专利名称：一种具有杀线虫功能的菌剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有杀线虫功能的菌剂及其应用，属微生物农药技术领域。
背景技术：
植物寄生线虫是一种世界范围内普遍发生的植物病害，仅根结线虫已知种类达70多种，为害3000多种植物，每年造成的损失巨大。据联合国粮农组织统计，每年因线虫造成损失全球高达1000亿美元。在我国，线虫主要危害烟草、花卉、蔬菜、棉花、大豆、花生、三七、西洋参等主要经济作物，成为发展这些作物的重要限制因子。据全国烟草病虫害防治信息中心不完全统计，仅云南省发病面积就达2.7万公倾，直接经济损失1.2亿元，间接损失更为严重。黑龙江省仅大豆胞囊线虫每年造成的损失达8亿元之多。松材线虫被称为无烟森林火灾，在江苏、浙江、广东、山东、安徽、湖北、上海、台湾、香港等部份地区严重发生，有向全国漫延的趋势。在山东、广东、海南和云南等蔬菜主产区，蔬菜根结线虫呈上升趋势。更严重的是由于根结线虫侵染后，造成作物伤口，致使作物根部病害严重发生。云南的三七根腐就是典型例子。化学杀线虫剂自上个世纪40年代发现以来，在线虫防治中发挥了重要作用。但是随着科学技术的进步，发现许多化学杀线虫剂均有副作用，造成环境污染，危害人体健康。相继有不少被禁用或即将禁用。特别是植物寄生线虫发生于作物根部，由于土壤环境的特殊性，必须大剂量施用才能保证其防效。而大剂量化学农药对地下水污染非常严重。因此，研究开发高效低毒低残留杀线虫剂已经是农业可持续发展中的重要课题。
经文献检索，未见与本发明相同的公开报道。
发明内容
本发明的目的是通过对一株具有产生酶而分解线虫功能的嗜麦芽窄食单胞菌研究，开发生物杀线虫剂。
本发明筛选到的一株对植物寄生线虫具有很好杀虫功能的嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonas maltophilia)G6，G6菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2005年10月31日；保藏登记入册的编号CGMCC No1522。
本发明stenotrophomonas maltiphilia G6菌株形态特征为微弯或直杆状，典型的细胞长2μm，宽0.5μm。在MBA平板上菌落灰色到绿色，圆形，隆起，湿润有光泽。G6菌株的杀线虫机制理为先形成粗蛋白分解线虫体壁，通过体壁侵入线虫体内，最终将线虫全部分解。在整个杀线虫过程中，伴随着产生蛋白酶、几丁质酶对线虫的作用。
stenotrophomonas maltophilia G6是发明人在开展的食线虫菌物研究中，从大量样品中分离获得，发现其对线虫具极高的杀虫活性。将菌株纯化并进行多批次杀线虫活性试验后，委托云南大学微生物研究所对菌株进行鉴定，确定为嗜麦芽寡食(窄食)单胞菌stenotrophomonas maltophilia G6。
本发明是这样实现的扩大培养G6菌株，提取杀线虫有效成分，进行杀线虫药效试验，确定其对线虫的作用。
G6培养方法(以下为重量百分比)1、试管种培养培养基配方为1-3％酵母浸膏、0.5-2％蛋白胨、1-4％葡萄糖、1.8-2％琼脂、余下为水，pH7。将G6菌丝体接种到培养基上，30℃下培养2天，获得试管种。
2、液体扩大培养液体培养基配方为1-3％酵母粉、10-20％大豆饼粉、0.5-2％鱼粉、1-4葡萄糖、余下为水，pH7。将试管种接种到250ml三角瓶液体培养基中，每瓶装100ml，于30℃下摇床培养培养时间2天，转速为220rpm。
3、提取杀线虫活性成份将发酵培养物于8000rpm/min离心20分钟，取上清液，按1∶0.85的比例加入硫酸铵，于4℃静置2小时，然后8000rpm/min离心30分钟，弃上清。用10mM的tris-HCl缓冲液(PH8.0)重新溶解，将重新溶解所获溶液装入21mm透析袋(MW8,000-14400KDa)于20倍的10mMtris-HCl缓冲液(PH8.0)中透析4次，每次3小时，即得杀线虫药液。将药液保存于4℃冰箱中待用。
G6杀线虫活性试验1、制备试验用药剂按前述液体扩大培养方法培养G6菌株，按前述提取杀线虫活性成份的方法制备试验用药剂。
2、制备对照用药剂对照1前述1制备试验用药剂方法制备对照用药剂，但培养基中不接入G6菌株。
对照2以清水作为对照。
对照3为了证明杀线虫有效成份是蛋白，将制备的供试药剂煮沸灭活后作为对照。
2、制备试验用线虫(1)制备Panagrellus redivivus线虫将P.redivivus线虫接种于燕麦片培养基上，于28℃下培养6天，冻于4℃冰箱备用。将所需线虫用贝曼漏斗法洗出，置于5ml离心管内，加5ml无菌水洗涤，瞬时离心，弃上清，重复5次得到洁净供试线虫。用无菌水将线虫稀释为含量为15条/μl的线虫悬浮液。
(2)制备松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)在100ml三角瓶中放入15g经水浸泡2天的玉米粒，加水10ml，高压灭菌，接入灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。25℃培养5天。待菌丝铺满三角瓶后，接种经0.25％次氯酸钠表面消毒的松材线虫，28℃培养15至20天。用无菌水将线虫洗下，制成含量为15条/μl的线虫悬浮液。
3、试验方法(1)药效试验方法取试验用药剂200μl于1.5ml离心管中，加入活线虫150条，离心管平放，置于25℃下，Panagrellus redivivus线虫分别于12小时、24小时、48小时；松材线虫分别于24小时、48小时、60小时检查计算线虫的死亡率。并在光学显微镜下观察，观察线虫体壁变化情况鉴定死亡的方法为在处理离心管中加入1-5滴5％Nacl溶液，2分钟后观察，死虫僵直，活虫则卷曲或扭动。
分别用3种对照药剂，每处理重复三次。
4、试验结果表1 G6菌株对Panagrellus redivivus作用效果
表2 对松材线虫作用效果
结果表明，从G6菌株液体发酵产物中提取的试验用药剂对Panagrellus redivivus线虫和松材线虫均具较好的杀虫效果，线虫的平均死亡率在95％以上。从处理线虫的变化来看，经历了从部份体壁溶解(图2)到虫体全部溶解的过程(图3)，说明活性成份主要为分解线虫的酶类。而将同批提取的试验用药剂经过煮沸，导致蛋白质变性后，其杀线虫活性非常小，且线虫体壁不出现溶解现象，这也证明了G6对线虫的活性成份主要为酶类。
本发明G6菌株主要作用成份是酶，对线虫特别是松材线虫具有显著的毒杀作用。同时G6菌株在本发明培养条件下生长极快，具备了很好的应用开发前景。
图1显示处理线虫12小时被固定情况。
图2显示处理线虫24小时分解情况。
图3显示处理线虫36小时分解情况。
图4显示虫体保持完好的对照线虫。
具体实施例方式以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。
实施例一将stenotrophomonas maltophilia G6菌体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为2％酵母浸膏、1.5％蛋白胨、2％葡萄糖、1.8％琼脂、余下为水，pH为7。将G6菌丝体接种到培养基上，30℃下培养2天，获得试管种。
将试管种接种到250ml三角瓶液体培养基中(每瓶装100ml)，液体培养基配方为2％酵母粉、15％大豆饼粉、1％鱼粉、3％葡萄糖、余下为水，pH7。于30℃下摇床培养培养时间2天，转速为220rpm。
将发酵培养物于8000rpm/min离心20分钟，取上清液，按1∶0.85的比例加入硫酸铵，于4℃静置2小时，然后8000rpm/min离心30分钟，弃上清。用10mM的tris-hcl(pH8.0)重新溶解，将重新溶解所获溶液装入21mm透析袋(MW8,000-14400KDa)于20倍的10mMtris-hcl(pH8.0)中透析4次，即得杀线虫药液。
实施例二基本同实施例一，不同之处是液体培养基配方，其配方为3％酵母粉、10％大豆饼粉、2％鱼粉、1％葡萄糖、余下为水。
实施例三基本同实施例一，不同之处是液体培养基配方，其配方为1％酵母粉、20％大豆饼粉、0.5％鱼粉、4％葡萄糖、余下为水。
权利要求
1.一种具有杀线虫功能的菌剂，由生产菌株经试管种培养、液体扩大培养及提取杀线虫活性成份工序后得到，其特征在于该菌剂由如下步骤得到a.生产菌株为嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonas maltophilia)G6，该菌株已于2005年10月31日保藏在中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，保藏登记入册的编号CGMCC No1522；b.试管种培养将G6菌丝体接种到配方为1-3％酵母浸膏、0.5-2％蛋白胨、1-4％葡萄糖、1.8-2％琼脂、余下为水，pH7的培养基上，30℃下培养2天，获得试管种；c.液体培养将试管种接种到250ml三角瓶液体培养基中，每瓶装100ml，于30℃下摇床培养培养时间2天，转速为220rpm；液体培养基配为1-3％酵母粉、10-20％大豆饼粉、0.5-2％鱼粉、1-4％葡萄糖、余下为水，pH7；d.提取杀线虫活性成份将发酵培养物于8000rpm/min离心20分钟，取上清液，按1∶0.85的比例加入硫酸铵，于4℃静置2小时，然后8000rpm/min离心30分钟，弃上清，用10mM的tris-HCl缓冲液重新溶解，将重新溶解所获溶液装入21mm透析袋于20倍的10mMtris-HCl缓冲液中透析4次，每次3小时，即得杀线虫药液。
2.权利要求1所述的菌剂的应用，其特征在于该菌剂对Panagrellus redivivus线虫和松材线虫具有毒杀作用，可应用于植物寄生线虫的生物防治。
全文摘要
本发明涉及一种具有杀线虫功能的菌剂及其应用，属微生物农药技术领域。本发明菌剂由生产菌株经试管种培养、液体扩大培养及提取杀线虫活性成分工序后得到，其生产菌株为嗜麦芽窄食单胞菌stenotrophomonas maltophilia G6，G6菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2005年10月31日；保藏登记入册的编号CGMCC No1522。G6菌株的主要作用机理是通过产生酶，分解线虫体壁，从而对线虫特别是松材线虫产生显著的毒杀作用，可制备为生物杀线剂。本发明产品对松材线虫具有毒力高的突出优点，具有较好的潜在应用前景。
文档编号A01P5/00GK1806554SQ20061001068
公开日2006年7月26日 申请日期2006年2月14日 优先权日2006年2月14日
发明者张克勤, 刘军伟, 周薇 申请人:云南大学