的核苷酸序列加以设计。使用外显子中同源性最高的区域设计引物。以这种方式产生如下简并引物P1a5’-GGTyGCCAAGkGGAACAACAACACC-3’(SEQ ID No1)P1b5’-GGATGATCCdTTrTATkmTCrmTACmAGC-3’(SEQ ID No2)P1c5’-GAGAArATbGTwAChGCsACrArGAArGG-3’(SEQ ID No3)RNA基于Jone等(1985)所描述的方案自棉花愈伤组织(Corker 312)中提取并根据制造商说明书，使用SuperScriptTMFirst-strandSynthesisSystem for RT-PCR(Invitrogen LifeTechnologies)用于cDNA合成。
使用cDNA作为模板以及使用引物对P1a/P1b，在如下条件中实施PCR扩增5分钟，95℃复性35秒，52℃
延伸35秒，72℃变性1分钟，92℃共50循环随后是40秒，52℃以及10分钟，72℃。
大约580bp的DNA片段得以扩增、克隆并且对数个克隆测序(包含SEQ ID 5、6和7的序列)。由变异序列编码的全部预测氨基酸序列均含有在全部PARP蛋白中保守的所谓PARP标签(TGYMFGKG)。
在已扩增序列的基础上，设计允许扩增parp2 cDNA上游部分的新(非简并)引物P1x5’-CAAGAGGAAACAGTTCACAGTGAAGC-3’(SEQ ID No4).
使用如上所述的cDNA和PCR条件，除开展35个循环以及使用作为引物的寡核苷酸P1x和P1c外，大约600bp的DNA片段得以扩增，其与parp2 cDNA先前已扩增的部分parp2 cDNA发生重叠并且在先前已扩增部分的上游构成parp2 cDNA的部分。再次鉴定变异序列(SEQ ID No 8-11)。
SEQ ID No.11代表parp2基因各部分融合后的核苷酸序列。SEQ IDNo13包括由SEQ ID No12的核苷酸序列所编码的蛋白质PARP2的氨基酸序列。
以A基因组二倍体棉花植物和AD四倍体植物的基因组DNA开展DNA杂交。使用数种限制性酶消化，可以观察到两条带，其中在A基因组二倍体中仅存在一条带。
实施例2构建含有PARP2沉默基因的T-DNA载体将含有如实施例1中所述的PARP标签的扩增DNA片段用于构建一旦转录即产生RNA分子的嵌合基因，其包含来自于所扩增DNA片段的有义和反义DNA序列，并可以发生碱基配对以形成双链RNA分子。此种嵌合基因可以用于在棉花中减少parp2表达。为此目的，使用标准重组DNA技术有效连接如下DNA片段● 包括花椰菜花叶病毒35S转录物的启动子区(Odell等，1985)的片段(SEQ ID No14从核苷酸2686至核苷酸3191)。
●片段，其包含以有义方向克隆的陆地棉(棉花)非经典型聚(ADP核糖)聚合酶parp2 cDNA编码序列的包括PARP标签的C端部分(SEQ IDNo14从核苷酸3192至核苷酸3617)。
●片段，其含有如Rosche和Westhoff(1995)所述的来自三脉黄菊的正磷酸丙酮酸二激酶基因的第二内含子(SEQ ID No14从核苷酸3649至核苷酸4423)。
●片段，其包含以反义方向克隆的陆地棉(棉花)非经典型聚(ADP核糖)聚合酶parp2 cDNA编码序列的包括PARP标签的C端部分(SEQ IDNo14从核苷酸4424至核苷酸4851)。
●包括如De Greve等(1982)所述的根癌农杆菌章鱼碱合酶基因3′非翻译区的片段(SEQ ID No14从核苷酸4852至核苷酸5591)。
将此嵌合基因随同编码可选择标记的嵌合基因导入在T-DNA载体的T-DNA边界之间以产生pTMT1(见
图1；pTMT1的T-DNA的序列在SEQID No14中展示)。载体pTMT1衍生自pGSC1700(Cornelissen和Vandewiele，1989)。载体主链含有如下遗传元件●质粒核，其包含来自质粒pBR322(Bolivar等，1977)的用于在大肠杆菌(Escherichia coli)中复制的复制起点(ORI ColE1)以及包含来自假单胞菌(Psudomonas)质粒pVS1(Itoh等，1984)的用于在根癌农杆菌内复制的复制起点(ORI pVS1)的限制性片段。
●用于在大肠杆菌和根癌农杆菌内复制并选择质粒的赋予链霉素耐药性和壮观霉素(aadA)耐药性的可选择标记基因。
●DNA区域，其由来自转座子Tn903(Oka等，1981)的nptI基因的新霉素磷酸转移酶编码序列的片段组成。
将T-DNA载体导入含有辅助Ti-质粒的根癌农杆菌。棉花植物使用所得到的根癌农杆菌菌株根据如美国专利6,483,013中所述的方案转化。
实施例3分析携带PARP2沉默基因的转基因棉花植物得到包含如实施例1中所述嵌合基因的不同转基因棉花品系。转基因植物品系使用DNA印迹分析法在分子水平进行分析。类似地，使用RNA印迹分析植物品系的parp2 RNA表达并且使用例如ELISA或蛋白质印迹法分析PARP2蛋白质的存在。PARP活性的指标可以利用例如使单链DNA断口(break)可见的TUNEL测定法得到。
T0代的转基因植物品系与Coker312植物回交以在所得到的转化植物品系内减少潜在的体细胞克隆变异。
自我授粉的转基因棉花品系的分离群体使用实时PCR分析是否存在处于纯合或杂合形式的转基因，或是否缺少转基因。
不同植物品系受到不同形式的胁迫处理。将转基因植物的同源群体与未转化的参考植物比较，或使用分离群体，随后使用标准技术确定纯合、杂合和不成对的植物品系。
第一个测试是“冷萌发测定法”，其中将种子在沙质土壤中在温度5℃萌发。类似测试还如Schulze等，1996，Schulze等，1996，Duesterhaus等，1999或Duesterhaus等，2000所述加以使用。
另一个测试是在对植物进行视观评分之前，使正在生长的植物受到各种时间长度的干旱或增加的温度作用(或其组合)，随后在用于棉花的标准温室条件下生长一段时间。
由于还已知棉花纤维起始和/或延伸易受例如包括寒冷在内的多种胁迫条件损害，因此发展了一种测定法，籍此分析降低的温度或升高的温度对起始自不同转基因植物品系的纤维组织培养物的影响。为此目的，起始(initiate)纤维组织培养物，尤其如Beasly和Ting，1974所述。培养物随后受到改变的温度(例如在45-50℃，2小时-4小时)处理一段时间并且记录对纤维起始的影响。
又一个测试是基本如WO02/066972(本文中引用作为参考)中所描述的适应性测试(fitness assay)，如其中所描述施加于外植体材料的胁迫条件可以由其它胁迫条件替代或补充，如在降低和升高的温度下栽培。
还基本如欧洲专利申请EP04077624.7(本文中引用作为参考)中所述，分析转基因植物品系以确定与正常条件下相似植物材料中活性氧类的水平相比，胁迫条件下植物或外植体中活性氧类的水平。类似地，还基本如欧洲专利申请EP04077624.7中所述，分析转基因植物品系以确定与正常条件下相似植物材料中ATP和/或NAD(H)的水平相比，胁迫条件下植物或外植体中ATP和/或NAD(H)的水平。
不同的转基因植物品系还用于田间试验，其中将灌溉的田地与未灌溉的田地比较。当与不成对的植物以及参考棉花植物相比较，对植物就农学适应性(fitness)和损伤进行视观评分。
观察到在一个或多个以上所述的测定法中对不利生长条件或所施加的胁迫条件表现出增加的耐受性的数个转基因植物品系。
实施例4以转基因棉花品系进行的田间试验将如实施例3中所述的经鉴定的不同纯合转基因棉花品系以及相应的无效品系(null line)用于田间试验，将受到全程灌溉的比较性田地与仅在生长季节开始时得到灌溉因而使棉花植物遭受显著热胁迫作用的田地加以比较。一场冰雹暴风毁坏了部分田地，因而结果难以解释。然而，似乎一些转基因品系看上去较健康并具有较多的营养生长，即显得较有活力。
实施例5使用冷萌发测定法分析转基因棉花品系。
使转基因棉花品系自我授粉并且如实施例3中所述对纯合或不成对的子代植物分析分离性子代群体。对每一事件，将来自纯合植物或来自不成对的植物的50粒种子分别播种在沙子内。托盘在恒定温度16℃温育21日，此时计数萌发的幼苗。棉花种子萌发对低于18℃的温度敏感。与此同时，将来自如上提及的相同种子批次的50粒种子培植在沙子内，但白天在26℃温育并且夜晚在21℃温育持续12日。计数出现的幼苗数并用于就种子批次质量的任何影响校正冷萌发测试的数据。
图4代表比较纯合品系与不成对品系的11个不同事件的数据。尤其，显示为品系7、9和11的纯合转基因品系性能非常好，因为胁迫发生期间几乎观察不到萌发的丧失。
实施例6分析转基因棉花品系对百草枯处理的耐受性将来自如实施例5中因性能良好而得到确认的三个转基因棉花品系的叶进行百草枯耐受性测定，与来自非转基因Coker312的叶比较。为此目的，将大约1平方厘米的叶盘在含有不同浓度(每个浓度6个重复)百草枯溶液的培养皿内温育。培养皿在黑暗中温育4小时，随后在高光照强度下温育2小时。此后，将平皿在黑暗中过夜温育。百草枯对细胞膜的破坏次日通过测量温育培养基的传导性加以评估。这些测量的结果在图3中概括。如可从图3B中见到，至少一个转基因品系显示比对照品系更耐受百草枯处理。
实施例7分离编码棉花parp2的基因组克隆棉花parp2基因组克隆使用标准重组技术从陆地棉BAC文库分离。简言之，使用所得到的探针通过PCR扩增来筛选商业可得到的来自陆地棉品种Maxxa的BAC文库，其中PCR扩增使用棉花cDNA作为模版以及具有SEQ ID No16和SEQ ID No17的序列的寡核苷酸作为引物。寡核苷酸的序列衍生自SEQ ID No12的cDNA序列。所扩增的DNA片段的序列作为SEQ ID No18提供。12个BAC克隆鉴定为推测的阳性候选者。分析这些克隆的限制性片段带型显示了两种类型的克隆。基因组变体1是文库中最丰富的代表。将每一克隆的代表通过引物步移法测定核苷酸序列。对于两个克隆的相关部分的核苷酸序列分别作为SEQ ID No19和SEQ IDNo20提供。可以由这些核苷酸序列所编码的多肽的氨基酸序列分别作为SEQ ID No21和SEQ ID No22提供。转录和剪接后的mRNA的核苷酸序列作为SEQ ID No23和SEQ ID No24提供。将可由基因组克隆的两种变体(来自品种Maxxa；SEQ ID Nos.20和21)所编码的多肽比对并且与由cDNA克隆(来自Coker312；SEQ ID No13)编码的多肽进行比较，如图4中所示。
如所预期，三种多肽共有显著的序列同一性或序列同源性.
由基因组克隆编码的多肽和由cDNA克隆编码的(不完整)多肽间的主要差异是在由基因组克隆(两种变体)编码的多肽中存在额外的一段26个氨基酸序列(SEQ ID No21从AA 444至AA 469)。
GV1多肽还具有氨基端延伸(SEQ ID No 21从AA 1至AA 65)，与此同时其缺少在GV2中存在的48个氨基酸片段(SEQ ID No 22从AA 174至AA 221)。在cDNA克隆编码的多肽中也缺少相似的氨基酸片段(除4个AA；VLQK以外)。此外，GV1多肽在其羧基端部分具有大约11个氨基酸的插入物(SEQ ID No 21从AA 644至AA 664)。
在本发明沉默构建体中包含的优选靶区域因此可以是编码具有SEQID No13从7至26；SEQ ID No13从31至238；SEQ ID No13从239至412；SEQ ID No13从413至423；SEQ ID No13从425至460的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。
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序列表<110>拜尔生物科学公司<120>耐受胁迫的棉花植物<130>BCS 04-2006<150>EP04077984.5<151>2004-10-29<150>US60/628,597<151>2004-11-17<160>24<170>PatentIn版本3.0<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸P1a<400>1ggtygccaag kggaacaaca acacc25
<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸P1b<400>2ggatgatccd ttrtatkmtc rmtacmagc29<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸P1c<400>3gagaaratbg twachgcsac rargaargg29<210>4<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸P1x<400>4caagaggaaa cagttcacag tgaagc26<210>5<211>426<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>棉花parp2 CDNA 1_1<400>5accagcagca tcactgtgaa ctgtttcctc ttgacaatga tactgaggag ttcgctttga 60ttgtaaagta tattcagaat actcatgctc agacacattc aaattataca gttgatgttg 120ttcaaatatt caaggtgaca agagacggtg aaagtgaacg ctttaaaaag ttttctggaa 180caaaaaatag aatgctgttg tggcatggtt ctcggcttac taactggact ggcattctgt 240cccaaggttt gcgcattgct ccacctgaag cgcctgccac gggttatatg tttgggaagg 300gggtttactt tgctgatatg ttctccaaaa gtgcaaatta ttgctatact aattctgcct 360tcacaacagg ggtgttgctt ctatgtgagg ttgccctggg tgacatggct gagcttctac 420aagcta 426<210>6<211>573<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>cDNA棉花parp2部分1变体2<400>6tggatgatcc gttgtatgat caataccagc agcttcactg tgaactgttt cctcttgaca 60atgatactga ggagttcgct ttgattgtaa agtatattca gaatactcat gctcagacac 120attcaaatta tacagttgat gttgttcaaa tattcaaggt gacaagagac ggtgaaagtg 180aacgctttaa aaagttttct ggaacaaaaa atagaatgct gttgtggcat ggttctcggc 240ttactaactg gactggcatt ctgtcccaag gtttgcgcat tgctccacct gaagcgcctg 300ccacgggtta tatgtttggg aagggggttt actttgctga tatgttctcc aaaagtgcaa 360attattgcta tactaattct gccttcacaa caggggtgtt gcttctatgt gaggttgccc 420tgggtgacat ggctgagctt ctacaagcta aaagcgatgc tgataagctg ccggatggga 480agttgagcac aaaaggtgtt ggtgcaactg caccggatcc ttctgaagcc cagtcacttg 540atgatggtgt tgttgttccc cttggcgaat cca 573<210>7<211>566<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>cDNA棉花parp2部分1变体3<400>7tggatgatcc attgtattct cgctaccagc agcttcactg tgaactgttt cctcttgaca 60atgatactga ggagttcgct ttgattgtaa agtatattca gaatactcat gctcagacac 120attcaaatta tacagttgat gttgttcaaa tattcaaggc gacaagagac ggtgaaagtg 180aacgctttaa aaagttttct ggaacaaaaa atagaatgct gttgtggcat ggttctcggc 240ttactaactg gaccggcatt ctgtcccaag gtttgcgcat tgctccacct gaagcgcctg 300ccacgggtta tatgtttggg aagggggttt actttgctga tatgttctcc aaaagtgcaa 360
attattgcta tactaattct gccttcacaa ctggggtgtt gcttctatgt gaggttgccc 420tgggtgacat ggctgagctt ctacaagcta aaagcgatgc tgataagctg ccggatggga 480agttgagcac aaaaggtgtt ggtgcaactg caccggatcc ttctgaagcc cagtcacttg 540atgatggtgt tgttgttcca cttgga 566<210>8<211>881<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>cDNA棉花parp2部分2变体1<400>8gagaagatgg ttactgcgac gaggaagggt ggctgttctg gatcaaggga tcccagatga 60cataaaggct cattatcatg ttctacaaaa gggtgatgat atctatgatg ccatgttaaa 120tcagacgaat gttgggcaaa acaataacaa attctttgtg atccagcttc tagaatctga 180tgactcgaag acatacatgg ttcataacag atggggtaga gttggtgtga agggtcaaat 240taagttacat ggccccttta cttcacgaca agccgcaatt gatgagtttc aaaccaaatt 300ctttaacaag accaaaaact attggtacaa cagaaaagac tttgtttgtc acccaaagtg 360ctacaccttg ctggagatgg actatgatga aaaagaaaag gaatctgatg tcaaaagaaa 420ggctaactct tccattggtg ctcaattgcg ggagacaaag cttggacaac gtgttgctaa 480gtttatctct attatatgca atatcagcat gatgaagcaa caaatgatgg aaataggata 540caatgctgac aagttgcctc ttggtaagct aagcaaatcc acaattttaa aggggtatga 600tgtcttaaag aaaattgctg atgtgattga ccagtcaaac aggagcaagc ttgagcaatt 660aagttcggaa ttttacaccg tgattccaca tgattttgga tttagaaaaa tgcgtgattt 720tgtcatcgac acacctcaga agttgaaaaa gaagttggaa atggttgaag ccccgggaga 780
aatagaggtc gcatcaaaat tattaatgga tgacattacg atggaggaag atcctttata 840ttatcggtac caacagcttc actgtgaact gtttcctctt g 881<210>9<211>882<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>cDNA parp2部分2变体2<400>9gagaaaattg ttaccgcgac aaggaagggg tggctgttct ggatcaaggg atcccagatg 60acataaaggc tcattatcat gttctacaaa agggtgatga tatctatgat gccatgttaa 120atcagacgaa tgttgggcaa aacaataaca aattctttgt gatccagctt ctagaatctg 180atgactcgaa gacatacatg gttcataaca gatggggtag agttggtgtg aagggtcaaa 240ttaagttaca tggccccttt acttcacgac aagccgcaat tgatgagttt caaaccaaat 300tctttaacaa gaccaaaaac tattggtaca acagaaaaga ctttgtttgt cacccaaagt 360gctacacctt gctggagatg gactatgatg aaaaagaaaa ggaatctgat gtcaaaagaa 420aggctaactc ttccattggt gctcaattgc gggagacaaa gcttgaacaa cgtgttgcta 480agtttatctc tattatgtgc aatatcagca tgatgaagca acaaatgatg gaaataggat 540acaatgctga caagttgcct cttggtaagc taagcaaatc cacaatttta aaggggtatg 600atgtcttaaa gaaaattgct gatgtgattg accagtcaaa caggagcaag cttgagcaat 660taagttcgga attttacacc gtgattccac atgattttgg atttagaaaa atgcgtgatt 720tcgtcatcga cacacctcag aagttgaaaa agaagttgga aatggttgaa gccctgggag 780aaatagaggt cgcatcaaaa ttattaatgg atgacattac gatggaggaa gatcctttat 840attatcggta ccaacagctt cactgtgaac tgtttcctct tg 882
<210>10<211>869<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>cDNA parp2部分2变体3<400>10cagccacgag aagggggtgg ctgttctgga tcaagggatc ccagacgaca taaaggctca 60ttatcatgtc ctacaaaagg gtgatgatat ctatgatgcc atgttaaatc agacgaatgt 120tgggcaaaac aataacaaat tctttgtgat ccagcttcta gaatctgatg actcgaagac 180atacatggtt cataacagat ggggtagagt tggtgtgaag ggtcaaatta agttacatgg 240cccctttact tcacgacaag ccgcaattga tgagtttcaa accaaattct ttaacaagac 300caaaaactat tggtacaaca gaaaagactt tgtttgtcac ccaaagtgct acaccttgct 360ggagatggac tatgatgaaa aagaaaagga atctgatgtc aaaagaaagg ctaactcttc 420cattggtgct caattgcggg agacagagct tgaacaacgt gttgctaagt ttatctctat 480tatatgcaat atcagcatga tgaagcaaca aatgatggaa ataggataca atgctgacaa 540gttgcctctt ggtaagctaa gcaaatccac aattttaaag gggtatgatg tcttaaagaa 600aattgctgat gtgattgacc agtcaaacag gagcaagctt gagcaattaa gttcggaatt 660ttacaccgtg attccacatg attttggatt tagaaaaatg cgtgattttg tcatcgacac 720acctcagaag ttgaaaaaga agttggaaat ggttgaagcc ctgggagaaa tagaggtcgc 780atctaaatta ttaatggatg acattacgat ggaggaagat cctttatatt atcggtacca 840acagcttcac tgtgaactgt ttcctcttg869<210>11
<211>880<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>cDNA parp2部分2变体4<400>11agaagatcgt aacagcgacg aggaaggggt ggctgttctg gatcaaggga tcccagatga 60gataaaggct cattatcatg ttctacaaaa gggtgatcat atctatgatg ccatgttaaa 120tcagacgaat gttgggcaaa acaataacaa gttctttgtg atccagcttc tagaatctga 180tgactcaaag acatacatgg ttcataatag atggggtaga gttggtgtga agggtcaaat 240taagttacat ggccccttta cttcacgaca ggctgcaatt gatgtgtttc aaaccaagtt 300ctttaacaag accaaaaact attggtacaa cagaaaagac tttgtttgtc acccaaagtg 360ctacaccttg ctggagatgg actatgatga aaaagaaaag gattctgatg tcaaaagaaa 420ggctaactct tccattggtg ctcaattgcg ggagacaaag cttgaacaac gtgttgctaa 480gtttatctct gttatatgca atatcagcat gatgaagcaa caaatgatgg aaataggata 540caatgctgac aagttgcctc ttggtaagct aagcaaatcc acaattttaa aggggtatga 600tatcttaaag aaaattgctg atgtgattga ccagtcaaac aggagcaagc ttgagcaatt 660aagttcggaa ttttacaccg tgattccaca tgattttgga tttagaaaaa tgcgtgattt 720tgtcatcgac aaacctcaga agttgaaaaa gaagttggaa atggttgaag ccctgggaga 780aatagaggtc gcatcaaaat tattaatgga tgacattacg atggaggaag atcctttata 840ttatcggtac cagcagcttc actgtgaact gtttcctctt 880<210>12<211>1384<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>cDNA parp2(融合的)<220>
<221>CDS<222>(3)..(1382)<400>12ga gaa gat bgt tac agc gac gag gaa ggg gtg gct gtt ctg gat caa 47Glu Asp Xaa Tyr Ser Asp Glu Glu Gly Val Ala Val Leu Asp Gln1 5 10 15ggg atc cca gat gac ata aag gct cat tat cat gtt cta caa aag ggt 95Gly Ile Pro Asp Asp Ile Lys Ala His Tyr His Val Leu Gln Lys Gly20 25 30gat gat atc tat gat gcc atg tta aat cag acg aat gtt ggg caa aac143Asp Asp Ile Tyr Asp Ala Met Leu Asn Gln Thr Asn Val Gly Gln Asn35 40 45aat aac aaa ttc ttt gtg atc cag ctt cta gaa tct gat gac tcg aag191Asn Asn Lys Phe Phe Val Ile Gln Leu Leu Glu Ser Asp Asp Ser Lys50 55 60aca tac atg gtt cat aac aga tgg ggt aga gtt ggt gtg aag ggt caa239Thr Tyr Met Val His Asn Arg Trp Gly Arg Val Gly Val Lys Gly Gln65 70 75att aag tta cat ggc ccc ttt act tca cga caa gcc gca att gat gag287Ile Lys Leu His Gly Pro Phe Thr Ser Arg Gln Ala Ala Ile Asp Glu80 85 90 95ttt caa acc aaa ttc ttt aac aag acc aaa aac tat tgg tac aac aga335Phe Gln Thr Lys Phe Phe Asn Lys Thr Lys Asn Tyr Trp Tyr Asn Arg100 105 110aaa gac ttt gtt tgt cac cca aag tgc tac acc ttg ctg gag atg gac383Lys Asp Phe Val Cys His Pro Lys Cys Tyr Thr Leu Leu Glu Met Asp115 120 125tat gat gaa aaa gaa aag gaa tct gat gtc aaa aga aag gct aac tct431
Tyr Asp Glu Lys Glu Lys Glu Ser Asp Val Lys Arg Lys Ala Asn Ser130 135 140tcc att ggt gct caa ttg cgg gag aca aag ctt gaa caa cgt gtt gct 479Set Ile Gly Ala Gln Leu Arg Glu Thr Lys Leu Glu Gln Arg Val Ala145 150 155aag ttt atc tct att ata tgc aat atc agc atg atg aag caa caa atg 527Lys Phe Ile Ser Ile Ile Cys Asn Ile Set Met Met Lys Gln Gln Met160 165 170 175atg gaa ata gga tac aat gct gac aag ttg cct ctt ggt aag cta agc 575Met Glu Ile Gly Tyr Asn Ala Asp Lys Leu Pro Leu Gly Lys Leu Ser180 185 190aaa tcc aca att tta aag ggg tat gat gtc tta aag aaa att gct gat 623Lys Ser Thr Ile Leu Lys Gly Tyr Asp Val Leu Lys Lys Ile Ala Asp195 200 205gtg att gac cag tca aac agg agc aag ctt gag caa tta agt tcg gaa 671Val Ile Asp Gln Ser Asn Arg Set Lys Leu Glu Gln Leu Set Ser Glu210 215 220ttt tac acc gtg att cca cat gat ttt gga ttt aga aaa atg cgt gat 719Phe Tyr Thr Val Ile Pro His Asp Phe Gly Phe Arg Lys Met Arg Asp225 230 235ttt gtc atc gac aca cct cag aag ttg aaa aag aag ttg gaa atg gtt 767Phe Val Ile Asp Thr Pro Gln Lys Leu Lys Lys Lys Leu Glu Met Val240 245 250 255gaa gcc ctg gga gaa ata gag gtc gca tca aaa tta tta atg gat gac 815Glu Ala Leu Gly Glu Ile Glu Val Ala Ser Lys Leu Leu Met Asp Asp260 265 270att acg atg gag gaa gat cct tta tat tat cgg tac caa cag ctt cac 863Ile Thr Met Glu Glu Asp Pro Leu Tyr Tyr Arg Tyr Gln Gln Leu His275 280 285tgt gaa ctg ttt cct ctt gac aat gat act gag gag ttc gct ttg att 911Cys Glu Leu Phe Pro Leu Asp Asn Asp Thr Glu Glu Phe Ala Leu Ile290 295 300gta aag tat att cag aat act cat gct cag aca cat tca aat tat aca 959Val Lys Tyr Ile Gln Asn Thr His Ala Gln Thr His Ser Asn Tyr Thr305 310 315gtt gat gtt gtt caa ata ttc aag gtg aca aga gac ggt gaa agt gaa 1007Val Asp Val Val Gln Ile Phe Lys Val Thr Arg Asp Gly Glu Ser Glu320 325 330 335
cgc ttt aaa aag ttt tct gga aca aaa aat aga atg ctg ttg tgg cat1055Arg Phe Lys Lys Phe Ser Gly Thr Lys Asn Arg Met Leu Leu Trp His340 345 350ggt tct cgg ctt act aac tgg act ggc att ctg tcc caa ggt ttg cgc1103Gly Ser Arg Leu Thr Asn Trp Thr Gly Ile Leu Ser Gln Gly Leu Arg355 360 365att gct cca cct gaa gcg cct gcc acg ggt tat atg ttt ggg aag ggg1151Ile Ala Pro Pro Glu Ala Pro Ala Thr Gly Tyr Met Phe Gly Lys Gly370 375 380gtt tac ttt gct gat atg ttc tcc aaa agt gca aat tat tgc tat act1199Val Tyr Phe Ala Asp Met Phe Ser Lys Ser Ala Asn Tyr Cys Tyr Thr385 390 395aat tct gcc ttc aca aca ggg gtg ttg ctt cta tgt gag gtt gcc ctg1247Asn Ser Ala Phe Thr Thr Gly Val Leu Leu Leu Cys Glu Val Ala Leu400 405 410 415ggt gac atg gct gag ctt cta caa gct aaa agc gat gct gat aag ctg1295Gly Asp Met Ala Glu Leu Leu Gln Ala Lys Ser Asp Ala Asp Lys Leu420 425 430ccg gat ggg aag ttg agc aca aaa ggt gtt ggt gca act gca ccg gat1343Pro Asp Gly Lys Leu Ser Thr Lys Gly Val Gly Ala Thr Ala Pro Asp435 440 445cct tct gaa gcc cag tca ctt gat gat ggt gtt gtt gtt cc 1384Pro Ser Glu Ala Gln Ser Leu Asp Asp Gly Val Val Val450 455 460<210>13<211>460<212>PRT<213>人工序列<400>13Glu Asp Xaa Tyr Ser Asp Glu Glu Gly Val Ala Val Leu Asp Gln Gly1 5 10 15
Ile Pro Asp Asp Ile Lys Ala His Tyr His Val Leu Gln Lys Gly Asp20 25 30Asp Ile Tyr Asp Ala Met Leu Asn Gln Thr Asn Val Gly Gln Asn Asn35 40 45Asn Lys Phe Phe Val Ile Gln Leu Leu Glu Ser Asp Asp Ser Lys Thr50 55 60Tyr Met Val His Asn Arg Trp Gly Arg Val Gly Val Lys Gly Gln Ile65 70 75 80Lys Leu His Gly Pro Phe Thr Ser Arg Gln Ala Ala Ile Asp Glu Phe85 90 95Gln Thr Lys Phe Phe Asn Lys Thr Lys Asn Tyr Trp Tyr Asn Arg Lys100 105 110Asp Phe Val Cys His Pro Lys Cys Tyr Thr Leu Leu Glu Met Asp Tyr115 120 125Asp Glu Lys Glu Lys Glu Ser Asp Val Lys Arg Lys Ala Asn Ser Ser130 135 140Ile Gly Ala Gln Leu Arg Glu Thr Lys Leu Glu Gln Arg Val Ala Lys145 150 155 160Phe Ile Ser Ile Ile Cys Asn Ile Ser Met Met Lys Gln Gln Met Met165 170 175Glu Ile Gly Tyr Asn Ala Asp Lys Leu Pro Leu Gly Lys Leu Ser Lys180 185 190Ser Thr Ile Leu Lys Gly Tyr Asp Val Leu Lys Lys Ile Ala Asp Val195 200 205Ile Asp Gln Ser Asn Arg Ser Lys Leu Glu Gln Leu Ser Ser Glu Phe210 215 220
Tyr Thr Val Ile Pro His Asp Phe Gly Phe Arg Lys Met Arg Asp Phe225 230 235 240Val Ile Asp Thr Pro Gln Lys Leu Lys Lys Lys Leu Glu Met Val Glu245 250 255Ala Leu Gly Glu Ile Glu Val Ala Ser Lys Leu Leu Met Asp Asp Ile260 265 270Thr Met Glu Glu Asp Pro Leu Tyr Tyr Arg Tyr Gln Gln Leu His Cys275 280 285Glu Leu Phe Pro Leu Asp Asn Asp Thr Glu Glu Phe Ala Leu Ile Val290 295 300Lys Tyr Ile Gln Asn Thr His Ala Gln Thr His Ser Asn Tyr Thr Val305 310 315 320Asp Val Val Gln Ile Phe Lys Val Thr Arg Asp Gly Glu Ser Glu Arg325 330 335Phe Lys Lys Phe Ser Gly Thr Lys Asn Arg Met Leu Leu Trp His Gly340 345 350Ser Arg Leu Thr Asn Trp Thr Gly Ile Leu Ser Gln Gly Leu Arg Ile355 360 365Ala Pro Pro Glu Ala Pro Ala Thr Gly Tyr Met Phe Gly Lys Gly Val370 375 380Tyr Phe Ala Asp Met Phe Ser Lys Ser Ala Asn Tyr Cys Tyr Thr Asn385 390 395 400Ser Ala Phe Thr Thr Gly Val Leu Leu Leu Cys Glu Val Ala Leu Gly405 410 415
Asp Met Ala Glu Leu Leu Gln Ala Lys Ser Asp Ala Asp Lys Leu Pro420 425 430Asp Gly Lys Leu Ser Thr Lys Gly Val Gly Ala Thr Ala Pro Asp Pro435 440 445Ser Glu Ala Gln Ser Leu Asp Asp Gly Val Val Val450 455 460<210>14<211>5616<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>T-DNA载体pTMT01<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(25)<223>LB来自根癌农杆菌T-DNA的左边界重复(Zambryski，1988)<220>
<221>misc_feature<222>(25)..(439)<223>3’nos包括来自如Depick等人1982年所述的pTiT37 T-DNA的胭脂氨酸合成酶基因3’非翻译区的序列(逆时针)<220>
<221>misc_feature
<222>(440)..(1777)<223>2mepsps(Eagl)来自玉米的双突变的5-烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合成酶合成酶基因的编码序列(非PvuII)(Lebrun等人，2003).(逆时针)<220>
<221>misc_feature<222>(1778)..(2150)<223>TPotp C如Lebrun等人(1996)所述的优化转运肽(逆时针)<220>
<221>misc_feature<222>(2151)..(2685)<223>Pcsvmv XYZ包括木薯脉花叶病毒启动子区的序列(Verdaguer等人，1996).(逆时针)<220>
<221>misc_feature<222>(2686)..(3191)<223>P35s2包括花椰菜花叶病毒35S转录物启动子区的序列(Odell等人，1985).(顺时针)<220>
<221>misc_feature<222>(3192)..(3617)<223>parp2Gh(C端)包括陆地棉(Gossypium hirsutum)(棉花)非经典型聚(ADP核糖)聚合酶的部分编码区的序列(顺时针)
<220>
<221>misc_feature<222>(3649)..(4423)<223>内含子pdk如Rosche和Westhoff(1995)所述的来自三脉黄菊(Flaveria trinervia)磷酸丙酮酸二激酶基因的第二内含子(顺时针)<220>
<221>misc_feature<222>(4424)..(4851)<223>parp2Gh(C端)包括陆地棉(Gossypium hirsutum)(棉花)非经典型聚(ADP核糖)聚合酶的部分编码区的序列(逆时针)<220>
<221>misc_feature<222>(4852)..(5591)<223>3’ocs包括如De Greve等(1982)所述的根癌农杆菌章鱼碱合酶基因3′非翻译区的序列(顺时针)<220>
<221>misc_feature<222>(5592)..(5616)<223>RB来自根癌农杆菌T-DNA的右边界重复(Zambryski，1988)<400>14cggcaggata tattcaattg taaatggctc catggcgatc gctacctggc tggcgaaagg 60gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 120taaaacgacg gccagtgaat tgcggccgca attcccgatc tagtaacata gatgacaccg 180
cgcgcgataa tttatcctag tttgcgcgct atattttgtt ttctatcgcg tattaaatgt240ataattgcgg gactctaatc ataaaaaccc atctcataaa taacgtcatg cattacatgt300taattattac atgcttaacg taattcaaca gaaattatat gataatcatc gcaagaccgg360caacaggatt caatcttaag aaactttatt gccaaatgtt tgaacgatcg gggaaattcg420tcgaagcttc ttctagagct taattcttga cgaaagtgct cagcacatcg aagtagtcgg480ggaaggtctt ccgggtgcac ccagggtccc ggatggtgac ggggacctcg gcacaggcgg540caagggagaa ggccatcgcc atcctgtggt cgtcgtacgt gtcgatcgcc gtcacgttca600gcttctccgg cggcgtgatg atgcagtagt ccggcccttc ctcaacagat gctcccagct660tggttagctc cgtccggatc gcaaccatcc tctcggtctc ctttactctc caggaagcca720cgtctctgat ggctgtcggg ccatcggcaa agagggcaac cacagcaaga gtcatggcga780catcaggcat cttgttcatg ttgacatcaa tcgccttgag gtgtttcctc ccaaatggct840cccgcggtgg gccagtaaca gttacgctag tctcggtcca tgtaaccttc gctcccatca900tctccagtac ctcagcaaac ttcacatcac cctgcaaact ggtggtgcca caaccttcca960cagtcacagt ccctccagta attgcagcac cagccaagaa atagcttgcg cttgaggcat 1020caccttcaac ataggcattt ttaggggact tgtatttttg acctccctta atgtagaatc 1080tgtcccagct atcagaatgc tctgctttca caccaaaacg ctccatcaat ctcaatgtca 1140tttcgacgta cggaatggag attaatttat caatgatttc aatctccaca tccccaagag 1200ccaaaggagc agccatcagc aaggcactca agtactgact gctgatggag ccagacagct 1260tgaccttgcc accaggtagc cctccgattc cattgacacg aacaggtggg cagtcagtgc 1320caaggaaaca atcaacatct gcaccaagct gcttcaatcc gacaaccaag tcgccaatgg 1380gtctctccct cattcttggt actccatcaa gcacgtaagt tgcatttcca ccagcagcag 1440taacggccgc tgtcaaggac cgcattgcga ttccagcatt ccccaagaag agctgcactt 1500cctctttagc atcctcaact gggaactttc caccacagcc aacaactaca gctcttttgg 1560cagctttgtc cgcttcgaca gagagaccaa gagtcctcaa ggccccgagc atgtagtgga 1620catcctcact gttcagcagg ttatcaacca ctgttgtccc ctcggacagg gcggcgagta 1680
ggaggatccg gttggaaagc gacttggacc ccggcagctt gacggtgccg gagatctcct 1740tgatgggctg cagcacgatc tcctcggcgc cggccatgca ccggatcctt ccgccgttgc 1800tgacgttgcc gaggcttctg gaggagcggc gggcgacggg gaggctggcg gtggacttga 1860gcccctggaa cggagcgacg gcggtggccg acgaggccat catcacggtg ggcgccatag 1920acagcggcgg caggtacgac agcgtctcga acttcttgtt gccgtaggcc ggccacacct 1980gcatacattg aactcttcca ccgttgctgg gaagggtgga gaagtcgtta gccttcttgg 2040tggtggggaa ggcggcgttg gacttaaggc cggtgaacgg agccaccatg ttggcctgag 2100caggggcggt ccggctaacg gtcgcgactg aggaggagat cgaagccatg ggccgcttta 2160gaattgagat ctacaaactt acaaatttct ctgaagttgt atcctcagta cttcaaagaa 2220aatagcttac accaaatttt ttcttgtttt cacaaatgcc gaacttggtt ccttatatag 2280gaaaactcaa gggcaaaaat gacacggaaa aatataaaag gataagtagt gggggataag 2340attcctttgt gataaggtta ctttccgccc ttacattttc caccttacat gtgtcctcta 2400tgtctctttc acaatcaccg accttatctt cttcttttca ttgttgtcgt cagtgcttac 2460gtcttcaaga ttcttttctt cgcctggttc ttctttttca atttctacgt attcttcttc 2520gtattctggc agtataggat cttgtatctg tacattcttc atttttgaac ataggttgca 2580tatgtgccgc atattgatct gcttcttgct gagctcacat aatacttcca tagtttttcc 2640cgtaaacatt ggattcttga tgctacatct tggataatta ccttctggaa gcttatcgat 2700accgtcgagg gcatatggcg cgccgcggcc gctttacgac tcaatgacaa gaagaaaatc 2760ttcgtcaaca tggtggagca cgacactctc gtctactcca agaatatcaa agatacagtc 2820tcagaagacc aaagggctat tgagactttt caacaaaggg taatatcggg aaacctcctc 2880ggattccatt gcccagctat ctgtcacttc atcaaaagga cagtagaaaa ggaaggtggc 2940acctacaaat gccatcattg cgataaagga aaggctatcg ttcaagatgc ctctgccgac 3000agtggtccca aagatggacc cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca 3060accacgtctt caaagcaagt ggattgatgt gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca 3120caatcccact atccttcgca agacccttcc tctatataag gaagttcatt tcatttggag 3180
aggactcgag taccagcagc atcactgtga actgtttcct cttgacaatg atactgagga 3240gttcgctttg attgtaaagt atattcagaa tactcatgct cagacacatt caaattatac 3300agttgatgtt gttcaaatat tcaaggtgac aagagacggt gaaagtgaac gctttaaaaa 3360gttttctgga acaaaaaata gaatgctgtt gtggcatggt tctcggctta ctaactggac 3420tggcattctg tcccaaggtt tgcgcattgc tccacctgaa gcgcctgcca cgggttatat 3480gtttgggaag ggggtttact ttgctgatat gttctccaaa agtgcaaatt attgctatac 3540taattctgcc ttcacaacag gggtgttgct tctatgtgag gttgccctgg gtgacatggc 3600tgagcttcta caagctaggt accccagctt ggtaaggaaa taattatttt cttttttcct 3660tttagtataa aatagttaag tgatgttaat tagtatgatt ataataatat agttgttata 3720attgtgaaaa aataatttat aaatatattg tttacataaa caacatagta atgtaaaaaa 3780atatgacaag tgatgtgtaa gacgaagaag ataaaagttg agagtaagta tattattttt 3840aatgaatttg atcgaacatg taagatgata tactagcatt aatatttgtt ttaatcataa 3900tagtaattct agctggtttg atgaattaaa tatcaatgat aaaatactat agtaaaaata 3960agaataaata aattaaaata atattttttt atgattaata gtttattata taattaaata 4020tctataccat tactaaatat tttagtttaa aagttaataa atattttgtt agaaattcca 4080atctgcttgt aatttatcaa taaacaaaat attaaataac aagctaaagt aacaaataat 4140atcaaactaa tagaaacagt aatctaatgt aacaaaacat aatctaatgc taatataaca 4200aagcgcaaga tctatcattt tatatagtat tattttcaat caacattctt attaatttct 4260aaataatact tgtagtttta ttaacttcta aatggattga ctattaatta aatgaattag 4320tcgaacatga ataaacaagg taacatgata gatcatgtca ttgtgttatc attgatctta 4380catttggatt gattacagtt gggaagctgg gttcgaaatc gattagcttg tagaagctca 4440gccatgtcac ccagggcaac ctcacataga agcaacaccc ctgttgtgaa ggcagaatta 4500gtatagcaat aatttgcact tttggagaac atatcagcaa agtaaacccc cttcccaaac 4560atataacccg tggcaggcgc ttcaggtgga gcaatgcgca aaccttggga cagaatgcca 4620gtccagttag taagccgaga accatgccac aacagcattc tattttttgt tccagaaaac 4680
tttttaaagc gttcactttc accgtctctt gtcaccttga atatttgaac aacatcaact 4740gtataatttg aatgtgtctg agcatgagta ttctgaatat actttacaat caaagcgaac 4800tcctcagtat cattgtcaag aggaaacagt tcacagtgaa gctgctggta tctagagtcc 4860tgctttaatg agatatgcga gacgcctatg atcgcatgat atttgctttc aattctgttg 4920tgcacgttgt aaaaaacctg agcatgtgta gctcagatcc ttaccgccgg tttcggttca 4980ttctaatgaa tatatcaccc gttactatcg tatttttatg aataatattc tccgttcaat 5040ttactgattg taccctacta cttatatgta caatattaaa atgaaaacaa tatattgtgc 5100tgaataggtt tatagcgaca tctatgatag agcgccacaa taacaaacaa ttgcgtttta 5160ttattacaaa tccaatttta aaaaaagcgg cagaaccggt caaacctaaa agactgatta 5220cataaatctt attcaaattt caaaaggccc caggggctag tatctacgac acaccgagcg 5280gcgaactaat aacgttcact gaagggaact ccggttcccc gccggcgcgc atgggtgaga 5340ttccttgaag ttgagtattg gccgtccgct ctaccgaaag ttacgggcac cattcaaccc 5400ggtccagcac ggcggccggg taaccgactt gctgccccga gaattatgca gcattttttt 5460ggtgtatgtg ggccccaaat gaagtgcagg tcaaaccttg acagtgacga caaatcgttg 5520ggcgggtcca gggcgaattt tgcgacaaca tgtcgaggct cagcaggacc tgcaggtcga 5580cggccgagta ctggcaggat atataccgtt gtaatt 5616<210>15<211>457<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>变体棉花parp2片段<220>
<221>变体<222>(2)..(2)<223>T<220>
<221>变体<222>(1)..(1)<223>F或W<220>
<221>变体<222>(3)..(3)<223>E<220>
<221>变体<222>(4)..(4)<223>D<220>
<221>变体<222>(5)..(5)<223>D<220>
<221>变体<222>(6)..(6)<223>A或V或L或I<220>
<221>变体<222>(7)..(7)<223>A或G或L或I<220>
<221>变体<222>(8)..(8)<223>V或G或L或I<220>
<221>变体<222>(9)..(9)<223>A或G或L或I<220>
<221>变体<222>(10)..(10)<223>A或G或V或I<220>
<221>变体<222>(11)..(11)<223>E<220>
<221>变体<222>(12)..(12)<223>N<220>
<221>变体<222>(13)..(13)<223>A或V或L或I<220>
<221>变体<222>(14)..(14)<223>A或V或L或G<220>
<221>变体<222>(16)..(16)<223>E<220>
<221>变体<222>(17)..(17)<223>E<220>
<221>变体<222>(18)..(18)<223>A或V或G或L<220>
<221>变体<222>(19)..(19)<223>R或H<220>
<221>变体<222>(20)..(20)<223>V或L或I或G<220>
<221>变体<222>(21)..(21)<223>R或K<220>
<221>变体<222>(22)..(22)<223>F或W<220>
<221>变体<222>(23)..(23)<223>R或K<220>
<221>变体<222>(24)..(24)<223>A或I或L或G<220>
<221>变体<222>(25)..(25)<223>A或I或V或G<220>
<221>变体<222>(26)..(26)<223>N<220>
<221>变体<222>(27)..(27)<223>R或H<220>
<221>变体<222>(28)..(28)<223>V或L或I或A<220>
<221>变体<222>(29)..(29)<223>E<220>
<221>变体<222>(30)..(30)<223>E<220>
<221>变体<222>(31)..(31)<223>L或G或V或A<220>
<221>变体<222>(32)..(32)<223>F或W<220>
<221>变体<222>(33)..(33)<223>E<220>
<221>变体<222>(34)..(34)<223>G或V或L或I<220>
<221>变体<222>(36)..(36)<223>G或V或I或A<220>
<221>变体<222>(37)..(37)<223>Q<220>
<221>变体<222>(38)..(38)<223>N<220>
<221>变体<222>(39)..(39)<223>S<220>
<221>变体<222>(40)..(40)<223>Q<220>
<221>变体<222>(41)..(41)<223>A或G或I或L<220>
<221>变体<222>(42)..(42)<223>V或A或I或L<220>
<221>变体<222>(43)..(43)<223>N<220>
<221>变体<222>(44)..(44)<223>Q<220>
<221>变体<222>(45)..(45)<223>Q<220>
<221>变体<222>(46)..(46)<223>Q<220>
<221>变体<222>(47)..(47)<223>R或H<220>
<221>变体<222>(48)..(48)<223>Y或W<220>
<221>变体<222>(49)..(49)<223>Y或W<220>
<221>变体<222>(50)..(50)<223>G或I或L或A<220>
<221>变体<222>(51)..(51)<223>G或V或L或A<220>
<221>变体<222>(52)..(52)<223>N<220>
<221>变体<222>(53)..(53)<223>G或V或I或A<220>
<221>变体<222>(54)..(54)<223>G或V或I或A<220>
<221>变体<222>(55)..(55)<223>D<220>
<221>变体<222>(56)..(56)<223>T<220>
<221>变体<222>(57)..(57)<223>E<220>
<221>变体<222>(58)..(58)<223>E<220>
<221>变体<222>(59)..(59)<223>T<220>
<221>变体<222>(60)..(60)<223>R或H<220>
<221>变体<222>(61)..(61)<223>S<220>
<221>变体<222>(62)..(62)<223>F或W<220>
<221>变体<222>(64)..(64)<223>G或I或L或A<220>
<221>变体<222>(65)..(65)<223>R或K<220>
<221>变体<222>(66)..(66)<223>Q<220>
<221>变体<222>(67)..(67)<223>H或K<220>
<221>变体<222>(68)..(68)<223>F或Y<220>
<221>变体<222>(69)..(69)<223>A或V或I或L<220>
<221>变体<222>(70)..(70)<223>K或H<220>
<221>变体<222>(71)..(71)<223>G或A或I或L<220>
<221>变体<222>(72)..(72)<223>V或A或I或L<220>
<221>变体<222>(73)..(73)<223>R或H<220>
<221>变体<222>(74)..(74)<223>V或A或I或L<220>
<221>变体<222>(75)..(75)<223>N<220>
<221>变体<222>(76)..(76)<223>G或V或L或A<220>
<221>变体<222>(77)..(77)<223>R或H<220>
<221>变体<222>(78)..(78)<223>G或I或V或A<220>
<221>变体<222>(79)..(79)<223>R或K<220>
<221>变体<222>(80)..(80)<223>I或A或L或V<220>
<221>变体<222>(83)..(83)<223>Y或W<220>
<221>变体<222>(84)..(84)<223>S<220>
<221>变体<222>(85)..(85)<223>T<220>
<221>变体<222>(86)..(86)<223>K或H<220>
<221>变体<222>(87)..(87)<223>N<220>
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<221>变体<222>(89)..(89)<223>G或I或L或V<220>
<221>变体<222>(90)..(90)<223>G或A或L或V<220>
<221>变体<222>(91)..(91)<223>E<220>
<221>变体<222>(92)..(92)<223>D<220>
<221>变体<222>(93)..(93)<223>Y或W<220>
<221>变体<222>(94)..(94)<223>N<220>
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<221>变体<222>(96)..(96)<223>R或H<220>
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<221>变体<222>(99)..(99)<223>Q<220>
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<221>变体<222>(101)..(101)<223>S<220>
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<221>变体<222>(103)..(103)<223>Q<220>
<221>变体<222>(104)..(104)<223>F或W<220>
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<221>变体<222>(106)..(106)<223>F或W<220>
<221>变体<222>(107)..(107)<223>Q<220>
<221>变体<222>(108)..(108)<223>K或H<220>
<221>变体<222>(109)..(109)<223>R或H<220>
<221>变体<222>(110)..(110)<223>E<220>
<221>变体<222>(111)..(111)<223>Y或W<220>
<221>变体<222>(112)..(112)<223>G或I或L或A<220>
<221>变体<222>(114)..(114)<223>R或K<220>
<221>变体<222>(116)..(116)<223>R或H<220>
<221>变体<222>(118)..(118)<223>F或W<220>
<221>变体<222>(119)..(119)<223>S<220>
<221>变体<222>(120)..(120)<223>G或A或V或I<220>
<221>变体<222>(121)..(121)<223>G或A或V或I<220>
<221>变体<222>(122)..(122)<223>D<220>
<221>变体<222>(124)..(124)<223>E<220>
<221>变体<222>(125)..(125)<223>F或W<220>
<221>变体<222>(126)..(126)<223>E<220>
<221>变体<222>(127)..(127)<223>D<220>
<221>变体<222>(128)..(128)<223>R或H<220>
<221>变体<222>(129)..(129)<223>D<220>
<221>变体<222>(130)..(130)<223>R或H<220>
<221>变体<222>(131)..(131)<223>D<220>
<221>变体<222>(132)..(132)<223>T<220>
<221>变体<222>(133)..(133)<223>E<220>
<221>变体<222>(134)..(134)<223>G或A或I或L<220>
<221>变体<222>(135)..(135)<223>R或H<220>
<221>变体<222>(136)..(136)<223>K或H<220>
<221>变体<222>(137)..(137)<223>R或H<220>
<221>变体<222>(138)..(138)<223>G或I或L或V<220>
<221>变体<222>(139)..(139)<223>Q<220>
<221>变体<222>(140)..(140)<223>T<220>
<221>变体<222>(141)..(141)<223>T<220>
<221>变体<222>(142)..(142)<223>G或V或L或A<220>
<221>变体<222>(143)..(143)<223>I或V或L或A<220>
<221>变体<222>(144)..(144)<223>I或V或L或G<220>
<221>变体<222>(145)..(145)<223>N<220>
<221>变体<222>(146)..(146)<223>G或V或I或A<220>
<221>变体<222>(147)..(147)<223>K或H<220>
<221>变体<222>(148)..(148)<223>D<220>
<221>变体<222>(149)..(149)<223>S<220>
<221>变体<222>(150)..(150)<223>R或H<220>
<221>变体<222>(151)..(151)<223>G或V或I或A<220>
<221>变体<222>(152)..(152)<223>D<220>
<221>变体<222>(153)..(153)<223>N<220>
<221>变体<222>(154)..(154)<223>K或H<220>
<221>变体<222>(155)..(155)<223>G或I或L或A<220>
<221>变体<222>(156)..(156)<223>G或I或L或V<220>
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1.产生耐受胁迫的棉花植物的方法，其包括以下步骤a)将嵌合基因导入棉花细胞以产生转基因棉花细胞，所述嵌合基因包含下列有效连接的DNA片段i)植物可表达的启动子；ii)可转录的DNA区域，其包含(1)包含20个连续核苷酸中至少19个的核苷酸序列的第一DNA区域，所述20个连续核苷酸选自棉花物种或与棉花祖先物种相关的物种parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列；(2)包含选自所述第一DNA区域中20个连续核苷酸的至少19个的核苷酸序列的第二DNA区域；其中所述第一DNA区域和所述第二DNA区域处于彼此反向重复的方向并且其中转录自所述可转录区域的RNA分子能够在转录自所述第一DNA区域的RNA区域与转录自所述第二DNA区域的RNA区域间形成双链RNA区域；和iii)包含在植物中有功能的转录终止和聚腺苷酸化信号的DNA区域；b)再生所述转基因棉花细胞以得到转基因棉花植物；以及c)鉴定比未转化的棉花植物更抵抗非生物性胁迫条件的转基因棉花植物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述parp2基因或parp2 cDNA的所述核苷酸序列包含任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ IDNo12、SEQ ID No18、SEQ ID No19或SEQ ID No20的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述parp2基因或parp2 cDNA的所述核苷酸序列包含编码蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质包含SEQ IDNo13或SEQ ID No21或SEQ ID No22的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述parp2基因或parp2 cDNA的所述核苷酸序列包含编码蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质包含SEQ IDNo15的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至3中任意一项所述的方法，其中所述第一DNA区域和所述第二DNA区域包含至少50个连续核苷酸。
6.根据权利要求1至3中任意一项所述的方法，其中所述第一DNA区域和所述第二DNA区域包含至少200个连续核苷酸。
7.根据权利要求1至5中任意一项所述的方法，其中比未转化的棉花植物更抵抗非生物性胁迫条件的所述转基因棉花植物使用纤维组织培养物测定法进行鉴定。
8.根据权利要求1至5中任意一项所述的方法，其中比未转化的棉花植物更抵抗非生物性胁迫条件的所述转基因棉花植物使用冷萌发测定法进行鉴定。
9.根据权利要求1至5中任意一项所述的方法，其中比未转化的棉花植物更抵抗非生物性胁迫条件的所述转基因棉花植物通过测定任一活性氧类、NAD或ATP的浓度进行鉴定。
10.产生耐受胁迫的棉花植物的方法，其包括以下步骤a)向所述棉花植物的细胞提供一种或多种双链RNA分子，其中所述双链RNA分子包含两条RNA链，一条RNA链基本上由20至21个连续核苷酸中19个的RNA核苷酸序列组成，所述20至21个连续核苷酸选自棉花物种或与棉花祖先物种相关的物种parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列；以及b)鉴定包含所述双链RNA分子的比不包含该双链RNA分子的相同棉花植物更抵抗非生物性胁迫条件的棉花植物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述双链RNA通过嵌合基因整合入所述细胞的基因组而向所述细胞提供，所述嵌合基因包含以下有效连接的DNA片段a)植物可表达的启动子；b)包含处于反义方向的20个连续核苷酸中至少19个核苷酸的DNA区域，所述20个连续核苷酸选自来自棉花物种或来自与棉花祖先物种相关的物种parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列；c)包含在植物中有功能的转录终止和聚腺苷酸化信号的DNA区域。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述双链RNA通过嵌合基因整合入所述细胞的基因组向所述细胞提供，所述嵌合基因包含以下有效连接的DNA片段a)植物可表达的启动子；b)包含处于有义方向的20个连续核苷酸中至少19个核苷酸的DNA区域，所述20个连续核苷酸选自来自棉花物种或来自与棉花祖先物种相关的物种parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列；c)包含在植物中有功能的转录终止和聚腺苷酸化信号的DNA区域。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述双链RNA通过嵌合基因整合入所述细胞的基因组向所述细胞提供，所述嵌合基因包含以下有效连接的DNA片段a)植物可表达的启动子；b)可转录的DNA区域，其包含i)包含处于有义方向的20个连续核苷酸中至少19个核苷酸的第一DNA区域，所述20个连续核苷酸选自来自棉花物种或来自与棉花祖先物种相关的物种parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列；ii)包含处于有义方向的20个连续核苷酸中至少19个核苷酸的第二DNA区域，所述20个连续核苷酸选自来自棉花物种或来自与棉花祖先物种相关的物种parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列，其中通过转录所述可转录DNA区域产生的RNA分子能够在对应于所述第一DNA区域的RNA区域与对应于所述第二RNA区域的RNA区域间通过碱基配对形成双链RNA区；以及c)包含在植物中有功能的转录终止和聚腺苷酸化信号的DNA区域。
14.根据权利要求10至13中任意一项所述的方法，其中所述parp2基因或parp2 cDNA的所述核苷酸序列包含任一SEQ ID No5、SEQ IDNo6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No18、SEQ ID No19或SEQ ID No20的核苷酸序列。
15.根据权利要求10至13中任意一项所述的方法，其中所述parp2基因或parp2 cDNA的所述核苷酸序列包含编码蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质包含SEQ ID No13或SEQ ID No21或SEQ ID No22的氨基酸序列。
16.根据权利要求10至13中任意一项所述的方法，其中所述parp2基因或parp2 cDNA的所述核苷酸序列包含编码蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质包含SEQ ID No15的氨基酸序列。
17.产生耐受胁迫的棉花植物的方法，其包括以下步骤a)使用选自如下的手段，从能够获自棉花物种如陆地棉(Gossypiumhirsutum)、海岛棉(Gossypium barbadense)、树棉(Gossypium arboreum)或草棉(Gossypium herbaceum)或从与棉花祖先物种相关的棉花物种如雷蒙德氏棉(Gossypium raimodii)、三裂棉(Gossypium trilobum)和拟似棉(Gossypium gossypium)的基因组DNA或cDNA鉴定编码PARP2的DNA序列的片段i)用作探针的DNA片段，其包含编码氨基酸序列SEQ ID No13的核苷酸序列；ii)用作探针的DNA片段，其包含任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No19或SEQ ID No20的核苷酸序列；iii)用作探针的DNA片段或寡核苷酸，其包含由选自编码氨基酸序列SEQ ID No13的核苷酸序列中20至1382个连续核苷酸组成的核苷酸序列；iv)用作探针的DNA片段或寡核苷酸，其包含由选自编码氨基酸序列SEQ ID No21或22的核苷酸序列中20至2000个连续核苷酸组成的核苷酸序列；v)用作探针的DNA片段或寡核苷酸，其包含由选自任一SEQ IDNo5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ IDNo10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No19或SEQ ID No20的核苷酸序列中20至2000个连续核苷酸组成的核苷酸序列；vi)用作PCR反应中引物的寡核苷酸序列，其具有包含选自编码氨基酸序列SEQ ID No13的核苷酸序列中20至200个连续核苷酸的核苷酸序列；vii)用作PCR反应中引物的寡核苷酸序列，其具有包含选自编码氨基酸序列SEQ ID No21或22的核苷酸序列中20至200个连续核苷酸的核苷酸序列；viii)用作PCR反应中引物的寡核苷酸序列，其具有包含选自任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No19或SEQ IDNo20的核苷酸序列中20至200个连续核苷酸的核苷酸序列；或ix)用作PCR反应中引物的寡核苷酸序列，其具有任一SEQ IDNo1、SEQ ID No2、SEQ ID No3、SEQ ID No4、SEQ ID No16或SEQID No17的核苷酸序列；x)使用如vi、vii、viii或ix中所述的寡核苷酸作为引物从棉花基因组或cDNA中能够扩增的片段，如用作探针的包含核苷酸序列SEQ IDNo18的片段；b)向所述棉花植物的细胞提供一种或多种双链RNA分子，其中所述双链RNA分子包含两条RNA链，一条RNA链基本上由20至21个连续核苷酸的RNA核苷酸序列组成，所述20至21个连续核苷酸选自编码PARP2的DNA序列的所述片段的核苷酸序列；和c)鉴定包含所述双链RNA分子的比不包含该双链RNA分子的相同棉花植物更抵抗非生物性胁迫条件的棉花植物。
18.权利要求17所述的方法，其中所述双链RNA分子的提供通过向所述植物细胞提供双链RNA分子而实现，该双链RNA分子包含20个连续核苷酸中至少19个的第一核苷酸序列和与所述第一核苷酸序列互补的第二核苷酸序列，其中所述20个连续核苷酸选自编码PARP2的DNA序列的所述片段的核苷酸序列。
19.权利要求17所述的方法，其中所述双链RNA分子通过嵌合DNA整合入植物基因组而提供，所述嵌合DNA包含以下有效连接的DNA片段a)植物可表达的启动子；b)可转录的DNA区域，其包含i)包含20个连续核苷酸中至少19个的核苷酸序列的第一DNA区域，所述20个连续核苷酸选自编码PARP2的DNA序列的所述片段的核苷酸序列；ii)包含选自所述第一DNA区域中至少19个连续核苷酸的核苷酸序列的第二DNA区域；其中所述第一DNA区域和所述第二DNA区域处于彼此反向重复的方向并且其中转录自所述可转录区域的RNA分子能够在转录自所述第一DNA区域的RNA区域与转录自所述第二DNA区域的RNA区域间形成双链RNA区域；和iii)包含在植物中有功能的转录终止和聚腺苷酸化信号的DNA区域。
20.根据权利要求1至19中任意一项所述的方法，其还包括将所述抗胁迫棉花植物与另一种棉花植物杂交以得到抵抗胁迫的棉花子代植物的步骤。
21.鉴定棉花parp2 DNA片段的方法，其包括以下步骤a) 提供能够获自棉花物种如陆地棉、海岛棉、树棉或草棉中或从与棉花祖先物种相关的棉花物种如雷蒙德氏棉、三裂棉和拟似棉的基因组DNA或cDNA；b)选择如下一种方式i)用作探针的DNA片段，其包含编码氨基酸序列SEQ ID No13的核苷酸序列；ii)用作探针的DNA片段，其包含任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No19或SEQ ID No20的核苷酸序列；iii)用作探针的DNA片段或寡核苷酸，其包含由选自编码氨基酸序列SEQ ID No13的核苷酸序列中20至1382个连续核苷酸组成的核苷酸序列；iv)用作探针的DNA片段或寡核苷酸，其包含由选自编码氨基酸序列SEQ ID No21或22的核苷酸序列中20至2000个连续核苷酸组成的核苷酸序列；v)用作探针的DNA片段或寡核苷酸，其包含由选自任一SEQ IDNo5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ IDNo10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No19或SEQ ID No20的核苷酸序列中20至2000个连续核苷酸组成的核苷酸序列；vi)用作PCR反应中引物的寡核苷酸序列，其具有包含选自编码氨基酸序列SEQ ID No13的核苷酸序列中20至200个连续核苷酸的核苷酸序列；vii)用作PCR反应中引物的寡核苷酸序列，其具有包含选自编码氨基酸序列SEQ ID No21或22的核苷酸序列中20至200个连续核苷酸的核苷酸序列；viii)用作PCR反应中引物的寡核苷酸序列，其具有包含选自任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No19或SEQ IDNo20的核苷酸序列中20至200个连续核苷酸的核苷酸序列；或ix)用作PCR反应中引物的寡核苷酸序列，其具有任一SEQ IDNo1、SEQ ID No2、SEQ ID No3、SEQ ID No4、SEQ ID No16或SEQID No17的核苷酸序列；x)使用如vi、vii、viii或ix中所述的寡核苷酸作为引物从棉花基因组或cDNA中能够扩增的片段，如用作探针的包含核苷酸序列SEQ IDNo18的片段；c)通过使用所述基因组或所述cDNA以及所述引物实施PCR或通过使用所述基因组或所述cDNA以及所述探针实施杂交而鉴定所述片段。
22.分离棉花parp2 DNA片段的方法，其包括以下步骤a)根据权利要求21所述的方法鉴定所述的棉花parp2片段；和b)分离所述的棉花parp2片段。
23.鉴定与增加的胁迫耐性相关的棉花parp2等位基因的方法，其包括以下步骤a)提供不同棉花植物品系或与棉花祖先植物相关的植物品系的群体，任选地是诱变的群体；b)根据权利要求21所述的方法鉴定所述群体中每一植物品系的parp2等位基因；c)分析所述群体的每一植物品系的胁迫抗性并鉴定那些棉花植物品系；d)将植物品系提高的胁迫抗性与特定parp2等位基因的存在相关联。
24.获得耐受胁迫的棉花植物的方法，其包括以下步骤a)根据权利要求23所述的方法鉴定与增加的胁迫耐性相关的棉花parp2等位基因；b)将所述的棉花parp2等位基因导入选择的棉花植物品系。
25.鉴定抵抗胁迫的棉花植物的方法，其包括以下步骤a)自所述棉花植物起始纤维组织培养物；b)使所述的纤维组织培养物受到胁迫条件作用，和c)将所述培养物中的纤维起始或延伸与自对照植物起始并受到所述胁迫条件作用的培养物中的纤维起始或延伸进行比较。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述的胁迫条件包含使所述的纤维组织培养物受到升高的温度作用选择的时间期间。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述升高的温度选自45℃至50℃范围，并且所述时间期间选自2小时至4小时范围。
28.分离的DNA片段，其编码包含SEQ ID No13、SEQ ID No15、SEQ ID No21或SEQ ID No22的氨基酸序列的蛋白质。
29.分离的DNA片段，其编码包含SEQ ID No15的氨基酸序列的蛋白质。
30.分离的DNA片段，其包含选自任一核苷酸序列SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No18、SEQ ID No19或SEQ IDNo20的核苷酸序列。
31.分离的DNA片段，其能够通过权利要求21所述的方法获得。
32.包含以下有效连接的DNA片段的嵌合基因a)植物可表达的启动子；b)可转录的DNA区域，其包含i)包含处于有义方向的至少20个连续核苷酸的第一DNA区域，所述20个连续核苷酸选自来自棉花物种或来自与棉花祖先物种相关的物种parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列；ii)包含处于有义方向的至少20个连续核苷酸的第二DNA区域，所述20个连续核苷酸选自来自棉花物种或来自与棉花祖先物种相关的物种parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列；其中通过转录所述可转录的DNA区域产生的RNA分子能够通过碱基配对在对应于所述第一DNA区域的RNA区域与对应于所述第二RNA区域的RNA区域间形成双链RNA区；和c)包含在植物中有功能的转录终止和聚腺苷酸化信号的DNA区域。
33.包含以下有效连接的DNA片段的嵌合基因a)植物可表达的启动子；b)包含处于有义方向的至少20个连续核苷酸的DNA区域，所述20个连续核苷酸选自来自棉花物种或来自与棉花祖先物种相关的物种parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列；以及c)包含在植物中有功能的转录终止和聚腺苷酸化信号的DNA区域。
34.包含以下有效连接的DNA片段的嵌合基因a)植物可表达的启动子；b)包含处于反义方向的至少20个连续核苷酸的DNA区域，所述20个连续核苷酸选自来自棉花物种或来自与棉花祖先物种相关的物种parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列；以及c)包含在植物中有功能的转录终止和聚腺苷酸化信号的DNA区域。
35.根据权利要求32至34中任意一项所述的嵌合基因，其中所述parp2基因或parp2 cDNA的所述核苷酸序列包含任一SEQ ID No5、SEQ IDNo6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No18、SEQ ID No.19或SEQ ID No.20的核苷酸序列。
36.根据权利要求32至34中任意一项所述的嵌合基因，其中所述parp2基因或parp2 cDNA的所述核苷酸序列包含编码蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质包含SEQ ID No13、SEQ ID No20或SEQ ID No21的氨基酸序列。
37.据权利要求32至34中任意一项所述的嵌合基因，其中所述parp2基因或parp2 cDNA的所述核苷酸序列包含编码蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质包含SEQ ID No15的氨基酸序列。
38.棉花植物细胞，其包含权利要求32至37中任意一项所述的嵌合DNA。
39.棉花植物，其基本上由权利要求38所述的棉花植物细胞组成。
40.棉花植物，其能够通过权利要求24所述的方法获得。
41.根据权利要求39或权利要求40所述的棉花植物的种子。
42.编码包含氨基酸序列SEQ ID No13、SEQ ID No21或SEQ IDNo22的蛋白质的核苷酸序列或包含其20个连续核苷酸中至少19个的部分的用途，用于增加棉花植物的胁迫耐性。
43.编码包含氨基酸序列SEQ ID No.15的蛋白质的核苷酸序列或包含其20个连续核苷酸中至少19个的部分的用途，用于增加棉花植物的胁迫耐性。
44.任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ IDNo18、SEQ ID No19或SEQ ID No20的核苷酸序列或包含其20个连续核苷酸中至少19个的部分的用途，用于增加棉花植物的胁迫耐性。
45.编码包含氨基酸序列SEQ ID No.13的蛋白质的核苷酸序列或包含其20个连续核苷酸中至少19个的部分的用途，用于在棉花物种如陆地棉、海岛棉、树棉或草棉中或从与棉花祖先物种相关的棉花物种如雷蒙德氏棉、三裂棉和拟似棉中鉴定parp2基因或parp2 cDNA。
46.编码包含氨基酸序列SEQ ID No.15的蛋白质的核苷酸序列或包含其20个连续核苷酸中至少19个的部分的用途，用于在棉花物种如陆地棉、海岛棉、树棉或草棉中或从与棉花祖先物种相关的棉花物种如雷蒙德氏棉、三裂棉和拟似棉中鉴定parp2基因或parp2 cDNA。
47.任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ IDNo18、SEQ ID No19或SEQ ID No20的核苷酸序列或包含其20个连续核苷酸中至少19个的部分的用途，用于在棉花物种如陆地棉、海岛棉、树棉或草棉中或从与棉花祖先物种相关的棉花物种如雷蒙德氏棉、三裂棉和拟似棉中鉴定parp2基因或parp2 cDNA。
48.编码包含氨基酸序列SEQ ID No13、SEQ ID No.21或SEQ IDNo22的蛋白质的核苷酸序列或包含其20个连续核苷酸中至少19个的部分的用途，用于在棉花物种如陆地棉、海岛棉、树棉或草棉中或从与棉花祖先物种相关的棉花物种如雷蒙德氏棉、三裂棉和拟似棉中鉴定耐受胁迫的parp2等位基因。
49.编码包含氨基酸序列SEQ ID No.15的蛋白质的核苷酸序列或包含其20个连续核苷酸中至少19个的部分的用途，用于在棉花物种如陆地棉、海岛棉、树棉或草棉中或从与棉花祖先物种相关的棉花物种如雷蒙德氏棉、三裂棉和拟似棉中鉴定耐受胁迫的parp2等位基因。
50.任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ IDNo18、SEQ ID No19或SEQ ID No20的核苷酸序列或包含其20个连续核苷酸中至少19个的部分的用途，用于在棉花物种如陆地棉、海岛棉、树棉或草棉中或从与棉花祖先物种相关的棉花物种如雷蒙德氏棉、三裂棉和拟似棉中鉴定耐受胁迫的parp2等位基因。
51.编码包含氨基酸序列SEQ ID No13、SEQ ID No21或SEQ IDNo22的蛋白质的核苷酸序列或包含其20个连续核苷酸中至少19个的部分的用途，用于在棉花物种内导入耐受胁迫的parp2等位基因。
52.编码包含氨基酸序列SEQ ID No.15的蛋白质的核苷酸序列或包含其20个连续核苷酸中至少19个的部分的用途，用于在棉花物种内导入耐受胁迫的parp2等位基因。
53.任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ IDNo18、SEQ ID No19或SEQ ID No20的核苷酸序列或包含其20个连续核苷酸中至少19个的部分的用途，用于在棉花物种内导入耐受胁迫的parp2等位基因。
全文摘要
本发明涉及棉花parp2基因或cDNA序列用于获得耐受胁迫的棉花植物的用途。本发明还提供了多个棉花parp2序列。
文档编号A01H5/00GK101090971SQ200580045194
公开日2007年12月19日 申请日期2005年10月27日 优先权日2004年10月29日
发明者M·范托尔诺特, A·雷纳尔特斯, J·雅各布斯 申请人:拜尔生物科学公司