专利名称：：线粒体替代实验小鼠品系C57BL/6J-Mit<sup>C3H/HeJ</sup>的构建的制作方法
技术领域：
：本发明属小鼠品系的构建领域，特别是涉及线粒体J替代实验小鼠品系C57BL/6J-MiP目eJ的构建。技术背景哺乳动物的体细胞拥有两套不同的且相互独立的基因组，即核基因组和线粒体基因组。在大部分的哺乳动物细胞中，线粒体DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)总量占细胞总DNA量的0.1^-1.0%。mtDNA突变在神经退行性疾病、衰老和肿瘤等多种生理及病理过程中发挥重要作用。内交系实验小.鼠C3H/HeJ(C3H)和C57BL/6J(B6)是研究哺乳动物性发育启动的调控机制重要模型动物，因为前者性发育时间早，后者性发育时间晚，雌性小鼠的性发育时间相差5天左右，通过这两个品系小鼠杂交建立家系，可用来研究小鼠性发育的遗传学调控机制。在前期研究中，我们发现在用这两个品系通过正反交建立的杂交Fl代，其性发育的启动时间存在明显差异，而正反交的杂交Fl代核基因组是完全相同的，线粒体只来源于母亲，因而是不同的。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种线粒体C3H/HeJ替代实验小鼠品系的构建，本发明的线粒体替换品系可以研究在相同核基因组背景下，由不同的线粒体基因组带来的性状差异，是用遗传学方法研究线粒体基因组功能的有用工具。本发明的一种线粒体替代实验小鼠品系C57BL/6J-MitG^eJ的构建，包括(1)回交取C3H/HeJ和C57BL/6J两种品系的小鼠，以C3H做母本，B6做父本杂交得Fl代；将F1代母鼠与B6雄鼠杂交得C3B61，为回交一代；以此轮回杂交十代，得到回交十代的小鼠C3B61、(2)鉴定回交(a)通过Blast两品系小鼠的线粒体序列，找到4个SNP位点，以C3H，回交和B6小鼠DNA为模板，进行PCR扩增，再对片段进行测序，鉴定回交小鼠的线粒体DNA，其中上游引物5，—3，ATTCCTTATTGTTTGCCTACT下游引物5，—3，ATATTAGGTGAGAGCGAAAT;(b)从小鼠全基因组中随机选取40个STR位点，STR位点在C3H/HeJ和C57BL/6J两个品系中的片断长度互不相同，并相差2个bp以上，且在每条染色体上分布平均，约1520cM，对40个STR位点进行引物设计，鉴定回交小鼠的基因组DNA。所述歩骤小鼠购自中科院上海实验动物中心。所选择的STR如表3所示。在NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)等网站上搜索到C3和B6两品系小鼠的线粒体的序列信息。从NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)进入小鼠基因组数据库，从中选取小鼠STR(shorttandemrepeat)位点，对这些位点进行引物设计，主要借助Oligo6.0程序完成。线粒体替代品系将某一近交系小鼠品系的线粒体作为供体，本发明中供体为C3H小鼠；另一品系作为受体(本发明中为B6小鼠)，两个品系杂交后与受体品系回交，通过与轮回亲本回交10代后，得到的小鼠细胞中线粒体来源于C3H，核基因组的99.90%跟受体品系是一致的。C3H小鼠和B6小鼠线粒体DNA序列在3个位点上有4个核苷酸差异，涉及3个基因，将C3H小鼠线粒体置换到B6小鼠的核基因组背景上，可以对这些基因的功能进行更全面的研究，以及它们是否参与了某些性状的调控。有益效果(1)线粒体替换品系可以研究在相同核基因组背景下，.由不同的线粒体基因组带来的性状差异，是用遗传学方法研究线粒体基因组功能的有用工具。(2)操作方法简便，廉价。.图1回交遗传效应示意2亲本(B6,C，3H)和线粒体替换(B6C31Q)小鼠图图3C3H、回交、B6的线粒体SNP.位点测序结果图图4小鼠生长曲线具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样罗于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例l:线粒体替换小鼠的构建办法1.回交取C3H和B6两种品系的成年小鼠，以C3H做母本，B6做父本杂交得Fl代。将Fl代母鼠与B6雄鼠杂交得C3B61，为回交一代。以此轮回杂交十代，得到回交十代的小鼠C3B610。2.线粒体基因组鉴定针对C3H和B6小鼠的线粒体SNP位点设计一对引物上游引物5，—3，ATTCCTTATTGTTTGCCTACT下游引物5'—3'ATATTAGGTGAGAGCGAAAT以C3H,回交和B6小鼠DNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系表1PCR反应体系<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>PCR温度循环:表2PCR温度循环条件<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>将PCR扩增产物测序，序列如图3所示3.核基因组STR鉴定从NC印(NationalCenterforBiotechnologyInformation)得到这些STR位点的序列，然后对这些STR.位点进行引物设计。引物设计主要借助01igo6.Q程序完成。表3本发明中选定的STR位点<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>D歸1922610D9Mitl66416D10Mit29838D腿it214196D訓it29406DllMi細796D12Mit60166D12Mit74296D薩itll0.76D画it59156D15Mi謹6.712D15Mitl0020.26D16Mitl293.414D薩i麵71.458D17Mi腦21.656D17Mitl2955.710D薩itl83376D腿it21"3554D雇it90416D醒itl3755.710采用多重PCR方案进行扩增，扩增产物用377型测序仪分析。结果如下表所示:_表4回交小鼠STR各点基因型_遗传位标DXDXDlDlD2D2D3D3D4D4D5MitMitMitMitMitMitMitMitMitMitMit1401661023610340922122530171367对照B6B6B6B6B6B6B6B6B6B6B6B6回交B6B6B6B6B6B6B6B6B6B6B6遗传位标7D5D7*D7D8D8D9D9D10D10DllDllMitMitMitMitMitMitMitMitMitMitMit28722834612428319216629821429104对照B6B6B6B6B6B6B6B6B6B6B6B6回交B6B6B6B6B6B6B6B6B6B6B6遗传位标D12D12D14D14D15D15D16D16D17D17D18]VtitMit.MitMitMitMitMitMitMitMitMit60741159102100129106104129183对昭"、B6B6B6B6B6B6B6B6B6B6B6B6回交B6B6B6B6B6B6B6B6B6B6B6遗传位标D18D19D19MitMitMit21390137对照B6B6B6B6回B6B6B6交实施例2;回交小鼠的生长曲线及性发育的测定(1)小鼠规模回交与轮回亲本B6小鼠公、母各40只测生长.曲线及性发育情况。(2)生长曲线的制作8从小鼠出生的隔日开始称重，并将隔曰的小鼠体重记为第一天体重。之后每隔两天对小鼠称重一次，直至35天后小鼠完全成熟。回交小鼠与B6小鼠生长曲线如图5所示(3)性发育的测定从断奶那天开始，每天检测幼鼠性发育的情况，观察雌鼠阴道是否开启，雄鼠包皮是否分离。并在雌鼠阴道开启和雄鼠包皮分离的那天称量体重，记为发育时体重，及发育天数。用SPSS统计软件，对B6、回交雌鼠阴门开启年龄、体重、初生体重及雄鼠包皮分离年龄、体重、初生体重进行独立样本t检验，考察两组样本是否有差异。表5雌鼠阴门开启年龄比较<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>从上面表5中可以看出回交的平均阴门开启年龄与B6的相近。(B6为27.38士1.52天，回交为27.41±1.54天)，且两样本差异不显著(P>0.05)。表6雄鼠包皮分离年龄比较<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>从上面表6中可以看出回交的平均包皮分离年龄与B6的相近。(B6为32.23±1.88天，回交为32.22±1.88天)，且两样本差异不显著(P〉0.05)。表7雌鼠发育体重比较<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>从上面表7中可以看出回交的雌鼠平均发育体重与B6的相近。(B6为13.13士l,21克，回交为12.77士1.52克)，且商样本差异不显著(P>0.05)。表8雄鼠发育体重比较<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>从上面表8中可以看出回交的雄鼠平均发育体重与B6的相近。(B6为17.62±1.22克，回交为17.55±1.00克)，且两样本差异不显著(P>0.05)。权利要求1.线粒体替代实验小鼠品系C57BL/6J-MitC3H/HeJ的构建，包括(1)回交取C3H和B6两种品系的小鼠，以C3H做母本，B6做父本杂交得F1代；将F1代母鼠与B6雄鼠杂交得C3B61，为回交一代；以此轮回杂交十代，得到回交十代的小鼠C3B610；(2)鉴定回交(a)通过Blast两品系小鼠的线粒体序列，找到4个SNP位点，以C3H，回交和B6小鼠DNA为模板，进行PCR扩增，再对片段进行测序，鉴定回交小鼠的线粒体DNA，其中上游引物5’→3’ATTCCTTATTGTTTGCCTACT下游引物5’→3’ATATTAGGTGAGAGCGAAAT(b)从小鼠全基因组中随机选取40个STR位点，STR位点在C3H/HeJ和C57BL/6J两个品系中的片断长度互不相同，并相差2个bp以上，且在每条染色体上分布平均，约15～20cM，对40个STR位点进行引物设计，鉴定回交小鼠的基因组DNA。全文摘要本发明涉及线粒体替代实验小鼠品系C57BL/6J-Mit<sup>C3H/HeJ</sup>的构建，包括(1)回交取C3H和B6两种品系的小鼠，以C3H做母本，B6做父本杂交得F1代；将F1代母鼠与B6雄鼠杂交得C3B6<sup>1</sup>，为回交一代；以此轮回杂交十代，得到回交十代的小鼠C3B6<sup>10</sup>；(2)鉴定回交(a)通过Blast两品系小鼠的线粒体序列，找到4个SNP位点，本实验通过扩增线粒体片段再对片段进行测序，鉴定回交小鼠的线粒体DNA；(b)从小鼠全基因组中随机选取40个STR位点，对40个STR位点进行引物设计，鉴定回交小鼠的基因组DNA。本发明用于研究小鼠性发育启动的影响。文档编号A01K67/00GK101502248SQ20081020224公开日2009年8月12日申请日期2008年11月5日优先权日2008年11月5日发明者周宇荀,周玉梅,戴春花,管清华,肖君华申请人:东华大学