专利名称：：蜜橘成年树营养器官离体丛生芽培养方法
技术领域：
：本发明涉及一种植物生物技术，尤其涉及一种蜜橘成年树营养器官离体丛生芽培养方法。
背景技术：
：柑橘居世界百果生产之首，其果实营养丰富，色香味兼优，既可鲜食，又可加工果汁制品。南丰蜜橘是柑橘类宽皮橘中著名的优良品种。南丰蜜橘源出乳桔,又是乳桔中的精品，最突出特点在于皮薄金黄、酸甜适口、香气浓郁、汁多核少，誉为"橘中之王"驰名中外，它是我国特有的优良柑橘栽培品种。蜜橘成年树茎器官离体腋芽丛生培养对快速繁殖优质种苗和种质离体保存具有重要作用，它能较好地保持品种的遗传稳定性。我国利用组织培养进行柑橘快速繁殖的研究工作较广泛，上世纪七十年代王大元报道后至今，有不少文献报告了柑橘科属的多种植物离体不定芽或丛芽的产生，但选用的外植体几乎大都是未渡越童期的组织，很少见成年态营养体组织培养再生芽的报道。原因有两点一是成年结果柑橘树的枝茎外植体表面灭菌困难；二是成年态柑橘营养器官组织离体再分化难。而柑橘成年态茎段离体培养是柑橘优良品系工厂化育苗及其种质离体保存等的重要技术平台，必须首先建立有效的离体培养再生体系。
发明内容本发明的目的在于提供一种蜜橘成年树营养器官离体丛生芽培养方法，同时提供相应的培养基质。本发明方法包括以下步骤(1.1)选择健壮无病虫害蜜橘结过果实的成年优株，取当年抽生20天以内的新枝为外植体；(1.2)对外植体清洗消毒；(1.3)外植体接种在培养基上培养至腋芽生长点开始萌动，并在芽的基部四周出现黄绿色小凸点，继续在腋芽启动培养基上生长1215天，此时主腋芽伸长迅速；(1.4)培养3040天时，将长出的腋芽从外植体(母枝)上分割下来，接种到芽增殖培养基上诱导丛芽分化，培养3040天，平均每个培养物分化出丛生芽46个，芽长23cm;(1.5)分割继代，小芽成块继代培养，大芽切割成顶芽和茎节，接种到增殖培养基上继代培养，以后每3040天转代一次，繁殖系数46;建成丛芽无性繁殖体系，繁殖的2cm以上芽可进行嫁接育苗，小苗作离体种质保存或继代扩本发明方法所用的培养基如下(1)改良MS培养基，改良MS含以下改良的有机成分甘氨酸2.0mg/L，VBi1.02.0mg/L，VB61.02.Omg/L，烟酸O.51.Omg/L，肌醇100mg/L，叶酸O.l1.0mg/L，蔗糖4055g/L，其它成分不变。(2)腋芽启动培养基MS+6-BAO.10.6mg/L+Kt0.10.6mg/L+NAAO.010.1mg/L。(3)芽增殖培养基改良MS+6-BA0.20.5mg/L+KtO.040.4mg/L+ZtO.20,5mg/L+NAAO.010.05mg/L。本发明的培养条件如下(1)培养参数恒温24±2°C，相对湿度60%70%，光照强度为100016000让，日照时长1114小时/天。(2)技术参数外植体污染率低于5%10%;腋芽萌动诱导率75%87%;芽丛生增殖系数46;继代周期3040天。本发明方法中对外植体清洗消毒过程中对外植体清洗消毒过程中先用偏酸性牙膏溶液浸洗杀菌，再用碱性洗衣粉液浸洗杀菌；最后用75%的乙醇溶液和0.1%0.5Q/。HgCl2溶液消毒。本发明的培养方法及基质配方为蜜橘成年态茎节腋芽离体再生提供必需的环境条件。用本发明的方法进行南丰蜜橘的离体培养，可获得大量的再生芽。利用这样的柑橘离体再生芽既可作种质保存材料，又可切取lcm的茎端进行试管嫁接培育大批量优质种苗。这对南丰蜜橘以及柑橘类优良种质的离体繁殖或种质离体保存均具有广泛的实用价值。图1为本发明南丰蜜橘成年态茎节腋芽萌动诱导图2为本发明芽丛生增殖培养图。具体实施例方式以下结合实施例对本发明进行详细说明。实施例h(一)、选择健壮无病虫害南丰蜜橘成年优株果树，取当年抽生20d(天)以内的成年态茎抽生新枝，(二)、用自来水洗去灰尘，再用偏酸性商品牙膏适量溶于水，浸泡嫩枝条610min，再用软毛笔刷洗枝叶后，自来水漂洗干净；再用碱性洗衣粉液浸洗610min，自来水细流水中漂洗干净，修整老叶枝后用蒸馏水冲洗13次，滤纸吸干水滴后装入无菌容器中进行表面灭菌处理；转至超净工作台上，先以75%的乙醇溶液浸泡20305，无菌水冲洗24次，再O.1%0.59fflgCl2浸泡柑橘新枝610min，倾去药液后，用无菌水冲洗56次。然后在无菌条件下，将柑橘新枝切成长度为0.5lcm左右的小段(带茎节)，接种到准备好的培养基上培养。(三)、培养至腋芽生长点开始萌动，并在芽的基部四周出现黄绿色小凸点，继续在腋芽启动培养基上生长1215天，此时主腋芽伸长迅速，接种后培养3040天时，将长出的腋芽从外植体(母枝)上分割下来，又接种到芽增殖培养基上诱导丛芽分化，培养3040天，平均每个培养物分化出丛生芽46个，芽长23cm;(四)、分割继代，小芽成块继代培养，大芽切割成顶芽和茎节，接种到增殖培养基上继代培养，以后每3040天转代一次，繁殖系数46;建成丛芽无性繁殖体系，繁殖的2cm以上芽可进行嫁接育苗，小苗作离体种质保存或继代扩繁。(五)培养条件1.培养基配方对培养基中的大量元素、微量元素、有机成分、植物激素、糖类等各个组成成分进行多次正交设计及梯度试验基础上得到。本发明基本培养基为改良MS:大量元素、铁盐、微量元素三者与MS培养基中相同；有机成分(改良)用量为甘氨酸2.0/L，VBi1.02.0mg/L，VB61.02.0mg/L，烟酸0.51.0mg/L，肌醇100mg/L，叶酸0.11.0mg/L;蔗糖改为4055g/L。(1)腋芽启动培养基MS(或改良MS)+6-BA0.10.6mg/L(单位下同)+Kt0.10.6+NAA0.010.1;(2)芽增殖培养基改良MS+6-BA0.20.5+Kt0.040.4+Zt0.20.5+NAA0.010.1;以上培养基的pH值5.86.0、琼脂粉0.6%0.62。/。，并在118120。C高温高压下灭菌25min。2.培养环境提供培养环境恒温(24±2)°。，相对湿度60%70%，光照强度为1000翻lx，日照时长1114h(小时)/d(天)实施例2:选择健壮无病虫害蜜橘成年优株果树，取当年抽生20d(天)以内的成年态茎抽生新枝，对外植体清洗消毒时先以75%的乙醇溶液浸泡20303，无菌水冲洗24次，再O.1%浸泡柑橘新枝10min，在无菌条件下，将柑橘新枝切成长度为0.5lcm左右的小段(带茎节)，接种到准备好的培养基上培养。(1)腋芽启动培养基MS+6-BA0.1mg/L(单位下同)+Kt0.1+NAA0.01;(2)芽增殖培养基改良MS十6-BA0.2+Kt0.04+Zt0.2+NAA0.01，其它与实施例l相同。实施例3:(1)腋芽启动培养基改良MS+6-BA0.2mg/L(单位下同)+Kt0.6+NAA0.1;(2)芽增殖培养基改良MS+6-BA0.3+Kt0.4+Zt0.5+NAA0.1，其它与实施例1或2相同。实施例4:(1)腋芽启动培养基MS+6-BA0.3mg/L(单位下同)+Kt0.5+NAA0.08;(2)芽增殖培养基改良MS+6-BA0.5+Kt0.08+Zt0.3+NAA0.08，其它与实施例l相同。实施例5:(1)腋芽启动培养基MS+6-BA0.4mg/L(单位下同)+KtO,3+NAA0.06;(2)芽增殖培养基改良MS+6-BA0.4+Kt0.1+Zt0.4+NAA0.06,其它与实施例l相同。实施例6:(1)腋芽启动培养基改良MS+6-BA0.5mg/L(单位下同)+^0.1+NAA0.05;(2)芽增殖培养基改良MS+6-BA0.3+Kt0.2+ZtO.0.5+NAA0.05,其它与实施例l相同。实施例7:(1)腋芽启动培养基改良MS+6-BA0.5mg/L(单位下同)+Kt0.10.4+NAA0.06;(2)芽增殖培养基改良MS+6-BA0.2+Kt0.28+Zt0.3+NAA0.04，其它与实施例l相同。实施例8:(1)腋芽启动培养基MS+6-BA0.6mg/L(单位下同)+Kt0.1+NAA0.01;(2)芽增殖培养基改良MS+6-BA0.2+Kt0.3+Zt0.2+NAA0.03,其它与实施例l相同。实施例9:(1)腋芽启动培养基改良MS+6-BA(Umg/L(单位下同)+Kt0.2+NAA0.07;(2)芽增殖培养基改良MS+6-BA0.3+Kt0.36+Zt0.4+NAA0.07。实施例10:(1)腋芽启动培养基MS+6-BA0.2mg/L(单位下同)+Kt0.6+NAA0.1;(2)芽增殖培养基改良MS+6-BA0.4+Kt0.4+Zt0.3+NAA0.1,其它与实施例l相同。实施例ll:(1)腋芽启动培养基改良MS+6-BA0.3mg/L(单位下同)+Kt0.3+NAA0.09;(2)芽增殖培养基改良MS+6-BA0.4+Kt0.32+Zt0.4+NAA0.09,其它与实施例l相同。实验结果如表l、表2:表l:激素配方对柑橘芽启动和增殖的影响''<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>**:基本培养基为MS*:基本培养基为改良MS在表l筛选结果的基础上，继续深入研究了激素单因素、多因素效应，找出了几种激素对柑橘芽萌动和丛生芽发生的适宜配比范围。柑橘成年态再生芽的成功培养还在于初代以后的继代培养。通常实验切取外植体母枝萌发的初代离体腋芽继代培养时，在继代培养基MS基本培养加外源激素(优选的激素配合范围)上，培养物离体柑橘芽10天内几乎都发生不可逆的脱分化，产生一团无定性的、疏松的含水高的愈伤组织。通过改良MS有机成分用量的一系列研究，发现了改良的有机成分用量组合配与激素组合能有效的维持芽的再分化，获得了再生芽继代培养的成功。表2是研究改良有机成分的其中l例。表2改良MS配方对柑橘芽增殖的影响''<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*:1号培养基成分与MS相同**:116号培养基中使用的其它成分和激素均相同。权利要求1、一种蜜橘成年树营养器官离体丛生芽培养方法，其特征在于包括以下步骤(1.1)选择健壮无病虫害蜜橘结过果实的成年优株，取当年抽生20天以内的新枝为外植体；(1.2)对外植体清洗消毒；(1.3)外植体接种在培养基上培养至腋芽生长点开始萌动，并在芽的基部四周出现黄绿色小凸点，继续在腋芽启动培养基上生长12～15天，此时主腋芽伸长迅速；(1.4)培养30～40天时，将长出的腋芽从外植体(母枝)上分割下来，接种到芽增殖培养基上诱导丛芽分化，培养30～40天，平均每个培养物分化出丛生芽4～6个，芽长2～3cm；(5)分割继代，小芽成块继代培养，大芽切割成顶芽和茎节，接种到增殖培养基上继代培养，以后每30～40天转代一次，繁殖系数4～6；建成丛芽无性繁殖体系，繁殖的2cm以上芽可进行嫁接育苗，小苗作离体种质保存或继代扩繁。2.根据权利要求l所述的蜜橘成年树营养器官离体丛生芽培养方法，其特征在于所用的培养基如下(2.1)改良MS培养基，改良MS含以下改良的有机成分甘氨酸2.0mg/L，VBi1.02.0mg/L，VB61.02,Omg/L，烟酸O.51.Omg/L，肌醇100mg/L，叶酸O.11.0mg/L，蔗糖4055g/L,其它成分不变。(2.2)腋芽启动培养基MS或改良MS+6-BA0.10.6mg/L+KtO.10.6mg/L+NAAO.010.1mg/L。(2.3)芽增殖培养基改良MS+6-BA0.20.5mg/L十KtO.040,4mg/L+Zt0.20.5mg/L+NAAO,010.05mg/L。3.根据权利要求1和2所述的蜜橘成年树营养器官离体丛生芽培养方法，其特征在于培养条件如下(3.1)培养参数恒温24±2°。，相对湿度60%70%，光照强度为1000扁lx，日照时长1114小时/天。(3.2)技术参数外植体污染率低于5%10%;腋芽萌动诱导率75%87%;芽丛生增殖系数46;继代周期3040天。4、根据权利要求l所述的蜜橘成年树营养器官离体丛生芽培养方法，其特征在于对外植体清洗消毒过程中先用偏酸性牙膏溶液浸洗杀菌，再用碱性洗衣粉液浸洗杀菌；最后用75%的乙醇溶液和0.1%0.5。/。HgCl2溶液消毒。全文摘要本发明公开了一种包括以下步骤选择健壮无病虫害蜜橘结过果实的成年优株，取当年抽生20天以内的新枝为外植体；对外植体清洗消毒；外植体接种培养。腋芽启动培养基MS或改良MS+6-BA0.1～0.6mg/l+Kt0.1～0.6mg/l+NAA0.01～0.1mg/l。改良MS+6-BA0.2～0.5mg/l+Kt0.04～0.4mg/l+Zt0.2～0.5mg/l+NAA0.01～0.05mg/l。本发明的培养方法及基质配方为蜜橘成年态茎节腋芽离体再生提供必需的环境条件。用本发明的方法进行南丰蜜橘的离体培养，可获得大量的再生芽。利用这样的柑橘离体再生芽既可作种质保存，又可进行试管嫁接培育大批量优质种苗。文档编号A01H4/00GK101341854SQ20081010705公开日2009年1月14日申请日期2008年9月3日优先权日2008年9月3日发明者张杨军,徐志祥,涂艺声,蔡险峰申请人:江西师范大学