专利名称：调节植物器官大小和花器官内部非对称性的方法
技术领域：
本发明属于生物技术和植物学领域；更具体地，本发明涉及调节植物器官大小和花器官内部非対称性的方法。
背景技术：
与动物的器官发育不同，植物侧部器官(如叶和花等)都是在植物的胚后发育过程中产生的，它们都是由非决定性的茎顶端分生组织干细胞衍生而来。一般来说，整个植物的生长发育没有固定的終点，但是植物的个体器官都有特定的大小和形状。在植物各物种漫长的进化历程中，植物器官大小千变万化，例如香蕉树巨大的叶片和模式植物拟南芥微小叶片。虽然植物间的器官大小差异非常大，但种内植物器官最終大小差异比较小，这说明植物器官的大小受到严谨的遗传调控，由植物基因型和器官属性所決定。 目前现有的ー些野生型植物，特别是ー些农作物或经济作物，存在着器官过大或过小以及花型结构不理想的问题，导致花粉不易于传播或其它问题。以豆科植物为例，大豆花中的雌雄蕊被花瓣严密包裹，天然异交率低而且不稳定，目前仍未实现大面积、产业化规模的制种。在作物生产中，异花授粉主要通过风媒和虫媒两种途径，由于大豆与其他蝶形花科植物一祥，在自然进化过程中，已经形成虫媒花型。大豆在自然环境中的异花授粉必须由特定的授粉昆虫来实现。豆科植物独特的传粉情况主要与蝶形花的花瓣结构有关旗瓣大而平展，并且具有鲜艳颜色和能被昆虫识别的花蜜引导线；翼瓣位居花的两侧、易于授粉昆虫的降落；两枚龙骨瓣把雄蕊和柱头紧密包裹，在授粉昆虫访问的情况下，花粉可暴露和黏附在昆虫的体毛上；当授粉昆虫访问不同花朵的时候，便可以完成异花授粉的过程。因此，进行大豆杂种优势利用分子设计育种将主要从改造花型着手。本发明人先期的研究中，也对大豆花粉的传播与昆虫的关系做了一些初步的探讨。已有的研究表明，放养切叶蜂有可能解决大豆的杂交问题，但目前切叶蜂的繁衍困难，杂交大豆制种成本比较高。发掘和利用田间自然状态下土著昆虫进行传粉，则遇到规模化育种时如何应对大田生产条件下环境生态进行控制的难题。另ー个可行的解决途径则是利用人工驯养的蜜蜂进行传粉。但是，从目前的研究看，存在着栽培大豆花型与蜜蜂不匹配的情况1，单个大豆花与蜜蜂体形相比偏小；2，与采集大豆花粉的切叶蜂相比，蜜蜂无高效打开大豆花龙骨瓣采集花粉的行为。因此，可以充分利用大豆具有虫媒花的特点，在豆科作物中克隆决定大豆花型的关键基因。在此基础上，利用转基因生物技术，改造大豆花型，使之与驯化的蜜蜂相配合。其中的技术关键是创造龙骨瓣形态发生变化的花型，使雌雄蕊暴露和易于接触访花的昆虫，提高昆虫的传粉效率，最終解决大豆杂种优势利用中杂交制种困难的问题。因此，本领域需要对调控植物器官大小或花型的基因进行深入开发和研究，以使得借助基因工程技术来改变植物器官大小或花型成为可能
发明内容
本发明的目的在于提供调节豆科植物器官大小和花器官内部非対称性的方法。在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，该多肽选自下组(a) SEQ ID NO 6所示氨基酸序列的多肽(ΒΙ0蛋白);(c)将SEQ ID NO 6所示氨基酸序列经过ー个或多个(如1_50个，较佳地1_20个，更佳地1-10个，更佳地1-8个，更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)的多肽相同功能的由(a)衍生的多肽。在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组(a)编码所述多肽的多核苷酸；或(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。 在另ー优选例中，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID N0:1或2(编码的序列相应于SEQ ID NO 6或其衍生多肽)。在本发明的另一方面，提供所述的多肽的截短体(突变体)，该截短体是如SEQ ID NO 6中第1-328位所示氨基酸序列的多肽。在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，它编码所述的多肽截短体。在本发明的另一方面，提供ー种载体，它含有所述的多核苷酸或多核苷酸截短体。在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或其基因组中整合有所述的多核苷酸或多核苷酸截短体。在本发明的另一方面，提供所述的多肽或多肽截短体、或编码所述多肽或多肽截短体的多核苷酸的用途，用干调节植物株型大小；调节植物器官大小；或调节植物器官的内部非対称性。在另ー优选例中，所述的器官包括(但不限干)叶子(叶片)，花器官(如花瓣)，种子。在另ー优选例中，所述的调节植物器官的内部非対称性是调节植物花器官(如花瓣)的内部非対称性。在另ー优选例中，所述的多肽编码所述多肽的多核苷酸用于促进植物株型变小(过量表达BIO基因出现此表型);促进植物器官变小(过量表达BIO基因出现此表型)；较佳地，所述的器官变小包括但不限于花器官变小、叶片变小、果荚变小(含变短)。在另ー优选例中，所述的多肽截短体或编码所述多肽截短体的多核苷酸用干促进植物器官(如花器官)的内部対称性。在另ー优选例中，所述的调节植物花器官(如花瓣)的内部非対称性包括过量表达突变的BIO基因(BlOm，如SEQID NO :6中第1-328位所示氨基酸序列的多肽的编码基因)出现花器官内部变对称的表型，而过量表达野生型BIO基因(如SEQ ID NO :6所示氨基酸序列的多肽的编码基因)则促进花器官内部非対称性。在本发明的另一方面，提供一种所述的多肽或其编码基因的调节剂，其是激动剂或抑制剂。在另ー优选例中，所述的调节剂是抑制剂，其是特异性干扰所述的多肽的编码基因(在mRNA水平上)表达的干扰分子(包括但不限于siRNA，miRNA，shRNA,反义核苷酸)；或是特异性抑制所述的多肽表达的抗体或配体。在本发明的另一方面，提供一种调节植物大小、调节植物器官大小或调节植物花器官内部非対称性的方法，其包括调节植物中所述的多肽或其编码基因的表达或活性。在另ー优选例中，所述方法包括将编码BIO蛋白的多核苷酸转入植物中；或将干扰BIO蛋白的编码基因表达的干扰分子转入植物中；或将编码BIO蛋白的截短体的多核苷酸转入植物中；或在植物基因组中，将所述的多肽的编码基因进行突变，从而降低植物中所述的多 肽的表达。在另ー优选例中，所述的突变包括插入或缺失突变(如采用T-DNA插入法进行缺失突变)；或快中子诱变。在另ー优选例中，所述的快中子诱变方法包括利用快中子诱变获得植物品系，从中鉴定获得所述的多肽的编码基因发生缺失或突变的植株。鉴定方法较佳地为获得经由快中子突变处理的植物植株，提取基因组DNA，利用PCR技术来扩增(例如选自SEQ ID NO:16-20的引物扩增)所述的多肽的编码基因，若没有获得扩增产物或扩增产物突变，则该植物中所述的多肽的编码基因发生缺失或突变。在另ー优选例中，所述方法包括(I)提供携帯表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有编码BIO蛋白或的多核苷酸、编码BIO蛋白的截短体的多核苷酸或干扰BIO蛋白的编码基因表达的干扰分子；(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(I)中的农杆菌接触，从而使编码BIO蛋白的多核苷酸、编码BIO蛋白或的截短体的多核苷酸或干扰BIO蛋白的编码基因表达的干扰分子转入植物细胞或组织或器官。 在另ー优选例中，所述方法还包括(3)选择出转入了编码BIO蛋白或的多核苷酸、编码BIO蛋白或的截短体的多核苷酸或干扰所述的BIO蛋白的编码基因表达的干扰分子的植物细胞或组织或器官；和(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植物。在本发明的另一方面，提供一种制备植物的方法，将转入了编码BIO蛋白的多核苷酸、编码BIO蛋白的截短体的多核苷酸或干扰所述的BIO蛋白的编码基因表达的干扰分子的植物与非转基因植物杂交，获得杂交后代，该后代在植物株型大小、植物器官大小、植物花器官内部非対称性方面呈现与非转基因植物不同的表型。在本发明的另一方面，提供ー种植物，其由前述任ー制备植物的方法制备获得。在本发明的另一方面，提供一种所述的多肽或其截短体的制备方法，该方法包含(a)在适合表达的条件下，培养所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出所述的多肽或其截短体。在本发明的另一方面，提供一种所述的多肽或其编码基因的用途，用作鉴定植物的株型或器官大小，以及鉴定植物器官(如花器官)内部非対称性的分子标记物。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图I :bio和ele2突变体的表型，分别以它们的野生型作为对照。A,成熟的野生型(Gifu)和bio植株；B, Gifu和bio叶片;C, Gifu和bio花瓣；D,Gifu和bio种子；E,野生型(wt)和ele2花瓣；F,野生型和ele2植株；G,野生型和ele2叶片。图2 BI0/ELE2比较基因组学定位和共线性分析。A :百脉根bio精细定位和物理图谱；Β :ΒΙ0在蒺藜苜蓿中对应的共线性区域；黑框表示在蒺藜苜蓿和百脉根共线性区域共有的11个同源基因；白框表示共线性区域没有同源性的基因；虚线表示对应的关系；c :蒺藜苜蓿中共线性区域物理图谱；D :豌豆ele2基 因比较基因组学定位。图3 ΒΙ0基因的结构和突变位点。BIO基因由4个外显子和3个内含子組成。红色和紫色框框分别表示BIO蛋白N端和C端的保守结构域；黑色箭头表示bio突变体中Gypsy反转座子插入。图4、35S =BIOm-GFP在百脉根中的转基因表型。图5、35S =BIO-GFP在夏堇中的转基因表型。
具体实施例方式本发明人经过长期的研究，首次定位和分离到ー类新的植物基因，其能够调控植物的株型大小、器官大小以及花器官的内部非対称性。基于该基因或其调控分子(如干扰分子)，可制备株型、器官大小改变的转基因植物或花器官内部非対称性改变的转基因植物。如本文所用，所述的“植物(或作物)”包括任何种类的植物，只要该植物适合进行基因的转化操作(转基因操作)，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。例如但不限于豆科的豌豆、大豆、百脉根、花生、蚕豆、菜豆；十字花科芸薹属的大白菜、小白菜；十字花科鼠耳芥属植物；禾本科的水稻、大麦、小麦；此外还包括烟草、瓜果、蔬菜、油菜等等。更具体地，所述的植物包括(但不限干)豌豆、大豆、百脉根、小麦、大麦、黒麦、水稻、玉米、高梁、甜菜、苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罌粟、齐墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫芦、黄瓜、西瓜、棉花、亚麻、大麻、黄麻、柑桔、柠檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、芦笋、洋白菜、大白菜、小白菜、胡萝卜、洋葱、土豆、西红柿、青椒等。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，“分离的BIO蛋白”或“分离的BIO多肽”是指BIO蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化BIO蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主帯。
如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构
成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上
由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选的是重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括BIO蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的BIO蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有ー个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优 选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另ー个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚こニ醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。在本发明中，术语“ΒΙ0蛋白”指具有调节植物株型、器官大小或花器官内部非対称性的功能的SEQ ID NO :6序列的多肽。该术语还包括具有调节植物株型、器官大小或花器官内部非対称性的、SEQ ID NO :6序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1_8个或1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失ー个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失ー个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括BIO蛋白的活性片段和活性衍生物。多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与BIO蛋白的DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗BIO蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含BIO蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了 BIO蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有BIO蛋白序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸,更佳地至少约80个连续氨基酸,最佳地至少约100个连续氨基酸。本发明还提供BIO蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然BIO蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技木。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如こ酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。在本发明中，“BIO蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO 6的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表I进行氨基酸替换而产生。表I
氨基酸残基代表性的取代优选的取代
Ala(A)Val ；Leu ；IleVal
Arg(R)Lys ；Gln ；AsnLys
Asn(N)Gln ；His ;しys ；ArgGln
Asp (D)GluGlu
Cys(C)SerSer
Gln (Q)AsnAsn
Glu(E)AspAsp
Gly(G)Pro ；AlaAla
His (H)Asn ；Gln ;しys ；ArgArg
He (I)Leu ；Val ；Met ；Ala ；PheLeu
Leu (L)lie ；Val ；Met ；Ala ；Phelie
Lys(K)Arg ；Gln ；AsnArg
Met (M)Leu ；Phe ；IleLeu
Phe(F)Leu ；Val ；Ile ；Ala ；TyrLeu
Pro (P)AlaAla
Ser(S)ThrThr
Thr(T)SerSerTrp (W)Tyr ；PheTyr
Tyr (Y)Trp ；Phe ；Thr ；SerPhe
Val (V)lie ；Leu ；Met ；Phe ；AlaLeu本发明还提供了编码本发明BIO蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO :1-2任一所示的编码区序列相同 或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO :6的蛋白质或其衍生蛋白，但与SEQ ID NO :1-2任一所示的编码区序列有差别的核酸序列。编码SEQ ID NO 6的成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是ー个多核苷酸的替换形式，它可能是ー个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子強度和较高温度下的杂交和洗脱，如O. 2 X SSC，O. 1% SDS，60°C;或(2)杂交时加有变性剂，如50% (v/v)甲酰胺，O. 1%小牛血清/O. 1% Ficoll，42°C等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在80%以上，较好至少90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO :6所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码BIO蛋白的多聚核苷酸。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用BIO蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测BIO蛋白的转录产物。本发明还涉及BIO蛋白的截短体，它们例如选自如SEQ ID NO :6中第1-328位所示氨基酸序列的多肽。它们对于调节植物株型大小；调节植物器官大小；或调节植物花器官(如花瓣)内部非対称性是有用的。所述的截短体的编码核酸也包括在本发明中。本发明的BIO蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短吋。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或BIO蛋白编 码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的BIO蛋白。一般来说有以下步骤(I).用本发明的编码BIO蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。本发明中，BIO蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的ー个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含BIO蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的ニ氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另ー种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得性状发生改变的植物。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这 些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、滲透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结
ム
ロ ο重组的BIO蛋白有多方面的用途。例如用于筛选促进或对抗BIO蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组BIO蛋白筛选多肽库可用于寻找有价值的能抑制或刺激BIO蛋白功能的多肽分子。本发明提供了所述的BIO蛋白或其编码基因的用途，用于调控植物的株型或器官大小或花器官的内部非対称性。在ー种方式下，正义表达BIO蛋白可用于促进植物株型变小、促进植物花器官变小、调节植物花器官(如花瓣)的内部非対称性。在另ー种方式下，反义转入BIO基因，或转入BIO基因的干扰分子(包括但不限于siRNA，miRNA，shRNA,反义核苷酸)以及截短的BIO基因后可促进植物株型变大、促进植物花器官变大、调节植物花器官(如花瓣)的内部非対称性。因此，可基于BIO蛋白对于植物的上述影响作用来改变植物，从而达到根据实际生产需要改良植物品质的目的。较佳地，所述的植物是豆科植物。本发明还涉及BIO蛋白或其编码基因的激动剂或抑制剂(如反义的BIO基因，或siRNA,miRNA, shRNA,反义核苷酸)及其用途。由于BIO的激动剂或抑制剂可调节BIO的表达和/或调节BIO的活性等，因此，所述的BIO的激动剂或抑制剂也可通过对BIO的影响来调节植物的表型(包括株型、器官大小、花器官的内部非対称性)，从而达到改良植物的目的。任何可调节BIO蛋白的活性、调节BIO蛋白的稳定性、促进或抑制BIO基因的表达、延长或減少BIO蛋白有效作用时间、或促进或降低BIO基因的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于调节植物的表型(包括株型、器官大小、花器官内部非対称性)的有效物质。本发明还涉及ー种改良植物的方法，该方法包括调节所述植物中BIO蛋白的表达。一方面，本发明提供了一种促进植物株型变小、促进植物花器官变小、促进植物器官(如花器官；进ー步如花瓣)的対称的方法，所述的方法包括使所述植物过量表达BIO蛋白。另ー方面，本发明还提供了一种促进植物株型变大、促进植物花器官变大、促进植物花器官(如花瓣)的不对称的方法，所述的方法包括降低所述植物中BIO蛋白的表达(包括使BIO蛋白不表达或低表达)。在得知了所述的BIO蛋白的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的BIO蛋白的表达。比如可通过一定的途径将携帯BIO编码基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的BIO蛋白。此外，也可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低BIO蛋白的表达或使之缺失表达，比如将携带反义BIO基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达BIO蛋白。作为本发明的一种实施方式，将BIO蛋白的编码基因通过常规的方法克隆到适当 的载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达所述BIO蛋白的植物细胞中，使所述的植物细胞表达BIO蛋白。可通过将所述植物细胞再生成植物，获得过量表达BIO蛋白的植物。优选的，一种促进植物株型变小、促进植物花器官变小、调节植物器官(如花瓣)的内部非対称性的方法包括(I)提供携帯表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有与表达载体正向连接的BIO的编码基因；(2)将植物细胞、组织或器官与步骤(I)中的农杆菌接触，从而使BIO的编码基因转入植物细胞；(3)选择出转入了 BIO的编码基因的植物细胞、组织、器官；和(4)将步骤(3)中的植物细胞、组织、器官再生并选出转基因植物，即为所需的转基因植物。优选的，一种促进植物株型变大、促进植物花器官变大、调节植物花器官(如花瓣)的内部非対称性的方法包括(Si)提供携帯表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有BIO基因的干扰分子(包括但不限于siRNA，miRNA，shRNA,反义核苷酸)，或与表达载体反向连接的BIO的编码基因，或截短的BIO蛋白的编码基因；(s2)将植物细胞、组织或器官与步骤(Si)中的农杆菌接触，从而使所述BIO基因的干扰分子(包括但不限于siRNA，miRNA, shRNA，反义核苷酸)或反向的BIO的编码基因转入植物细胞；(s3)选择出转入了 BIO基因的干扰分子(包括但不限于siRNA，miRNA, shRNA,反义核苷酸)或反向的BIO的编码基因或截短的BIO蛋白的编码基因的植物细胞、组织、器官；和(s4)将步骤(S3)中的植物细胞、组织、器官再生并选出转基因植物，即为所需的转基因植物。如本文所用，所述的正向连接是指ΒΙ0的编码基因与表达载体的连接是正义的连接，即编码基因按照5’ 一3’的方向连接于载体上。通常，BIO的编码基因位于表达载体中启动子的下游，也即启动子的3’端下游连接该编码基因的5’端。所述的编码基因是可操作性地连接到表达载体上的。所述的“操作性连接”或“可操作地连于”指这样ー种状況，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。如本文所用，所述的反向连接是指ΒΙ0的编码基因与表达载体的连接是反义的连接，即编码基因按照3’ 一 5’的方向连接连接于载体上。通常，BIO的编码基因位于表达载体中启动子的下游，也即启动子的3’端下游连接该编码基因的3’端。可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压カ条件等来实施所述的方法。其它增加BIO表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动从而增强BIO的表达。或者通过增强子来增强该BIO基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于35s启动子、水稻、玉米的Ubi启动子等。BIO蛋白的编码基因的另ー个应用作为鉴定植物株型大小、器官大小或花器官内部非対称性的分子标记。可通过分析待测植物(如植物的种子或幼苗)中BIO蛋白的表达 情况，来判断其株型大小、器官大小或花器官内部非対称性。例如，鉴定到植物中BIO蛋白的表达低或无，则该植株的器官可呈现内部对称性的表型；而若鉴定到BIO蛋白的正常表达或较高表达，则该植株的器官可呈现内部非対称性的表型。本发明的主要优点在干本发明人利用豆科比较基因组和功能基因组的技术手段，定位和克隆控制豆科器官大小发育的基因，并探讨基因控制器官大小的分子机制，为大豆高产和花型的分子设计提供理论依据。进而利用转基因等分子生物学技术获得花瓣变大，适合驯化蜜蜂传粉的形态结构，创造适用于大豆杂交优势利用的育种材料。下面结合具体实施例，进ー步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人,分子克隆实验室指南(New York Cold Spring Harbor LaboratoryPress)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按
重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。I.材料和方法I.实验材料I. I.植物材料豌豆(P. sativum)材料野生型豌豆生态型Terese、JI2822、JI31和JI992 (获自英国 John Innes centre);突变体 elel_l、elel_2、ele2、Iat (JIlO)(获自英国 John Innescentre)和MD404及(获自澳大利亚Tasmania大学)。豌豆种子在水中浸泡24小时后，播种于土中I厘米深处，种植于植物生理生态研究所人工气候室，16小时光照/8小时黑暗，15-20°C 生长。百脉根L. japonicus :生态型 Gifu B-129 (Gifu), Miyakojima 20 (MG20)(获自日本KAZUSA研究所及突变体bio (获自上海植物生理生态研究所)，种植于植物生理生态研究所人工气候室，16小时光照/8小时黑暗，18-22°C生长。1.2.植物材料遗传杂交豌豆突变体遗传分析(l)elel-l作为父本本与ele2X JWgZF1植株杂交，用于elel-1及ele2等位分析或构建elel_lele2双突变体。(2) ele2作为父本本与Terese回交，纯化背景。elel_l作为父本与JI2822回交，
纯化背景。百脉根突变体遗传分析
bio作为父本与Gifu回交,用于bio遗传分析和纯化背景。bio作为父本与MG20杂交,用于构建bio F2定位群体。1.3.菌株和克隆载体大肠杆菌菌株DH5 a、JM109 (购自 Invitrogen)；农杆菌菌株GV3101(购自 Invitrogen)、ΕΗΑ105 (购自 Invitrogen)；酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株AH109(购自 Clontech)、Y187 (购自Clontechノ ；基因克隆载体pBS_T (购自天根公司)、pGEM-T (购自天根公司);转基因构建载体pCAMBIA1302 (购自CAMBIA公司);酵母双杂交载体pGBKT7_53(购自Clontech)、pGBKT7_lam(购自 Clontech)、PGBKT7 (购自 Clontech)和 pGADT7 (购自 Clontech)。1.4.拟南芥幼苗的种植拟南芥Columbia(获自上海植物生理生态研究所)种子用70% (v/v)こ醇消毒30sec,7% (v/v)次氯酸钠浸泡lmin，高压灭菌水冲洗3_5次，均匀播种于MS培养基上，培养皿用封ロ膜封ロ之后置4°C冰低温处理48hr使种子萌发整齐，然后20 22°C、16hr光照培养箱培养9 13日，待幼苗长出2 4片真叶后移栽于栽培土(蛭石东北泥炭珍珠岩=3 I 0.5)中，于人工气候室温度20 22°C、16hr光照中生长。2.实验方法2. I.重组质粒的构建转基因质粒首先利用引物SL6160/SL5808 (BIO)，SL6160/SL5818 (BIOm)和 KOD Plus (—种高保真DNA聚合酶，购自Toyobo)扩增百脉根cDNA，PCR产物回收加A连接到pBS_T载体，转化大肠杆菌鉴定阳性克隆，抽提质粒DNA，经过测序验证后，Ncol/Bglll (ΒΙ0, B10m)双酶切质粒，回收酶切产物后与经过Ncol/Bglll双酶切的pCAMBIA1302连接，转化大肠杆菌鉴定阳性克隆，抽提质粒DNA备用。这些重组质粒分别称为BI0-GFP(也称为35S =BIO-GFP ；ΒΙ0插入 pCAMBIA1302 中)和 BIOm-GFP (也称为 35S BI0m-GFP ；BI0m 插入 pCAMBIA1302 中)。引物序列如下SL6160 ccatggctATGCCGAGGCCAGGGCCAAGG(SEQ ID NO 3)SL5808 agatctCAAACCTGGCCTACCAATAAAACGA(SEQ ID NO 4)SL5818 agatetGCTGCCCTCCTGAGAAAGTCCTAA(SEQ ID NO :5)2. 2.植物遗传转化及筛选
拟南芥遗传转化将野生型拟南芥种子消毒后置于MS培养基萌发，10 15天后移栽到土壌中，一周浇灌一次O. 5XPNS营养液。植株普遍抽薹后打顶，待侧花序长出而且花苞最多时，进行遗传转化。首先将构建好的质粒(35S =BIO-GFP和35S =BIOm-GFP)用热激转化法转入GV3101农杆菌菌株中，28°C培养2天。挑取单菌落接种到5ml液体LB培养基中，培养基中加入相应抗生素，28°C振荡培养过夜。I : 100扩大培养，待00600 = 1.0 I. 3吋，5000rpm离心收集菌体。用MS重悬菌体至0D600 = O. 8。重悬的菌液喷至拟南芥植株上，喷到滴水为止。喷完后，用保鲜膜包好放置黑暗处过夜，24hr后去掉保鲜膜。待果荚成熟后收Ttl代种子。夏堇遗传转化夏堇种子经过灭菌在1/2MS培养基上萌发并生长为无菌苗。然后将构建好的质粒(35S =BIO-GFP和35S =BIOm-GFP)用热激转化法转入LBA4404农杆菌菌株中，28°C培养2天。挑取单菌落接种到5ml液体LB培养基中，28°C振荡培养过夜。待0D600=1.0 1.3时，6000印111离心收集菌体。以叶片为外植体，共培养4天后，移到选择培养基上生长10 15天，然后将外植体转到诱芽培养基(Hyg 15mg/L)上继续诱导芽的生长；随后将抗性芽的外植体转到1/2MS培养基(Hyg 15mg/L)上，以后每隔2周转I次培养基，当 芽长到Icm以上时将抗性芽切下放入1/2MS培养基(Hyg 15m g/L+Cef 500mg/L)上生根，根长约4cm时移栽。百脉根遗传转化提前10天用液氮处理种子I分钟，70%醇浸泡I分钟，7% NaClO浸泡15分钟，无菌水冲洗4次，最后接种到MSO固体培养基上，暗培养6天，光下4天。然后将构建好的质粒(35S :BI0-GFP和35S =BIOm-GFP)用热激转化法转入EHA105农杆菌菌株中，28°C培养2天。挑取单菌落接种到5ml液体LB培养基中，28°C振荡培养过夜。待0D600=I. O I. 3时，6000rpm离心收集菌体。同时,于转化前一天切取无菌苗的子叶和胚作轴为外植体，置于Cim培养基上预培养。用BStl重悬菌体至0D600 = O. 7。用此重悬的菌液浸泡外植体15分钟，捞出外植体，用滤纸吸干，置于原预培养培养基上，暗中共培养2天后将外植体用无菌水冲洗3次,用滤纸吸干,置于Cim+Cef500mg/L+Hyg250mg/L培养基,筛选抗性愈伤。然后于 Cim+Cef500mg/L+Hyg250mg/L 中培养40-50 天，在 Sim+Cef500mg/L+Hyg250mg/L培养20-25天。直到愈伤在Sim+Cef500mg/L+Hyg25mg/L中分化出O. 5-lcm高的芽时，移入 0utg3+Cef250mg/L+Hyg5mg/L 至芽长 3_4cm。最后在 B5+Hyg25mg/L 生根，约长至 5cm 左右移栽。2. 3. PNS营养液配方成分(各成分単独配制，使用时依量混合)(I) 1Μ(200Χ)ΚΝ03(101·1 克)5ml(2) 1M(500X)MgSO4 (120. 37 克)2ml(3) IM (500X)Ca (NO3) 2 (400. 148 克)2ml(4) 20m M (400X) EDTA-Fe (7. 44/5. 6 克)2. 5ml(5)微量元素(1000X)Iml(6) (400X)Κ2ΗΡ04/ΚΗ2Ρ04 (136. 1/2 28 . 2 克) 2. 5mlddH20985ml调PH = 5. 5。其中，微量元素(1000X)(mg/L)
H3BO46200mg/L
MnS04.4H2022300mg/L
ZnS04.7H2010600mg/L
Na2MoO4^H2O250mg/L
CuS04.5H2025mg/L CoC12.6H2025mg/L2. 4.数据分析平台与软件序列BLAST分析NCBI在线分析平台。序列Alignment 分析BioEdit 7. O. 5 软件。序列预测与分析GenScan平台，Softberry FGENESH 平台，Vector NTI 8.0。引物设计PrimerPremier 5. O 软件。2.5.百脉根和豌豆总RNA提取收集目标材料，液氮中研磨破碎(之后所有操作在冰上或4°C进行)。约将破碎的细胞移入 I. 5ml 离心管，加入 500μ I RNA 提取液(50mM Tris, 150m MliCl,5mM EDTA和5% SDS)的，迅速混匀，再加入500 μ I的等体积(酸性)酚/氯仿，抽提5至10分钟，离心13，OOOgX5分钟，取上清重复抽提数次。取上清，加入等体积的氯仿抽提一次，离心13，OOOgX 5分钟。取上清，加入1/3体积8Μ LiCl，4°C沉淀过夜。次日离心13，OOOgX 10分钟，弃上清，加入75% (v/v)こ醇/30% O. 5MNaCl O. 5毫升洗涤沉淀数分钟，离心，重复洗涤沉淀数次。用75%こ醇再洗涤2次沉淀，用枪头吸尽残液，真空干燥2分钟。加入20-50 μ I的DEPC处理过的水溶解RNA。用分光光度法和电泳检测RNA完整性及浓度。马上进行RNA反转录或分装放_80°C保存备用。2. 6.反转录 PCR(RT-PCR)取约10 μ g RNA,加DEPC水补至11 μ 1，65°C变性5分钟，冰浴5分钟。然后依次加入 4μ1 5 X 反转录缓冲液、I μ I Rnasin (40U/μ 1),2 μ I dNTP (每种 IOmM)、I μ I 引物Olig(T)17(IOOyM)和Ιμ AMV反转录酶(10U/μ I)，反应终体积为20 μ I。混匀，42 °C反应I小时，70°C 5分钟终止反应，-20°C保存。PCR反应时取O. I μ 1、1 μ I和5 μ I为模板。通过电泳检测PCR結果。2. 7. 3，-RACE(Rapid Amplification of cDNA 3，Ends)取约5yg RNA，加DEPC水补至11μ 1，65°C变性5分钟，冰浴5分钟。然后依次加入 4μ1 5 X 反转录缓冲液、I μ I Rnasin (40U/μ 1),2 μ I dNTP (每种 IOmM)、I μ I 引物Β26 (GACTCGAGTCGACATCGA (T) 17 (SEQ ID NO :7)) (100 μ Μ)和 I μ I AMV 反转录酶(10U/μ I)，反应终体积为20 μ I。混匀，42°C反应I小时，700C 5分钟终止反应，_20°C保存。PCR反应时取0. 1μ 1、1μ I和5μ I为模板，以特异引物(AAGAAACGGCTTTAGGCACTC(SEQ ID NO 8)和 CAGGAGTCACAGGGCAGGGAA(SEQ ID NO :9))和B25 (TCGATGTCGACTCGAGTC (SEQ ID NO : 10))进行两轮巢式PCR。电泳检测PCR结果，回收产物连接转化大肠杆菌GM109鉴定阳性克隆测序。
2.8.5’ -RACE(Rapid Amplification of cDNA 5’ Ends)5’ -RACE 采用 Takala 公司 5’ -Full RACE kit。第一链cDNA的合成取约5yg RNA，加入 1·5μ1 IOX 反转录缓冲液、O. 5 μ I Rnasin (40U/μ I)、2 μ IdNTP (每种 IOmM)、1 μ I 引物 5，end-phosphorylatedRT-Primer* (GCTCCCTTTCTCCCTGTATTG(SEQ ID NO :11)) (200pmol/y I)和1μ I AMV反转录酶(5U/μ I)，反应终体积为 15 μ I。混匀，30°C反应10分钟，50°C反应60分钟，80°C 2分钟终止反应，_20°C保存。RNA的酶解第一链cDNA合成产物15 μ 1，依次加入15 μ I 5x RNA降解缓冲液，45 μ IddH2O,I μ I RNase H 30°C反应60分钟，加入2倍无水こ醇沉淀cDNA。 单链cDNA的自我连接在沉淀cDNA管中，加入8μ I 5Χ RNA(ssDNA)连接缓冲液，20 μ I 40 %PEG#60001 μ I T4RNA 连接酶，15°C过夜连接。PCR 反应第一轮PCR反应体系连接产物Ιμ IOx LA PCR Buffer II (Mg2+plus)5 μ IdNTP Mixture (2. 5mM)8 μ I1st PCR SI Primer(20pmol/y I)0. 5 μ I (GAGGTTGAGGGTGGTGGTGA(SEQ ID NO :12))1st PCR Al Primer(20pmol/μ I)0. 5 μ I (CACCGGATAAGGCACAGTCA(SEQ ID NO :13))TaKaRa LA Taq (5units/μ I) 0. 5 μ IddH20 补充至50 μ IPCR 反应94で 3min, 94°C，30sec, 55°C，30sec, 72°C，30sec 35 个循环，最后 72で延イ申5min第二轮PCR反应体系第一轮PCR 产物I μ IIOx LA PCR Buffer II(Mg2+plus)5 μ IdNTP Mixture (2. 5mM)8 μ I1st PCR S2 Primer(20pmol/μ I)0. 5 μ I (TGGCGGTGTATGGCGGAGGA(SEQ ID NO :14))1st PCR A2 Primer(20pmol/μ I)0. 5 μ I(GCAGTTTGGGCTTCTTCTTG(SEQ ID NO :15))TaKaRa LA Taq (5units/μ I)0. 5 μ IddH20 补充至50 μ IPCR 反应94°C 3min，94°C，30sec，55°C，30sec，72°C，30sec 35 个循环，最后 72°C延イ申5min。电泳检测PCR結果，回收产物连接转化大肠杆菌JM109，鉴定阳性克隆测序。
II.实施例实施例I. bio和ele2突变体的分离和表型分析本发明人以百脉根生态型Gifu B-129为材料进行大規模EMS(甲基磺酸こ酷)诱变，在50000个M2家系中，筛选到一个侧生器官变大的突变体bio ;突变体花瓣的内部非対称性同时发生变化，所有的花瓣都呈现两侧对称，腹部的单个花瓣可形成龙骨结构，而在野生型中两个腹部花瓣融合形成龙骨结构，突变体与野生型植株及器官的形态对比见图1A-D。本发明人还在豌豆Terese背景下进行大規模快中子诱变筛选，一共3500fM2家系，种植于上海青浦农场大棚，在豌豆中也筛选到ー类与bio表型相似的突变体PDL023(ele2)，该突变体与野生型植株及器官的对比见图1E-G。实施例2. ele2和bio突变体遗传分析为了检测bio和ele2是否为单基因突变所致，bio和ele2分别与其亲本Gifu及Terese回交，分析回交F2群体中野生型与突变体分离比。在百脉根中，bio与Gifu回交后 F1植株表型正常，■F1植株花与野生型相比，侧部花瓣内部非対称性发生改变，变得较为对称。在140株F2分离群体中，34株个体呈现突变体表型，65株个体出现类似F1植株表型，41株个体呈现野生型表型，群体中各种表型分离比符合I : 2 l(x2 = 1.57 < X2atl5 =5. 99)。以上实验结果表明bio受单位点半显性基因控制。在ele2与Terese回交F2群体中，其中野生型105株，突变体32株，野生型与突变体分离比符合3 1(χ2 = 0. 197 < X2atl5=3. 84)。以上结果说明突变体ele2也为单基因隐性突变所致。实施例3. BIO的比较基因组定位和克隆3. I. BIO的比较基因组学定位和克隆为了分离克隆ELE2和BIO基因，本发明人利用比较基因组学进行定位克隆基因。bio突变体与百脉根生态型MG-20杂交，F1植株大量繁殖种子构建F2定位群体。bio突变体为半显性突变体，因此定位群体中的每个单株都可以在当代通过观察花瓣的表型来鉴定其基因型。为了确定与bio连锁的染色体位点，本发明人通过百脉根公共数据库查询，从百脉根中选取了约36个SSR分子标记进行初定位，其中相邻分子标记的遗传距离在IOcM左右，所用bio初定位群体为F2定位群体中呈现bio突变体表型的100个植株。实验中采集相应单株的叶片，微量制备基因组DNA作为模板。利用集团分离分析法(bulked segregationanalysis, BSA)，通过百脉根SSR分子标记的初步筛选，本发明人发现bio位于百脉根4号染色体长臂上的两个分子标记TM1874与TM0030之间5cM的区间。然后利用含有F2大群体对bio基因进行精细定位(3025株)，将bio定位到百脉根TM0234与TM2397之间。之后，本发明人得到BIO定位区段的完整重叠群CM0234，由TM0234、BM2378、BM2381、TM2397及TM1095克隆组成，涵盖区间约450Kb。本发明人将ele2突变体与JI992杂交，构建F2定位群体。以覆盖豌豆七个连锁群的SSR标记，以亲本TereSe、JI992、杂交后代F1基因组DNA以及从ele2定位群体中随机挑选的15个突变体DNA混合池为模板进行PCR扩增，寻找与ele2连锁的分子标记。连锁分析表明ele2基因与SSR标记AA430942连锁，位于豌豆4号连锁群上，进ー步研究发现，dCAPs标记SPS与ele2连锁，在165个突变体单株构成的ele2定位群体中SPS与ele2有9个交换单株。表2、用于bio和ele2定位分子标记
标记型_正向引物反向引物
PiGH dCAPS (Taq I } ACA AGAGGATGGAGGGTAAGA CiXOAGACACGGATTCOTGGAATTG
CTATTCG
I \ψιι H > I M11 f I \ ·\ ·\ τj-i \ Tfi ΛΤΓ4·<ITi^TTTT CU^ -χ τr TΤΓΙΤ-'rTΓ1 -SΓ' \Tif"1 4 Γ' 'ΤΤΓχ ^TCI 5.-1^ Vi Π v.,.-\r ο \ 4-\111 I rΛΛ·Τ·~\Λ,τ_·\ I iA_T i 1Λ_Τ、Τ \ J I I I I ·~^Λ_Γ^·I ν,ΤI I Ι,τ 1 i. .Λ.··.Κ., I I U.-i 11.
PiSTKC CAPS (Pst I } TTTCTTCTTTCTTCTC'CCTTCfCT CAOOACaOAOATCAATGCMCAALjANTH tlCAPS (Nck I ) (MCOCTTaGAAGGATOTGGACTTOTCTTTAATTTCAAAACCATAT
ΤΜ239' SS RCA CAATG AATACAT GA CtCCA C'C GCXXTCCAAACTGCAAAA利用百脉根BIO定位区域的序列，搜索蒺藜苜蓿的基因组数据库(www.medicago.org)，本发明人发现BIO区间与蒺藜苜蓿第8号染色体的一个区段存在共线性，而且该区段在染色体上与Mtsps基因的物理距离很近。以上结果表明，ele2可能是bio同源基因。为了证实这点和便于发展新的分子标记来精细定位ele2基因，对百脉根BIO区段及苜蓿对应区段的BAC序列进行基因预测和通过BLAST做基因功能注释，结合蒺藜苜蓿IMAGE分析的結果，本发明人发现百脉根重叠群CM0234与蒺藜苜蓿的AC161031和AC152423有着非常好的微线性，在百脉根和蒺藜苜蓿基因组BIO对应的区段中有11个同源的基因，百脉根的基因与蒺藜苜蓿的基因核苷酸序列和蛋白序列相似性都非常高，而且基因排布顺序也一致。在共线性分析的基础上，本发明人利用这两个模式系统中的序列信息来发展豌豆的SNP(CAPS/dCAPS)标记，用于精细定位ele2基因。选择在百脉根BIO定位区段和在蒺藜苜蓿对应区段的同源基因而且在拟南芥基因组中拷贝数比较低的基因来发展标记。对百脉根和蒺藜苜蓿序列进行比对，在保守区段以蒺藜苜蓿的序列为基础设计引物，以豌豆两个亲本Terese和JI992基因组DNA为模板进行同源克隆。通过实验，本发明人克隆了 3个同源基因的部分片段PsGH、PsANTH, PsSTK0测序结果表明，豌豆的这三个基因在ele2定位群体的两个亲本Terese和JI992之间有单核苷酸多态性。用dCAPS Finder 2. O软件将这三个基因发展成dCAPS分子标记(图2，表2)，在ele2定位群体中鉴定这些分子标记与ele2的连锁关系。结果发现，在ele2定位群体中，PsGH和PsSTK分别有2个和3个交换单株，而PsANTH与ele2基因共分离，从而将ele2定位在PsGH和PsSTK两个分子标记之间。同时，本发明人也将百脉根LjANTH基因发展成dCAPS标记(表2)，在bio定位群体中检测与bio的连锁关系，结果表明LjANTH与bio基因共分离(图2)。以上结果说明豌豆ELE2与百脉根BIO位点存在共线性，ele2与bio应该是同源基因突变所致。通过比较基因组学定位，本发明人发现ELE2与BIO位点具有很好的微线性，并将bio/ele2定位到CM0234 contig及对应的苜猜的两个BAC上。通过序列比较分析,该区段在百脉根与苜蓿一共有11个基因同源。本发明人首先利用百脉根bio突变体和野生型DNA对这11个候选基因进行检測。一系列引物扩增发现，其中ー个基因在bio突变体中PCR产物片段变大野生型Gifu扩增I. 2kb，而bio突变体中PCR产物片段大于5kb。以该基因序列设计一系列引物进行PCR扩增，结果表明该基因的第4个外显子上有片段插入(Gypsy反转座子插入在BIO基因基因组序列的1346位后和编码序列的983位后)。同时其他10个基因的ORF测序没有发现任何变化。利用3’ -RACE来分离bio突变体和野生型该基因转录本的3’末端。测序结果比对发现，在bio突变体的转录本中插入200bp的外源序列，导致BIO蛋白翻译提前終止。用200bp BLAST百脉根基因组数据库，结果发现这段外源序列来源于Gypsy反转座子的一段序列。本发明人首先在豌豆中克隆BIO同源基因PsBIO，进而检测在豌豆ele2突变体中PsBIO 是否突变。首先用引物 SL5474/SL5475 (序列分别是 ATGCCGCGGCCAGGGCCAAGGCC (SEQID NO :16)和 CCTAGATGCCGGCAAAATTG(SEQ ID NO : 17))克隆得到 BIO 同源性高的部分片段，然后用 SL5545、SL5546 和 B25 (序列分别是 AAGAAACGGCTTTAGGCACTC (SEQ IDNO 18)、CAGGAGTCACAGGGCAGGGAA(SEQ ID NO :19)和TCGATGTCGACTCGAGTC(SEQ ID NO :20))引物通过3’ -RACE得到豌豆中PsBIO基因的全长编码序列。当在豌豆突变体ele2中扩增PsBIO时，没有预期产物，而百脉根中bio旁邻基因在豌豆的同源基因都能在ele2突变体中扩增出来，因此认为快中子诱变导致豌豆ele2突变体中PsBIO缺失。结合豌豆和百脉根的实验结果，本发明人认为百脉根bio和豌豆ele2突变体是同源基因突变导致在百脉根bio突变体中Gypsy反转座子插入(Gypsy反转座子插入在BIO基因基因组序列的1346位后和编码序列的983位后)导致蛋白翻译提前終止，而在豌豆ele2突变体中快中诱变导致该基因缺失。
经分析BIO cDNA序列和基因组序列，本发明人发现BIO基因是由4个外显子组成，编码ー个与动物转录因子辅助因子非常同源的蛋白(图3)。它的基因组序列(gDNA)如下LjBIO gDNA (加黑字体为外显子，带下划线字体的为内含子，Li表示百脉根):
ATGCCGAGGCCAGGGCCAAGGCCTTACGAGTGTGTCAGAAGGGCTTGGCACAGCGAGCGCCACCAACCCATTA
GAGGAACCATCATTCAACAGATTTTCAG GTTCTGGGTTCATCTTGGTTTTTTCAGTTTCCCCTCTTTTTTCTTAG
CATGCCCATTTTGTTGACTTTGATTGTTGCACACCACCTGTTTGATTAG GGTCGTCAATGACGCGCACAGT
CCTGCTACTAAGAAGAACAAGGAATGGCAAGAGAAGCTTCCTTTTGTTGTTCTCAAAGCTGAAGAAATCATGT
ACTCCAAGGCAAATTCTGAG GTTTTTTACACCTAATGCTTGTGGAATTTTAGATCTTTCACTGTGTTGCATGAACC
CTTTTTGCCTAATTTTTGTGTGGTTTTGTTTGTTGGTTAG GCAGAGTACTTGAATCCTGATACGCTCTGG
GACCGCCTTAATGATGCTGTTAACACAATCATTCGGAGAGATGAGGCTACTGAGACAGGAGACCTCTTGCCCC
CATGTGTTGAAG GTACTCAATTTTTCATCTTTTATGGATCCACTACTTATAGTTTGTGTCAAAATGCTATTTTGTT
GTGTCATTTGGGATATAGAGAGTATGTATTGTAGAGTGAAAAGTTTAGTAATTTTAGCTGCCAGTGATGTGTTTTTC
ATTTTTGGTTTTCTGGGTATGTTTGATCAG CTGCACTCA ΑΓΓΤΓτΓτΟΑTGCA A AΓΓΑΓτΤΓτΑΓτΑΑΓΤΤ
CGAGAAGTGATCGGCACAATAACCCCAGAACATACCTTTCTCCAAGTACTCAACAACCTCCTCCTGGGTCTCC
TAGACCTGCTGGGGGGAATCCCTTAAACTATGCAAGAGTGACAACTTCTGCACTTGCATCTGTTCCTGTGTCA
AATTCTACCCACCAAAGTAGTAAGGTGATGGGTAACCGTAGCTATCCCTTTTCAGACAATTTCCCTTCTGGTC
ATCACCAGCCATTGGCAATGGAAGCTAAACCCTCATTGAACTTGGGTTCAGTTTATCCCTTGTACTATGTTTA
TGATGCCAGAGAGCCTCAACCAAGGTCGACCGCCCTAGATAACCCTTGTTCTGACACCATCTTTGTTGGCAGA
CCAGTCATTACTCCAGCCCCAGAGACATCTGGAATTGGTCTTTTGGAACACACATCCTATGGTAGGTTTCATC
ATGCTCCAAACAGAATTGCTAAGGAAACTGCTGTAGGCACTACTCAGGAGGAGTCACAAGATGGGGAATGTGA
TTTATCTTTGAGGTTGGGTCAGTGTTTGCATCCTTGTTCCAGCAGCAAAAGTGGTTCAGCATATGGAATTGAT
GATGTTAGTTTAGGACTTTCTCAGGAGGGCAGCAAGTTCAGTCATCTATCTTTGCAGAAAAATCAGGAGTTTT
GTTTTCACCCTAGAGAAGCAGGTTATGGGACCATTGACCCCAATTCCAGATATAATGTAGAGGGTGGAGATCA
GAACTTGGAGGCAACTTTCCGGAAGCGCAAAGCACCTTTAGGTAACAATGAGGAGGATGGGCAATTTTGCCGG
CATCTAGGAGTCCCATCCAATCGTTTTATTGGTAGGCCAGGTTTGTAG (SEQ ID NO :2)实施例4、不同的植物种属中BIO基因功能验证
拟南芥、夏堇和百脉根三个模式植物中分别进行了 BIO(野生型基因)(SEQID NO 6)和BI0m(突变基因)(SEQ ID NO 6的1-328AA)的转基因工作，希望证明BIO基因在不同的植物种属中都能行使调控器官大小的功能。I、在拟南芥中的转基因结果35S =BIO-GFP质粒(载体为pCAMBIA 1302)进行拟南芥转基因，一共得到15个株系，在其中4个株系的Ttl代植株中可以观察到器官显著变小的表型(转基因植株叶片面积变小，约为野生型叶片面积的60% ;果荚变短，长度仅为野生型的45%，种子数目也相应地发生显著減少)。2、在百脉根中的转基因结果35S :BI0m-GFP质粒(载体为pCAMBIA 1302)转基因目前已得到17个转基因株系，已有5个株系开花，其中有I个株系的花有明显不同于野生型的表型，侧部花瓣变对称；腹部花瓣的内部的非対称性也有可见的变化，与百脉根中的ΒΙΟ/bio杂合子表型相似，如图 4。3、在夏堇中的转基因结果35S =BIO-GFP转基因共得到50个转基因株系，其中6个株系的花器官与野生型比较均发生显著变小，如图5。小结与讨论I. ele和bio突变体的分离和遗传分析本发明人通过在筛选豌豆中快中子诱变群体和百脉根中EMS诱变群体，得到ー类侧生器官变大和影响花瓣内部非対称性的突变体。遗传分析表明在豌豆中ele2分别由单位点隐性基因控制，而百脉根bio为半显性单基因调控。2.比较基因组学克隆BI0/ELE2基因初歩定位发现，ele2位于豌豆第4号连锁群，bio定位到百脉根4号染色体。通过比较基因组学定位，ele2与bio被定位到豆科基因组的的ー个微共线性区域。通过序列比较分析，该区段在百脉根与苜蓿一共有11个基因同源。在突变体中对这些候选基因的序列分析和基因结构分析表明百脉根bio和豌豆ele2突变体是同源基因突变导致，在百脉根bio突变体中Gypsy反转座子插入导致蛋白翻译提前终止,而在豌豆ele2突变体中快中子诱变导致该基因缺失。本发明人共获得了 3株等位的ele2突变体。本领域通常认为，多个等位突变都是同一基因突变造成的话，就可以认定此基因具有相应的功能。3. BIO基因在侧生器官大小发育中的作用百脉根bio和豌豆ele2突变体突变后不仅植株变高大，叶片、花和种子等侧生器官都变大。虽然BIO控制器官大小的分子机制暂时不还清楚，但从蒺藜苜蓿中bio相似突变体的芯片分析的数据来推測，它们是通过影响生长素和细胞分裂素等植物激素的信号转导，进而调控器官大小发育的。利用BIO基因在豆科侧生器官大小发育中的重要作用，利用转基因技术，可以通过分子设计来改变大豆的花型，从而创造出花器官变大，有利于蜜蜂传粉的、适合大豆杂种优势利用的育种材料。由于拟南芥、夏堇和百脉根分属不同的科，在BIO或BIOm转基因植株中得到器官大小或形状发生变化的表型，有力地证明BIO在调控器官大小的分子途径中具有保守的功倉^:。在夏堇中得到的BIO转基因花明显小于野生型的花，与预期相吻合BIO可以负调细胞的増殖，从而调控器官的大小。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为參考，就如同每ー篇文献被単独引用作为參考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种分离的多肽，该多肽选自下组 (a)SEQ ID NO :6所示氨基酸序列的多肽；或 (b)将SEQID NO 6所示氨基酸序列经过ー个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)的多肽相同功能的由(a)衍生的多肽。
2.一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组 (a)编码如权利要求I所述多肽的多核苷酸；或 (b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQIDNO :1 或 2。
4.权利要求I所述的多肽的截短体，该截短体是 如SEQ ID NO 6中第1-328位所示氨基酸序列的多肽。
5.一种分离的多核苷酸，它编码权利要求4所述的多肽截短体。
6.—种载体,其特征在于,它含有权利要求2-3、5中任一项所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体，或其基因组中整合有权利要求2-3、5任一所述的多核苷酸。
8.权利要求I所述的多肽或权利要求4所述的多肽截短体、或编码所述多肽或多肽截短体的多核苷酸的用途，用干 调节植物株型大小； 调节植物器官大小；或 调节植物花器官的内部非対称性。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的器官包括叶片，花器官，种子。
10.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的多肽或编码所述多肽的多核苷酸用于 促进植物株型变小；或 促进植物器官变小。
11.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的多肽截短体或编码所述多肽截短体的多核苷酸用于 促进植物器官的内部対称性。
12.—种权利要求I所述的多肽或其编码基因的调节剂，其是激动剂或抑制剂； 较佳地，所述的调节剂是抑制剂，其是特异性干扰权利要求I所述的多肽的编码基因表达的干扰分子；或是特异性抑制权利要求I所述的多肽表达的抗体或配体。
13.—种调节植物大小、调节植物器官大小或调节植物花器官内部非対称性的方法，其包括调节植物中权利要求I所述的多肽或其编码基因的表达或活性。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法包括 将权利要求2-3、5中任一项所述的多核苷酸转入植物中；或将干扰权利要求I所述的多肽的编码基因表达的干扰分子转入植物中；或 在植物基因组中，将权利要求I所述的多肽的编码基因进行突变，从而降低植物中权利要求I所述的多肽的表达。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法包括(1)提供携帯表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有权利要求2-3任一所述的多核苷酸、权利要求5所述的多核苷酸或干扰权利要求I所述的多肽的编码基因表达的干扰分子; (2)将植物细胞或组织或器官与步骤(I)中的农杆菌接触，从而使权利要求2-3或5任一所述的多核苷酸或干扰权利要求I所述的多肽的编码基因表达的干扰分子转入植物细胞或组织或器官。
16.—种制备植物的方法,其特征在于,将转入了权利要求2-3任一所述的多核苷酸、权利要求5所述的多核苷酸或干扰权利要求I所述的多肽的编码基因表达的干扰分子的植物与非转基因植物杂交，获得杂交后代，该后代在植物株型大小、植物器官大小、植物花器官内部非対称性方面呈现与非转基因植物不同的表型。
17.—种权利要求I所述的多肽或其截短体的制备方法，其特征在于，该方法包含 (a)在适合表达的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞； (b)从培养物中分离出权利要求I所述的多肽或其截短体。
18.—种权利要求I所述的多肽或其编码基因的用途，用作鉴定植物的株型或器官大小，以及鉴定植物花器官内部非対称性的分子标记物。
全文摘要
本发明涉及调节植物器官大小和花器官内部非对称性的方法。本发明人首次定位和分离到一种新的植物基因，基于该基因或其调控分子可制备株型、器官大小改变的转基因植物或花器官内部对称性改变的转基因植物。
文档编号G01N33/68GK102675437SQ20121001991
公开日2012年9月19日 申请日期2012年1月21日 优先权日2011年1月26日
发明者李信, 杨军, 罗达 申请人:中国科学院上海生命科学研究院, 中山大学