专利名称：天然多组分抗菌蛋白发酵液的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白液的制备方法。
背景技术：
土传病害是我国农业生产中一种重要的病害，主要使用高毒、剧毒化学农药或使用农用抗生素来进行防治。而化学农药存在安全性差、污染环境、危害人体健康等问题；农用抗生素虽在一定程度上解决了化学农药所存在的问题，但对土传病害防效显著的种类极少，且长期使用会导致病原菌抗药性的产生，以及同类医药抗生素在人体失效，对人体健康形成潜在危害。微生物产生的抗菌蛋白制品在生物防治领域的应用已取得了一定的成效，但是由于现有的抗菌蛋白制品毒性大、抗菌谱窄、在实际应用中受到一定的限制。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前农用抗生素对土传病害防效显著的种类极少，长期使用导致病原菌产生抗药性及同类医药抗生素在人体失效和现有抗菌蛋白制品毒性大、抗菌谱窄的问题，而提供的一种天然多组分抗菌蛋白发酵液的制备方法。天然多组分抗菌蛋白发酵液按以下步骤制备(一)将侧孢芽孢杆菌菌株BL-21接种到斜面活化培养基上，在30±2℃的条件下活化培养24±0.5h；(二)按50mL液体种子培养基接种一满环侧孢芽孢杆菌菌株BL-21的比例将经过活化的侧孢芽孢杆菌菌株BL-21接种到液体种子培养基，然后再在30±2℃、180r/min的条件下培养18～24h；(三)将液体种子培养液与发酵培养基混合，液体种子培养液占混合液总体积的3％～4％，混合液在30±2℃、180r/min的条件下培养48～120h，即得到天然多组分抗菌蛋白发酵液；其中斜面活化培养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基或葡萄糖蛋白胨固体培养基，液体种子培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基，发酵培养基按蛋白胨3～6g、牛肉膏1～4g、氯化钠4～5g和水1000mL的比例制成，发酵培养基的pH值为7.0。本发明选用的侧孢芽孢杆菌菌株BL-21(《生物技术》2005 Vol.15 No.3P.64-67)对环境和人体健康安全性高。本发明制备的天然多组分抗菌蛋白发酵液可直接使用，为绿色农产品，无毒无害，不污染环境，对人体无不良影响。本发明制备的天然多组分抗菌蛋白发酵液中含有多种抗菌蛋白，抑菌谱广，对多种植物病原真菌、部分革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌都有抑制作用，适合用于防治多种作物、果疏的土传病害。
图1和图2是天然多组分抗菌蛋白发酵液分成三组进行抑菌试验的结果图，图1培养基上的病菌是辣椒根腐病菌，图2培养基上的病菌是辣椒炭疽病菌。
具体实施例方式
具体实施方式
一本实施方式天然多组分抗菌蛋白发酵液按以下步骤制备(一)将侧孢芽孢杆菌菌株BL-21接种到斜面活化培养基上，在30±2℃的条件下活化培养24±0.5h；(二)按50mL液体种子培养基接种一满环侧孢芽孢杆菌菌株BL-21的比例将经过活化的侧孢芽孢杆菌菌株BL-21接种到液体种子培养基，然后再在30±2℃、180r/min的条件下培养18～24h；(三)将液体种子培养液与发酵培养基混合，液体种子培养液占混合液总体积的3％～4％，混合液在30±2℃、180r/min的条件下培养48～120h，即得到天然多组分抗菌蛋白发酵液；其中斜面活化培养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基或葡萄糖蛋白胨固体培养基，液体种子培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基，发酵培养基按蛋白胨3～6g、牛肉膏1～4g、氯化钠4～5g和水1000mL的比例制成，发酵培养基的pH值为7.0。
本实施方式制备的天然多组分抗菌蛋白发酵液经过胰蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶酶解后，抑菌活性明显降低，甚至消失。说明产生抑菌活性的物质为蛋白质性质。将本实施方式制备的天然多组分抗菌蛋白发酵液进行了初步分析，结果表明在紫外反射光源254nm下，在展层后的绿色荧光薄板上可以看到四条明显的暗蓝色条带，抑菌试验结果表明，其中有三条条带具有抗菌活性。在紫外透射光源下，也能看到四条明显的亮蓝色荧光条带，但这四条亮蓝色荧光条带同反射光源254nm下观察到的暗蓝色条带不完全一致，Rf值有差异，这说明发酵液中的组分较多，不同的组分其最大紫外吸收的波长不同。抑菌试验结果表明，这四条紫外透射荧光条带都具有抗菌活性，且抗菌活性各不相同其中第一个组分(Rf＝0)和第四个组分(Rf＝0.66)对蜡样芽孢杆菌有较好的抗菌活性，对辣椒根腐病菌没有抑菌效果，第二个组分(Rf＝0.31)虽然对蜡样芽孢杆菌没有活性，但对辣椒根腐病菌有较好的抑制作用，第三个组分(Rf＝0.50)则对蜡样芽孢杆菌和辣椒根腐病菌都有较好的抗菌活性。这充分说明发酵液中含有多种(至少4种)活性组分，且各活性组分各不相同，因此具有较好的抑菌活性和较宽的抑菌谱。用茚三酮显色法也能较好的观察到该发酵液的各不同组分，同时也说明了该抗菌活性物质是蛋白类物质。
实验证明本实施方式制备的天然多组分抗菌蛋白发酵液在10～40℃环境中抑菌活性较稳定，在60℃的环境中抑菌活性减弱。天然多组分抗菌蛋白发酵液在pH5～pH9的范围内，均具有抑菌活性。对辣椒炭疽病菌、水稻恶苗病菌、辣椒根腐病菌、黄瓜枯萎病菌、烟草赤星病原菌、小麦根腐病菌、小麦赤霉病菌、西瓜炭疽病菌、水稻恶苗病菌、立枯丝核病菌、大葱紫斑病菌、水稻纹枯病菌、黄瓜枯萎病菌和甜瓜枯萎病菌14种植物病原菌及大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌均有抑制作用。
具体实施方式
二本实施方式天然多组分抗菌蛋白发酵液按以下步骤制备(一)将侧孢芽孢杆菌菌株BL-21接种到斜面活化培养基上，在30℃的条件下活化培养24h；(二)按50mL液体种子培养基接种一满环侧孢芽孢杆菌菌株BL-21的比例将经过活化的侧孢芽孢杆菌菌株BL-21接种到液体种子培养基，然后再在30℃、180r/min的条件下培养20～22h；(三)将液体种子培养液与发酵培养基混合，液体种子培养液占混合液总体积的3.2％～3.8％，混合液在30℃、180r/min的条件下培养60～108h，即得到天然多组分抗菌蛋白发酵液；其中斜面活化培养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基或葡萄糖蛋白胨固体培养基，液体种子培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基，发酵培养基按蛋白胨4～5g、牛肉膏2～3g、氯化钠4.5g和水1000mL的比例制成，发酵培养基的pH值为7.0。
将本实施方式制备的天然多组分抗菌蛋白发酵液分成三组进行抑菌试验，第一组抗菌蛋白液不做任何处理，第二组抗菌蛋白液热处理(加热至80～100℃)，第三组抗菌蛋白液酶处理(加入蛋白酶)。抑菌试验结果如图1和图2所示，图1辣椒根腐病菌和图2辣椒炭疽病菌培养基上都只有第一组抗菌蛋白液1出现抑菌环，第2组抗菌蛋白液2和第2组抗菌蛋白液3未出现抑菌环，证明本实施方式制备的抗菌蛋白液对辣椒根腐病菌和辣椒炭疽病菌都具有抑菌作用，而且说明本实施方式制备的抗菌液中抑菌物质为蛋白类。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一的不同点是斜面活化培养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基，牛肉膏蛋白胨固体培养基按蛋白胨5g、牛肉膏5g、氯化钠2g、琼脂15～18g和水1000mL的比例制成，斜面活化培养基的pH值为7.0。其它与实施方式一相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一的不同点是斜面活化培养基为葡萄糖蛋白胨固体培养基，葡萄糖蛋白胨固体培养基按蛋白胨5g、葡萄糖5g、K2HPO42g和水1000mL的比例制成，斜面活化培养基的pH值为7.0～7.2。其它与实施方式一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一的不同点是牛肉膏蛋白胨液体培养基按蛋白胨5g、牛肉膏5g、氯化钠2g和水1000mL的比例制成，牛肉膏蛋白胨液体培养基的pH值为7.0。其它与实施方式一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一的不同点是发酵培养基中还包括可溶性淀粉、FeSO4、MgSO4中的一种或几种，每1000mL发酵培养基中加可溶性淀粉0.001～1g、FeSO40.001～0.02g和/或MgSO40.001～0.04g，发酵培养基的pH值为7.0。其它与实施方式一相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一的不同点是发酵培养基中还包括可溶性淀粉，每1000mL发酵培养基中加可溶性淀粉0.001～1g，发酵培养基的pH值为7.0。其它与实施方式一相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一的不同点是发酵培养基中还包括FeSO4，每1000mL发酵培养基中加FeSO40.001～0.02g，发酵培养基的pH值为7.0。其它与实施方式一相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
一的不同点是发酵培养基中还包括MgSO4，每1000mL发酵培养基中加MgSO40.001～0.04g，发酵培养基的pH值为7.0。其它与实施方式一相同。
具体实施方式
十本实施方式与具体实施方式
一的不同点是发酵培养基中还包括可溶性淀粉和FeSO4，每1000mL发酵培养基中加可溶性淀粉0.001～1g和FeSO40.001～0.02g，发酵培养基的pH值为7.0。其它与实施方式一相同。
具体实施方式
十一本实施方式与具体实施方式
一的不同点是发酵培养基中还包括可溶性淀粉和MgSO4，每1000mL发酵培养基中加可溶性淀粉0.001～1g和MgSO40.001～0.04g，发酵培养基的pH值为7.0。其它与实施方式一相同。
具体实施方式
十二本实施方式与具体实施方式
一的不同点是发酵培养基中还包括FeSO4和MgSO4，每1000mL发酵培养基中加FeSO40.001～0.02g和MgSO40.001～0.04g，发酵培养基的pH值为7.0。其它与实施方式一相同。
具体实施方式
十三本实施方式与具体实施方式
一的不同点是发酵培养基中还包括可溶性淀粉、FeSO4和MgSO4，每1000mL发酵培养基中加可溶性淀粉0.001～1g、FeSO40.001～0.02g和MgSO40.001～0.04g，发酵培养基的pH值为7.0。其它与实施方式一相同。
具体实施方式
十四本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(三)中将液体种子培养液与发酵培养基混合，液体种子培养液占混合液总体积的3.3％～3.7％，混合液在30℃、180r/min的条件下培养72h。其它步骤与实施方式一相同。
权利要求
1.天然多组分抗菌蛋白发酵液的制备方法，其特征在于天然多组分抗菌蛋白发酵液按以下步骤制备(一)将侧孢芽孢杆菌菌株BL-21接种到斜面活化培养基上，在30±2℃的条件下活化培养24±0.5h；(二)按50mL液体种子培养基接种一满环侧孢芽孢杆菌菌株BL-21的比例将经过活化的侧孢芽孢杆菌菌株BL-21接种到液体种子培养基，然后再在30±2℃、180r/min的条件下培养18～24h；(三)将液体种子培养液与发酵培养基混合，液体种子培养液占混合液总体积的3％～4％，混合液在30±2℃、180r/min的条件下培养48～120h，即得到天然多组分抗菌蛋白发酵液；其中斜面活化培养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基或葡萄糖蛋白胨固体培养基，液体种子培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基，发酵培养基按蛋白胨3～6g、牛肉膏1～4g、氯化钠4～5g和水1000mL的比例制成，发酵培养基的pH值为7.0。
2.根据权利要求1所述的天然多组分抗菌蛋白发酵液的制备方法，其特征在于斜面活化培养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基，牛肉膏蛋白胨固体培养基按蛋白胨5g、牛肉膏5g、氯化钠2g、琼脂15～18g和水1000mL的比例制成，斜面活化培养基的pH值为7.0。
3.根据权利要求1所述的天然多组分抗菌蛋白发酵液的制备方法，其特征在于斜面活化培养基为葡萄糖蛋白胨固体培养基，葡萄糖蛋白胨固体培养基按蛋白胨5g、葡萄糖5g、K2HPO42g和水1000mL的比例制成，斜面活化培养基的pH值为7.0～7.2。
4.根据权利要求1所述的天然多组分抗菌蛋白发酵液的制备方法，其特征在于牛肉膏蛋白胨液体培养基按蛋白胨5g、牛肉膏5g、氯化钠2g和水1000mL的比例制成，牛肉膏蛋白胨液体培养基的pH值为7.0。
5.根据权利要求1所述的天然多组分抗菌蛋白发酵液的制备方法，其特征在于发酵培养基中还包括可溶性淀粉、FeSO4、MgSO4中的一种或几种，每1000mL发酵培养基中加可溶性淀粉0.001～1g、FeSO40.001～0.02g和/或MgSO40.001～0.04g，发酵培养基的pH值为7.0。
全文摘要
天然多组分抗菌蛋白发酵液的制备方法，它涉及一种蛋白液的制备方法。它解决了目前农用抗生素对土传病害防效显著的种类极少，长期使用导致病原菌产生抗药性和现有抗菌蛋白制品毒性大、抗菌谱窄的问题。天然多组分抗菌蛋白发酵液按以下步骤制备(一)将侧孢芽孢杆菌菌株BL－21接种到斜面活化培养基上培养；(二)将经过活化的侧孢芽孢杆菌菌株BL－21接种到液体种子培养基上培养；(三)将液体种子培养液与发酵培养基混合后培养，即得到天然多组分抗菌蛋白发酵液。本发明选用的菌株对环境和人体健康安全性高。本发明制备的天然多组分抗菌蛋白发酵液中含有多种抗菌蛋白，抑菌谱广，对多种植物病原真菌、部分革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌都有抑制作用。
文档编号A01P3/00GK1928109SQ200610010429
公开日2007年3月14日 申请日期2006年8月23日 优先权日2006年8月23日
发明者平文祥, 杜春梅, 葛菁萍, 王葳, 宋刚, 凌宏志 申请人:黑龙江大学