抗真菌剂的制作方法

专利名称：抗真菌剂的制作方法
技术领域：
本发明是关于发酵产生的且可用作抗真菌剂的异噁唑烷酮(isoxazolidinone) 化合物。
背景技术：
美国第6，017，924号专利描述了可用作雄激素受体调节剂的吡啶并喹啉，吡啶并 吡咯烷并喹啉和相关化合物。此外，WO 97/49709描述了可用作雄激素受体调节剂的非类 固醇氮杂多环物质。人们已经知道许多麦角色素(ergochrome)次级真菌代谢产物的结构和活性，包 括黑麦酮酸在内。Von B. Franck & H. Flasch, DieErRochrome (PhysioloRie, IsolierunR, Strucker und Biosynthie)，30Fortschritte der Chemie OrRanischer Naturstoffe 151-206 (1973)，描述了麦角色素AA(黑麦酮酸A)，麦角色素BB(黑麦酮酸B)，麦角色素 AB (黑麦酮酸C)和麦角色素EE (黑麦酮酸D)等的结构和特性。Colin C. Howard & Robert Α. W. Johnstone, FunRal Metabolites. Part IV. Crystal and Molecular Structure of Secalonic Acid A, T. C. S. Perkins Transactions I 1820-1822 (1976)，描述了 黑麦酮 酸 A 的晶体和分子结构。Raymond Anderson 等人，Secalonic Acids D and F AreToxic Metabolites of Aspergillus aculeatus, 42 (2) T. Org. Chem. 352-353 (1977)，将黑麦酮 酸D和F描述为棘孢曲霉(aspergillus aculeatus)的毒性代谢物。Itsuo Kurobane等 人，A New Secalonic Acid, LinkaReBetween Tetrahydroxanthone Units Determined From Deuterium Isotope-C Chemical Shifts, Tet. Lett. 4633-4636 (1978)，对黑麦酮酸 G的结构作出描述，所述黑麦酮酸G从棘壳孢红根腐菌(pyrenochaetaterrestris)分离而 出。Istuo Kurobane 等人，Biosynthetic RelationshipsAmonR the Secalonic Acids. Isolation of Emodin,Endocrocin andSecalonic Acids from Pyrenochaeta terrestris and Aspergillus aculeatus, 32 (12) T. Antibiot. 1256-1266 (1979)，描述了大黄素，山 扁豆酸和黑麦酮酸A，E和G从棘壳孢红根腐菌的分离，大黄素，山扁豆酸和黑麦酮酸B， D和F从棘孢曲霉的分离，并对黑麦酮酸之间的生物合成关系作出说明。A. E. Pohland等 人，Physicochemical Data forSome Selected Mycotoxins,54(11)Pure & App1. Chem. 2219-2284(1982)，对所选真菌毒素的物理化学数据做出描述，包括黑麦酮酸D。Charles L. Barnes 等人，Crystal Structures of Methanol and EthanolSolvates of Secalonic Acid D，29(9) J. Chem. Crystallography 1031-1035 (1999)，对黑麦酮酸 D 的甲醇和乙醇 溶剂化物的晶体结构做出描述。George R. Pettit等人，Isolation and Structure of Ruprechstyril fromRuprechtia tangarana, 66 J. Nat. Prod. 1065-1069 (2003)，描述了 ruprechstyril 从 Ruprechtia tangarana 的分离，并对其结构作出描述。Richard J. Cole & Richard H. Cox, Handbook of Toxic FungalMetabolites，647—661 (Academic Press 1981)，描述了黑麦酮酸A，B，C和D的化学和毒性数据。然而，我们仍需要一般用途的强力抗真菌剂，以应对与人类和农作物真菌感染有 关的病原体。
发明概述本发明涉及化合物，该化合物选自式I和式II的化合物， 或其在制药上或农业上可接受的盐类。在式I和II中，R1是选自由氢和C1-C6烷 基构成的组，且R1在一个特定实施方案中是氢。这些化合物是强大的抗真菌剂，具有广谱 活性，并可用于抵制与人类和农作物真菌感染有关的病原体。本发明的其它方面涉及组合物，该组合物包括本发明化合物的混合物，制药和农 业组合物，以及包含本发明化合物的配制剂。此外，本发明还涉及以下方面制备本发明化 合物的方法，治疗或预防使用了本发明化合物的人和动物出现真菌感染的方法，以及控制 使用了本发明化合物的人，动物和植物出现真菌感染的方法。发明的详细说明本发明的一方面是提供提纯的化合物，该化合物选自于由式I和II的化合物，其 制药上可接受的盐类以及其农业上可接受的盐类构成的组。在式I和II中，R1选自由氢和 (^-(；烷基构成的组。在特定实施方案中，R1是氢。 本发明化合物可从生物标本中获得(如下所述)，可由对来自于生物标本的化合 物进行化学改性而产生，或可化学合成。本发明化合物可能是天然存在的化合物和化合物 的混合物，或可以是分离和提纯的，以提供“提纯的”化合物和/或组合物。在本文中使用时，术语“提纯的”是指按以下形式提供的化合物或组合物，即基本 上不含除了式I和II的所需化合物及其盐之外的任何其它成分；例如，如果包含式I和II 的化合物及其盐(其中R1是氢)的混合物的组合物基本上不含除了前述混合物之外的任 何其它真菌成分，则其可被称为“提纯的”组合物。本发明的另一方面是提供组合物，该组合物包括一种或多种选自式I或II化合物及其制药或农业上可接受盐的化合物。在某些实施方案中，此类组合物可以是提纯的。此 夕卜，所述组合物可以是此类化合物的外消旋混合物(在某些实施方案中)。
本发明的另一方面是提供药物组合物，该组合物包括式I或II的一种或多种化合 物或其盐，和制药上可接受的载体。式I和II化合物的制药学上可接受的盐包括例如无机碱盐，如碱金属盐(例如钠 盐和钾盐)，铵盐和有机碱盐。适合的有机碱盐包括胺盐，如四烷基季铵盐(如四丁铵和三 甲基十六烷基铵)，三烷基胺盐(如三乙胺)，二烷基胺盐(二环己基胺)，任选取代的苄胺 (如苯基苄胺和对溴苄胺)，乙醇胺，二乙醇胺，N-甲基葡萄糖胺，N-甲基哌啶，吡啶，取代的 吡啶(如可力丁，卢剔啶和4-二甲基氨基吡啶)，以及三(羟甲基)甲胺盐及氨基酸盐(如 赖氨酸或精氨酸盐)。本发明的另一方面是提供药物组合物，该组合物包括式I或II的一种或多种化 合物或其制药上可接受的盐以及第二种治疗剂或其制药上可接受的盐的组合。所述第二 种治疗剂是选自以下的化合物唑类(azoles)；多烯类；嘌呤或嘧啶核苷酸抑制剂；复合 碳水化合物抗真菌剂，纽莫康定(pneumocandin)衍生物和棘白菌素(echinocandin)衍生 物；多氧菌素；甘露聚糖抑制剂；杀菌性/渗透性诱导蛋白质产品；延伸因子抑制剂；和免 疫调节剂。更尤其是，所述第二种治疗剂可选自唑类，如氟康唑，伏立康唑，伊曲康唑，酮康 唑，咪康唑，ER 30346和SCH 56592 ；多烯类，如两性霉素B，制霉菌素(nystatin)，和脂质 体(liposomal)及其脂类形式，如Abelcet ，AmBisome 和Amphocil ；嘌呤或嘧啶核苷酸 抑制剂，例如氟胞嘧啶；复合碳水化合物抗真菌剂，纽莫康定衍生物或棘白菌素衍生物，如 卡泊芬净，安麻吩金(enfumafungin)，micofungin及其类似物；多氧菌素，如尼可霉素(如 尼可霉素Z)；和其它甲壳质抑制剂；甘露聚糖抑制剂，如predamycin ；杀菌性/渗透性诱导 (BPI)的蛋白质产品，如XMP. 97和XMP. 127 ；和延伸因子调节剂，如粪壳菌素及其类似物。 在某些实施方案中，所述第二种治疗剂是选自伊曲康唑，氟胞嘧啶，氟康唑，两性霉素B和 卡泊芬净的化合物。本发明还有一方面是提供农用化学品组合物，该组合物包含式I或II的一种或多 种化合物或其盐和农业上可接受的载体。本发明还有一方面是提供农用化学品组合物，包括式I或II的一种或多种化合物 或其农业上可接受的盐，以及第二种活性成分。所述第二种活性成分可以选自于除草剂，杀 虫剂，杀菌剂，杀线虫剂，杀螺剂，生长调节剂，微量营养物，肥料和杀真菌剂构成的组。式I或II的化合物和其制药上或农业上可接受盐在本文中还称为“活性成分”，在 与制药上或农业上可接受载体一起配制成组合物或配制剂时，将获得最有效的利用。“组合 物” 一词，如在“药物组合物”或“农用化学品组合物”中的，意在涵盖包含一种或多种构成 载体的活性成分和惰性成分的产品。“组合物”一词还意在涵盖因任何两种或更多种活性成 分和/或惰性成分的结合，络合，凝聚或其它相互作用而直接或间接产生的任何产品；一种 或多种活性成分和/或惰性成分的分离而直接或间接产生的任何产品；以及一种或多种活 性成分和/或惰性成分任何其它类型的反应产生的任何产品。药物和农用化学品组合物包含至少一种在抗真菌方面治疗有效量的活性成分。本 文中所用“治疗有效量”是指足以产生所需治疗效果的活性成分量。例如，化合物的抗真菌 治疗有效量，是指足以显示一种或多种真菌菌株的抗真菌活动和/或抑制增长的量。
在药物组合物中，活性成分的抗真菌治疗有效量的范围可以为大约0. 001毫克每千克患者体重至大约400毫克每千克患者体重。药物组合物和/或农用化学品组合物可以通过将一种或多种活性成分与载体紧 密混合而制成，并且可选择该载体的成分以提供所需的介质。例如，配制的霜剂或洗液可通 过将活性成分混合入适当选取的霜剂或洗液成分中，以产生约0. 01%至约8%的活性成分 浓度而制成。根据本发明的某些方面，药物组合物和农用化学品组合物可配制成适用于口服， 局部的，非肠道的(包括腹腔内(I.P.)，皮下，肌肉内和静脉内(I.V.))，经鼻和栓剂给药， 或以吹入给药。当活性成分用作抗真菌剂时，给药的任何适用方法均可使用。当活性成分用于治 疗真菌感染时，通常采用口服或静脉给药。对于口服给药，一些实施方案的药品组合物和农用化学品组合物可以被配制成液 体或固体组合物。液体组合物的制备可以通过将活性成分与制药上或农业上可接受的液体 载体的结合进行，所述载体如水，二醇，油，酒精和类似物。对于固体组合物，活性成分可以 与制药上或农业上可接受的固体载体相结合，所述载体如淀粉，糖，高岭土，乙基纤维素，碳 酸钙，碳酸钠，磷酸钙，滑石和乳糖。这些固体载体可以任选地与润滑剂(如硬脂酸钙)相 结合，和/或与粘合崩解剂或类似物相结合。因为片剂和胶囊易于给药，在某些情况下，这 些剂型可以代表最便利的口服给药形式。单位剂型的组合物也构成本发明的一部分。对于注射给药，一些实施方案的药物组合物和/或农用化学品组合物可以被配制 成悬浮液，溶液或乳状液。对于可注射组合物，制药上或农业上可接受的载体可以是油性载 体或含水载体，如含0.85%氯化钠的水，或含5%葡萄糖的水。此外，可注射组合物可以包 括配制用剂，如缓冲剂，增溶剂，悬浮剂和/分散剂。缓冲剂，以及诸如盐水或葡萄糖等添加 齐U，可以被添加进去以制成等渗透压的溶液。对于静脉点滴给药，活性成分可以溶解在酒精 /丙二醇或聚乙二醇中。可注射组合物可以作为液体组合物，安瓿中的单位剂型，或多次剂 量的容器提供，任选包含额外的防腐剂。做为选择，提供的活性成分也可以是粉末状，且可 以在给药之前在适当的液体载体中重构。“单位剂型” 一词在说明书和权利要求中使用时，指物理上的离散单位，每单位剂 型包含预定量的活性成分，目的在于达到所需的治疗效果，与可接受的载体相结合。该种单 位剂型的例子包括片剂，胶囊，药丸，粉包，圆片，以安瓿或多次用量容器测量的单位，以及 类似物品。还有，本发明的另一方面是提供治疗或预防真菌感染的方法，真菌感染可以是系 统性和/或非系统性的，针对哺乳动物(包括人和动物)而言，其中该方法包括对哺乳动物 投放治疗有效量的活性成分。这方面的方法可用于治疗或预防菌类感染，如新型隐球菌，白 色念珠菌，白色念珠菌，光滑念珠菌，葡萄牙念珠菌，近平滑念珠菌，克鲁斯氏念珠菌，热带 念珠菌，酵母菌和熏烟色曲菌。本发明还有一个方面是，提供治疗或预防哺乳动物真菌感染的方法，这包括为前 述哺乳动物施用治疗有效量的活性成分和第二种治疗剂，该第二种治疗剂选自于以下一组 化合物唑类；多烯类；嘌呤或嘧啶核苷酸抑制剂；复合碳水化合物抗真菌剂，纽莫康定衍 生物和棘白菌素衍生物；多氧菌素；甘露聚糖抑制剂；杀菌性/渗透性诱导蛋白质产品；延伸因子抑制剂；和免疫调节剂。本发明还有一个方面，是提供控制导致植物致病的真菌类的方法，该方法包括向 需要此种控制的动植物施用治疗有效量的活性成分。还有一个方面，本发明要提供控制导致植物致病的真菌类的方法，该方法包括向 有此需要的动植物施用治疗有效量的活性成分和第二种活性剂，该第二种活性剂选自除草 齐U，杀虫剂，杀菌剂，杀线虫剂，杀螺剂，生长调节剂，微量营养物，肥料和杀真菌剂等构成的
组。 在本文使用时，除非另有说明，以下术语具有下文所示的意义。本文所用“植物” 一词，意在包括活的植物和植物材料，例如叶子，花，种籽，果实， 以及从植物中获得的其它材料。该术语还包括植物的根，活性成分通过施用到土壤而投放 到所述根处。本文所用“哺乳动物” 一词意在包括人类和温血动物，包括驯养动物如猫，狗，牲畜寸。本文所述的化合物，可以通过真菌菌株MF7022和/或MF7023的发酵，及溶剂萃取 而制成。在一些实施方案中，通过真菌菌株发酵和溶剂萃取获得的化合物，可以进一步合成 地改性，以生成本发明的其它化合物。此外，本发明的化合物可以合成地制成。真菌菌株MF7022和MF7023已被识别为赤壳属类(cosmospora sp.)(肉座菌目)， 其分离自在西班牙马德里的Mirafloresde la Sierra收集到的苔藓叶状体。真菌菌株 MF7022和MF7023已根据布达佩斯条约于2006年9月26日进行保藏，菌种保藏于在10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209 的 American Type Culture Collection,且指定的编号分别为ATCC编号PAT-7894和ATCC编号PAT-7895。在本文使用时，真菌菌株的“生物纯样” 一词指感兴趣的真菌菌株的样品，且并不 是按自然发现的形式提供的，也就是说，真菌菌株生物上的纯样包括感兴趣的真菌菌株，但 基本上缺少真菌菌株，真菌材料和/或其它生物材料。在2 2 °C，在连续的荧光照射下生长21天后，不同琼脂培养基中的MF70 2 2和 MF7023菌株菌落显示出以下形态特征。对于2%麦芽提取物(Difco )琼脂，菌落直径达 到30-31毫米，菌丝浸入，光滑的菌丝限制在中心；菌落边界处(margin)均勻，且在边缘处 显得透明；菌落颜色为淡黄色到金黄色或黄褐色，反面也是一样。在玉米粉(Difco )琼脂 中，菌落直径达40-45毫米，菌丝浸入且外观透明，同时菌落边界处为细密的须毛。在燕麦 片(Difco )琼脂中，菌落直径为39-40毫米，菌丝紧贴于中心，柔软且有刚毛；菌落颜色为 淡黄色到金色，带白色气生菌丝，形成不明显的环带(subzonate)，某些区域则没有气生菌 丝；菌落反面为暗金色。分生孢子阶段仅可在使用玉米粉琼脂，在相对较低温度(16°C )，且在延长的孵化 期(超过6周)后观察得到。当菌丝完全覆盖琼脂表面且停止延伸时，在菌落边缘处形成 分散的分生孢子座(sporodochia)。分生孢子座的颜色是透明到淡桔色或桃红状桔色，直 径高达300微米，由一到多个在琼脂表面形成的分生孢子梗构成。分生孢子梗由表面菌丝 生成的短平行分支组成，使呈流苏状分支的产孢细胞形成稀疏或紧密的排列，主要分支有 膜隔开或没有隔开，由圆柱到棍棒状的细胞构成，直径高达7. 5微米，分枝2到4次，终止于 产孢细胞。产孢细胞是瓶梗产孢的，内壁芽生式(enteroblastic)，透明的，长7-15微米，宽2-3微米，顶端呈圆柱和圆锥形，产孢场所通常带有不明显的圆环。分生孢子(conidia)强烈弯曲成半月状，透明，绝大多数有3个隔膜，偶尔带轻微截去顶端或变平的基细胞，长 15-20微米，宽4-6微米。分生孢子状况非常类似于Cosmosporaauranticola的分生孢子 状态，这在文献中被称为Fusarium Iarvum，真菌通常与介壳虫类和粉虱有关(C. Booth,Ihe Genus Fusarium(Commonwealth Mycological Institute,Kew,United Kingdom 1971) ；Amy Y. Rossman等人,Genera of Bionectriaceae,Hypocreaceae andNectriaceae (Hypocreales Ascomycetes)，在 42 Studies in MycoIory Φ (1999))。测定了真菌菌株MF7022 (ATCC 编号 PAT-7894)和 MF7023 (ATCC 编号 PAT-7895) 的核糖体DNA(rDNA)基因序列，以帮助识别其它真菌，同时用以干预菌株与其它真菌的种 系关系。按照标准的分子生物学程序，菌株MF7022和MF7023的DNA被提取，并用作PCR 反应的样品。28S rDNA的DNA片段被放大和测序，该片段包含此基因的域Dl和D2。两 个菌株的序列是相同的，表明它们是同种的，且可能克隆自相同的种群。获得的序列用 以就类似的核糖体序列查询GenBank数据库。取回的最佳匹配，以及观察到百分比相 似度是Cosmospora flammea(U88103)97 %,镰刀菌类(NRRL25126，AF228357)96 %,镰 刀菌类(NRRL26790AF228359)98 %，镰刀菌类(NRRL26803，AF228360)98 %，和 Fusarium larvarum(NRRL20473,U88107) 100%。持续表现出高序列相似度的均属于肉座菌目。结果证 实，真菌菌株MF7022和MF7023属于肉座菌目，且表明这些菌株与赤壳属类真菌是同种的。发酵稈序真菌菌株MF7022 (ATCC 编号 PAT-7894)和 MF7023 (ATCC 编号 PAT-7895)，识别为 赤壳属类，通常于含水营养培养基中培养，这种培养基包含可同化的碳和氮。例如，培养物 可在浸没的需氧条件(如摇动培养物，浸润培养物等)下生成。发酵过程开始和结束(收 获)时，含水培养基的PH值优选维持在约6-8。需要的pH值可以通过使用缓冲剂来维持， 所述缓冲剂例如吗啉代乙磺酸(MES)，吗啉代丙磺酸(MOPS)和类似物，或通过选择本身具 缓冲特性的营养材料来维持。营养培养基中碳的适当来源包括碳水化合物，如葡萄糖，木糖，半乳糖，甘油，淀 粉，蔗糖，糊精和类似物。可以用到的其它适当碳源包括麦芽糖，鼠李糖，蜜三糖，阿拉伯醣， 甘露糖，琥珀酸钠及类似物。适当的氮源是酵母抽提物，肉汁，蛋白胨，面筋粉，棉籽粉，豆粉和其它蔬菜粗粉 (部分或全部脱脂)，酪蛋白水解物，豆类水解物，酵母水解物，玉米浆，干酵母，麦芽，羽毛 粉，花生粉，酒糟可溶物及其类似物，以及无机和有机氮化合物，例如铵盐(包括硝酸铵，硫 酸铵，磷酸铵等)，尿素，氨基酸及其类似物。碳和氮源可有利地结合使用，不一定按其纯净形式使用；原因是较不纯的材料也 适合使用，这些材料包含痕量的生长因子，维生素和显著量的矿物质营养物。需要时，可以 向培养基中添加无机盐，例如碳酸钠或碳酸钙，磷酸钠或磷酸钾，氯化钠或氯化钾，碘化钠 或碘化钾，镁盐，铜盐，钴盐及其类似物。如有必要，尤其当培养基泡沫过多时，可以添加一 种或多种去沫剂，例如液体石蜡，脂肪油，植物油，矿物油或硅酮。浸没的需氧培养条件，是在大批量生产细胞时，培养细胞的典型方法。对于小规模 的生产，可以采用在烧瓶或瓶子中进行摇动或表面培养。当在大的槽中进行生长时，可能优 选的是使用营养体型的生物以在生产槽中接种，以便避免生产过程中的生长迟缓。因此，理想的方法可能是，首先通过制备用在“倾斜的”或皮氏培养皿中生成的孢子或菌丝接种相对 少量的培养基，并培养所述接种的培养基(也称为“接种培养基”)，从而产生生物的营养接 种体，然后将培养的营养接种体无菌地转移到大的槽中。发酵培养基(其中产生接种体) 通常进行压煮，以在接种之前对培养基进行杀菌消毒。压煮步骤之前，培养基的PH值通常 调整到约6-7。 培养基混合物的搅拌和曝气可以通过多种方式完成。搅拌可以通过以下方式进 行，使用螺旋桨或类似机械搅拌设备，旋转或摇动发酵器，通过各种泵设备，或通过使无菌
空气穿过培养基。发酵进行的条件通常如下，温度约在20°C到30°C (如约在22°C和25°C )，时间约 为14-28天，并且参数可以因发酵条件及规模不同而有所不同。进行发酵时优选的培养/生产介质包括实施例中列举的介质。化合物的离析和表征本发明化合物，也就是式I和II的化合物，其中R1是氢，可作为同分异构化合物 的互变混合物，通过用丙酮稀释和在室温下混合数小时，从任一真菌培养基的液体或固体 发酵中萃取。然后混合物被过滤，且滤出液被浓缩为主要包含式I和II化合物的水溶液， 其中每个R1均是氢。其它适宜的萃取溶剂包括四氢呋喃，甲醇和乙醇。甲乙酮或乙酸乙酯 等不溶混溶剂也是适合的。通过对聚苯乙烯_ 二乙烯苯树脂的吸附/提取，从萃取物中回收来自固体或液体 发酵的产品。然后对洗出液体进一步提纯，提纯通过使用高速逆流色谱进行液_液分配实 施。然后，使用色谱法对产品进一步分离，在某些实施方案中，色谱法可在反相二氧化硅 (包括C8和C18)基树脂上进行。可以对产品化合物进行化学改性，以生成烷基化的化合 物，也就是式I和II的化合物，其中R1是烷基。为从粗发酵提取物中获得式I和II的化合物，优选的吸附/洗脱是利用聚苯乙 烯-二乙烯苯树脂，如HP20和SP207 (Mitsubishi)进行。将包含式I和II化合物的粗提 取物溶解在丙酮和水的混合物中，PH值调整为约3，并吸附到树脂床上。将式I和II的化 合物吸附到这样的树脂上有机溶剂浓度低，水浓度高，并且洗脱是通过使用主要为有机溶 剂(如乙腈或甲醇)的溶液清洗树脂进行。高速逆流色谱还可用以用于从包含式I和II 化合物的乙酸乙酯萃取物中提纯式I和II的化合物。对式I和II化合物最终提纯的优选方法是高速逆流色谱或反相液相色谱法。高 速逆流色谱的溶剂有乙烷，乙酸乙酯，甲醇和水。对于反相色谱法，固定相可以是C8或C18 键合相。优选洗脱剂是水和乙腈或甲醇的缓冲混合物。进行色谱后，通过吸附到聚合疏水 树脂(如HP20或SP207)和带有机溶剂(如乙腈或甲醇)的洗脱液上，自然产品从非挥发 性的缓冲成分中分离出来。式I和II的化合物可通过以下方式回收通过真空浓缩，在浓 缩至水溶液后过滤，或通过在除去乙腈或甲醇后采用冻干法。然后，回收的化合物可以进一步通过红外吸收光谱法，核磁共振波谱法和质谱法 进行表征。接种种子培养物在使用之前，将培养基存放于琼脂塞上，放在含10%甘油的无菌小瓶里，在-80°C 储存。通过将四个琼脂塞无菌地转移到250毫升的三角瓶中接种所述种子培养物，该烧瓶含60毫升组成如下的种子培养基(单位为克/升)玉米浆粉，2. 5番茄酱，40.0;燕麦粉，10.0 ；葡萄糖，10.0和痕量元素溶液，10毫升/升。痕量元素溶液由以下成分构成FeSO4 · 7H20，1. 0 克 / 升;MnSO4 · 4H20,1. 0 克 / 升;CuCl2 · 2H20,0. 25 克 / 升;CaCl2 · 2H20,0. 1 克 / 升;H3BO3. 0. 056 克 / 升；(NH4) 6Mo024 · 4H20，0· 019 克 / 升；ZnSO4 · 7Η20,1. 0 克 / 升;溶解在0. 6Ν HCl 中。种子培养基使用蒸馏水制成。通过添加氢氧化钠，将PH值调整到6. 8，将培养基浸 入250毫升三角瓶中，盖上纤维素塞，然后在121°C压煮20分钟。在发酵烧瓶中培养之前，种子培养物在22°C，在转动摇床(220转/分)上培育五天。实施例1MF7022 的发酵使用蒸馏水制备生产培养基，并将pH值调整到6. 5。赤壳属类(Merck Culture Collection MF7022 (ATCC编号PAT-7894))的培养物在培养基中在22°C生长20天，该培养 基含麦芽糖(75. 0克)，V8 果汁(200毫升)，大豆粉(1. 0克)，L-脯氨酸(3. 0克)，MES 缓冲剂(16. 2克)，和蒸馏水(800毫升)。收获发酵物(1升)后，使用一体积的丙酮进行 整个肉汤的萃取，过滤以除去菌丝体，并浓缩以除去丙酮，得到包含式I和II化合物的混合 物的样品(以下称自然产品I或NPI)，作为异构体形式的平衡混合物。发酵液中NPI的滴 定度通常为1.0-1. 2克/升。在对整个肉汤进行丙酮萃取后，通过使用C18 HPLC分析可以 观察到异构体形式的混合物。自然产品I(NPI)的离析包含异构体形式混合物的萃取物使用CHP20P(MCI)树脂(50毫升)进行分级，利用PH值为3的在IOmM磷酸钾缓冲液中的乙腈梯度进行洗脱。收集活性物质的富含级分 (在基于琼脂的检验(assay)中通过对白色念珠菌的生长抑制来测量)，并用1 1 1 1 比例的己烷乙酸乙酯甲醇水的洗脱/挤出系统(V。= 200毫升，上方相=移动相， 1000转/分，10毫升/分)，通过逆流色谱法(CCC)对一部分此材料进行分级。通过分析 性 HPLC(Waters Symmetry 300，300 A, C18，4. 6x50 毫米，5 微米，0-70 % ACN，在 1 9 ACN IOmM磷酸钾中，pH值3，2毫升/分，25°C )分析来自CCC分级的活性级分，并识别 出负责抗真菌活性的相关成分的混合物。对此样品的进一步色谱(C18HPLC)分离出这些成 分，但10-20小时(室温)的平衡化使得提纯的成分返回到原始的异构体形式混合物。正如HPLC和匪R所分析的，平衡混合物包含两个主要的和两个次要的成分。对这些样品的质 谱仪分析表明，这些成分全部具有相同的分子量，与分子式C23H17NO9 —致。结构解析 为说明自然产品的结构，在_78°C将新制成的醚性(ethereal)重氮甲烷添加至悬 浮在1 1的甲醇乙醚中的NPI的搅拌混合物中。反应进程由HPLC监控。当分析表明 成分的起始混合物耗尽时，添加乙酸(1毫升)以猝灭超量的重氮甲烷，并于真空中浓缩反 应。制备C18 HPLC(ffaters Symmerty C18 300人，19x300毫米，7微米)用于从粗反应混 合物中分离和提纯甲基化成分。正如质谱分析所确定的，与起始自然产品相比，每个甲基化 成分均包含单个额外的甲基。在上述色谱中，化合物A和B的甲基化类似物共同洗脱。这 些化合物可以从化合物C和D的甲基化类似物中分离出来。化合物A和B的单甲基化类似物是从1 1的二氯甲烷甲醇中结晶而出，并且 获得其X射线结构，以确定自然产品的结构。X射线结构是甲基化化合物A和 1共 晶。化合物C和D的甲基化类似物通过核磁共振波谱法确定。甲基化产品和未改性自然产 品的混合物的核磁共振分析完全支持由χ射线分析确定的结构。自然产品的核磁共振数据 指定到每个主要和次要的异构体，所述异构体作为混合物存在于单个样品中。相应的立体 化学显示如下
化合物C (主要)化合物D (次要)化合物A(主要的非对映体(syn))13C NMR(126MHZ, DMSO) δ 25. 3,27. 7,53. 0,54. 8,70. 0,85. 3，101. 1, 106. 5， 108. 5，109. 8，109. 9，118. 7，122. 8，125. 9，130. 7，142. 0，155. 5，159. 5，160. 9，167. 2， 169. 7，179. 8，185. 6 ；1H NMR(499MHZ, DMSO) δ 1. 91 (Μ, 1Η)，2· 13 (Μ, 1Η)，2· 57 (Μ, 1Η)， 2. 82 (Μ, 1Η)，3. 56 (S，3Η)，4. 20 (DT, 1Η)，4. 67 (D, 1H)，4. 70 (D, 1H)，5. 95 (D, 1H)，6. 72 (S, 1H)，7. 34 (Τ, 1H)，7. 65 (D, 1H)，8. 27 (D, 1H)，12. 35 (S, 1H)。
化合物B(次要的非对映体(anti))13C NMR(126MHz, DMS0) δ 23. 8,24. 7,53. 6,54. 7,65. 7,84. 5，100. 6，106. 6，
108.5，109. 9，110. 4，118. 7，122. 9，125. 9，130. 8，142. 0，155. 7，158. 2，158. 8，167. 2， 171. 1，180. 9，185. 5 ；1H NMR (499MHz, DMS0) δ 1. 82 (m, 1H)，1. 95 (m, 1H)，2. 45 (m, 1H)， 2. 74 (m, 1H)，3. 59 (s,3H)，4. 39 (m, 1H)，4. 68 (ob, 1H)，4. 70 (ob, 1H)，5. 97 (ob, 1H)，6. 74 (s, 1H), 7. 40 (t, 1H), 7. 67 (d, 1H) ,8. 32 (d, 1H)，11. 62 (s, 1H)。化合物C(主要的非对映体(syn))13C NMR(126MHz, DMSO) δ 25. 4,28. 0,52. 9,55. 0,70. 2,85. 5，101. 5，106. 9，
109.2，109. 7，110. 4，118. 7，122. 7，126. 0，132. 2，141. 8，155. 6，156. 9，161. 0，167. 3，
169.5，180. 5，184. 6 ；1H NMR (499MHz, DMSO) δ 1. 97 (m, 1H)，2· 17 (m, 1H)，2· 60 (m, 1H)， 2. 85 (m, 1H)，3. 59 (s,3H)，4. 30 (dt, 1H)，4. 55 (d, 1H)，4. 76 (d, 1H)，6. 01 (d, 1H)，6. 67 (s, 1H), 7. 32 (t, 1H), 7. 66 (d, 1H) ,8. 67 (d, 1H)，11. 47 (s, 1H)。化合物D(次要的非对映体(anti))13C NMR(126MHz, DMSO) δ 24. 0,24. 9,53. 6,54. 9,65. 3,84. 9，100. 8，106. 2， 109. 2，109. 8，110. 9，118. 6，123. 0，126. 0，132. 0，142. 0，155. 5，158. 9，158. 9，167. 2，
170.9，181. 9，185. 9 ；1H NMR (499MHz, DMSO) δ 1. 83 (m, 1H)，1. 97 (m, 1H)，2. 43 (m, 1H)， 2. 73 (m, 1H)，3. 65 (s, 3H)，4. 24 (m, 1H)，4. 62 (d, 1H)，4. 68 (d, 1H)，5. 89 (d, 1H)，6. 72 (s, 1H)， 7. 36 (t, 1H)，7. 70 (d, 1H)，8. 63 (d, 1H)，12. 48 (s, 1H)。ESI-FTMS C23H17NO9 ； [M+H]+exp 452. 0976，calc 452. 0982。UV (乙腈)λ max343 (ε =29，400M_1cm_1)，290 ( ε = 15，IOOM-1CnT1)，265 ( ε = 16，200M_1cm_1)，234 ( ε = 28，800M_1cm_1)。IR(薄膜)3475,1750，1611，1579，1500，1455，1431，1364，1348cm_10[ α ]d38. 0° (c = 0. 2，CH2Cl2)。甲基化化合物A 13C NMR(126MHz, DMSO) δ 24. 0,25. 3，52. 7，54. 8，56. 2，69. 8，87. 0，103. 3，107. 4， 107. 5，109. 4，109.8，119. 1，122. 6，125. 9，130.5，141. 1，155. 5，159. 3，160. 1，167. 3， 169. 8，173. 2，184. 8 ；1H NMR (499MHz, DMSO) δ 1. 87 (m, 1H)，2· 06 (m, 1Η)，2· 83 (m, 1Η)， 2. 83 (m, 1Η)，3. 55 (s, 3H)，3. 88 (s, 3H)，4. 15 (m, 1H)，4. 70 (s, 1H)，5. 92 (d, 1H)，6. 68 (s, 1H)， 7. 36 (t, 1H)，7. 66 (d, 1H)，8. 34 (d, 1H)，14. 13 (s, 1H)。ESI-FTMS C24H19NO9 ；exp 466. 1128，calc 466. 1138。甲基化化合物C 13C NMR(126MHz,DMS0) δ 24. 6,25. 5,53. 0,55. 0,56. 0,70. 0,87. 4，103. 0，107. 7， 108. 3，109. 6，109. 9，119. 1，122. 3，125. 8，131. 8，141. 0，155. 6，156. 6，162. 4，167. 4， 169. 6，173. 1,184. 2 ；1H NMR (499MHz, DMSO) δ 2. 00 (m, 1Η)，2· 17 (m, 1Η)，2· 88(m，2H)， 3. 55 (s，3H)，3. 90 (s,3H)，4. 30 (dt, 1H)，4. 55 (d, 1H)，4. 80 (d, 1H)，5. 97 (d, 1H)，6. 60 (s, 1H)，7. 36 (t, 1H)，7. 70 (d, 1H)，8. 68 (d, 1H)，13. 25 (s, 1H)。ESI-FTMS C24H19NO9 ； [M+H]+exp 466. 1129，calc 466. 1138。体外检验_敏感件试骑药物储备液和稀释液对于96 孔培养板(有 1-12 列和 A-H 行)，使用 Thermal-LabSystems MULTIDE0P 分 配器向每孔加入100微升适当的试验培养基(例如RPMI-1640，包含0. 165摩尔浓度的 M0PS+3克/升谷氨酰胺(不含碳酸氢钠)，或RPMI-1640，包含0. 165摩尔浓度的M0PS+3克 /升谷氨酰胺(不含碳酸氢钠)并含3. 2% DMS0，或对于最终浓度为50%浆液的培养板， 2X RPMI-1640，包含0. 33摩尔浓度的M0PS+6克/升谷氨酰胺(不含碳酸氢钠)并含6. 4% DMS0，或含 3. 2% DMSO 的 Cation Adjusted Muller Hilton Broth (CAMHB))。将临床实验 室标准化研究所(CLSI)(原称全国临床实验标准委员会(NCCLS))配方用于计算标准溶液 所需的稀释量。将试验化合物以10毫克/毫升的浓度溶解在DMSO中，并稀释1 78成为 适当的试验培养基，该培养基不含DMSO或含1. 92% DMSO或含5. 12% DMSO0达到的药物浓 度是128微克/毫升，DMSO浓度为3. 2%。对于每行的第一个孔，使用多通道矩阵吸液管，添加100微升化合物库存液(128 微克/毫升)。使用Perkin Elmer CETUSPK()/PETTETM稀释剂或TE。M ，对化合物进行连续双重稀 释(从每行的第一个孔取出100微升放入第二个孔并进行混合，从每行的第二个孔取出100 微升放入第三个孔并进行混合，以次类推)，一直到第11列(第12列是生长对照孔-无药 物)，并将最后的100微升倒掉，得出的化合物浓度为64-0. 06微克/毫升。对于带皮肤真 菌的培养板，最后的100微升被放入第二个板的第一行，并进行连续的双重稀释，得出的化 合物浓度为64-0. 00004微克/毫升。两性霉素B和醋酸卡泊芬净(CANCIDAS )是对照化 合物，制备为在DMSO中10毫克/毫升的储备溶液，并在微量滴定板中制备为上述试验化合 物。酵母接种在酵母的微量肉汤稀释检验中，通过在沙氏葡萄糖琼脂(SDA)进行酵母培养，选 择了微生物假丝酵母类，新型隐球酵母(MY2062)和酿酒酵母(MY2255)，在35-37°C培育 24-48小时，然后选择一个典型的菌落，并将其转移到新鲜的培养板上，在相同条件下进行 培育。从再生长起，选出3到5个菌落并悬浮在5毫升无菌盐水(BBL)中，并使用Dade/ Behring浊度计进行调整，以与0. 5McFarland标物相匹配(优选OD为0. 06到0. 12)。这导致浓度为每毫升1-5χ106菌落形成单位(CFU/毫升)。接种体进一步稀释1 50进入RPMI-1640中，包含0. 165摩尔浓度的MOPS+3克/升谷氨酰胺(不含碳酸氢钠)并含3. 2% DMS0(0. 1毫升加入4.9毫升中)，并进一步在相同培养基中按1 20稀释(3.2毫升1 50 稀释液+60.8毫升1 ^1-1640，包含0. 165摩尔浓度的MOPS+3克/升谷氨酰胺(不含碳酸氢 钠)并含3. 2% DMSO)。然后，先前使用药物进行滴定的检验板，按每孔100微升此培养稀释 液进行接种，所述药物在RPMI-1640中，包含0. 165摩尔浓度的MOPS+3克/升谷氨酰胺(不 含碳酸氢钠)并含3. 2% DMSO0这导致最终生物体浓度为5x IO2到2. 5xl03CFU/毫升，最终 化合物浓度为32到0. 03微克/毫升。此外，白色念珠菌(MY1055)还用经热灭活(55°C下1 小时)的小鼠血清进行了试验，所述血清使用0.22微米GP Express PLUSMiIlipore过滤系 统进行两次过滤。此标准化的悬浮液在小鼠血清中按1 50进行稀释(0. 1毫升加入4. 9 毫升中)，并进一步在小鼠血清中按1 20稀释(3.2毫升1 50稀释液加入60. 8毫升小 鼠血清)。然后，先前使用药物进行滴定的检验板，按每孔100微升此培养稀释液进行接种， 所述药物在2X RPMI-1640中，包含0. 33摩尔浓度的M0PS+6克/升谷氨酰胺(不含碳酸氢 钠)并含6. 4% DMS0。这导致最终生物体浓度为5xl02到2. 5xl03CFU/毫升，最终化合物浓 度为32到0. 03微克/毫升以及50%的小鼠血清。板在35-37°C进行培养，假丝酵母的MIC 在24小时读取，新型隐球酵母的MIC在48小时读取。不同的细胞计数是对0. 5McFarland 样品做出的，以验证CFU/mL。1 100的稀释是使用无菌生理盐水，加0. 5McFarland (0. 1毫 升+9. 9毫升盐水)进行的。然后进行三次10倍稀释(0. 5毫升+4. 5毫升盐水)。每种稀 释剂各取100微升(104，105，106)，涂在沙氏葡萄糖琼脂(SDA)板上，然后在35°C培育24-48 小时。培育后，对菌落计数并予以记录，还进行了每种生物的生长和无菌对照。第12列是 生长对照，且不包含药物。H行未使用生物或药物进行培育，被用作无菌对照。所有化合物的最小抑制浓度(MIC-100)确定为与没用药物的生长对照相比，在其 下没有明显生长的化合物的最低浓度。生长的最小显著抑制(MIC-80)表明与没用药物的 生长对照相比，对生长抑制80%。对于曲霉属真菌和皮霉癣菌须毛癣菌，将最小有效浓度 (MEC)(菌丝的形态用肉眼和显微镜均可看到)记录下来。在24小时培育时记录所有念珠 菌的MIC，在20小时时记录细菌的MIC，在48小时时记录隐球菌和曲霉属的MIC，和在96小 时时记录皮霉菌的MIC。评估自然产品I (如实施例1中分离的)的抗真菌活性。对以下菌株的自然产品 I的MIC进行了观察^t I態MIC-100 (MIC-80)(微克 / 毫升)白色念珠菌0. 125( < 0.03)微克/毫升白色念珠菌4 (0. 5)微克/毫升(在50%小鼠血清存在下)光滑念珠菌32(16-32)微克/毫升葡萄牙念珠菌4 (0. 25-0. 5)微克/毫升近平滑念珠菌8-16 (2-4)微克/毫升克鲁斯氏念珠菌0. 125-0. 25( < 0. 03)微克/毫升热带念珠菌2(1)微克/毫升
酿酒酵母菌32(16)微克/毫升实施例2
搬· - &應咨·Φ隱廳細■牛将1. 8%沙氏葡萄糖琼脂(12毫升)在55°C平衡化，接种1-5χ106/毫升的烟曲霉 MF5668孢子，添加到12x8厘米Omnidish且使其固化。将自然产品I (2微升，1-2毫克/毫 升DMS0)的溶液施用于琼脂表面，板在37°C培育16小时。观察到熏烟色曲霉菌的自然产品 I的抑制活性。实施例3gfe^-FT'g^ (ΤΟΚΑ)- i平寸白个效力使用的是重20克的DBA/2雌性小鼠(Taconic)。小鼠的此天生菌株对补体成分5 具有先天免疫缺陷。使用了白色念珠菌MY1055 (Merck Culture Collection)，人类临床病 因分离物，最初从Williamsburg Community Hospital,Williamsburg,VA.，(MCV#7. 270)获 得。过夜沙氏葡萄糖琼脂(SDA)培养物的生长是悬浮在无菌盐水中，细胞浓度是通过血球 计确定的。将白色念珠菌MY1055的细胞悬液调整到1. 50x10s细胞/毫升，调整是通过在 无菌生理盐水中稀释进行的。当0. 2毫升的此种细胞悬液静脉内施用于小鼠尾静脉时，最 终接种体是3. OxlO4细胞/小鼠(约一个14天LD5tl)。在激发(challenge)后，小鼠在15分钟内接受治疗，时间为总计两天。用腹腔内 (I. P.)方法施加自然产品I，一日两次，试验剂量为50，25及12. 5毫克/公斤。念珠菌种 类的目标器官检验监控在接受激发后配对肾的每克菌落形成单位(CFU)的数量(目标器官 肾检验，Τ0ΚΑ)。配对肾使用无菌技术从实施安乐死的小鼠(4个/组)中取出，称重并放在 无菌的Whirl Pak袋(Fisher Scientific)内，该袋含有5毫升无菌盐水。肾在袋内均质 化，在盐水中连续稀释，并将等分试样放在SDA上。板在35°C培育，在48小时后计算生物体 的数目。将接受治疗组的肾中的平均IogltlCFU/克与假治疗小鼠的肾的此种记录相比较。对于自然产品I，观察到从假治疗减少的计数为50mpk(2.30，2.881og)， 25mpk(2. 11，1. 861og)和 12. 5mpk(l. 00，1. 721og)。
权利要求
提纯的组合物，其包括一种或多种化合物，该化合成物选自式I和II的化合物及其制药或农业上可接受的盐其中R1选自氢和C1-C6烷基。FPA00001099100200011.tif
2.根据权利要求1的组合物，其中R1是氢。
3.根据权利要求2的组合物，其中所述组合物是式I和II的天然存在的化合物及其在 制药上或农业上可接受的盐的混合物。
4.化合物，其选自式I和II的化合物及其制药或农业上可接受的盐 其中R1选自氢和C1-C6烷基。
5.根据权利要求4的化合物，其中R1是氢。
6.药物组合物，其包括根据权利要求4的一种或多种化合物，以及制药上可接受的载体。
7.药物组合物，其包括根据权利要求4的一种或多种化合物与第二种治疗剂或该第二 种治疗剂的制药上可接受的盐的组合。
8.根据权利要求7的药物组合物，其中所述第二种治疗剂是选自以下物质的化合物 唑类；多烯类；嘌呤或嘧啶核苷酸抑制剂；复合碳水化合物抗真菌剂，纽莫康定衍生物和棘 白菌素衍生物；多氧菌素；甘露聚糖抑制剂；杀菌性/渗透性诱导蛋白质产品；延伸因子抑 制剂；和免疫调节剂。
9.根据权利要求7的药物组合物，其中所述第二种治疗剂是选自于伊曲康唑，氟胞嘧 啶，氟康唑，两性霉素B和卡泊芬净的化合物。
10.农用化学品组合物，其包括根据权利要求4的一种或多种化合物，以及农业上可接 受的载体。
11.农用化学品组合物，其包括根据权利要求4的一种或多种化合物，以及第二种活性 成分，该第二种活性成分选自于除草剂，杀虫剂，杀菌剂，杀线虫剂，杀螺剂，生长调节剂，微量营养物，肥料和杀真菌剂。
12.治疗或预防哺乳动物真菌感染的方法，该方法包括对哺乳动物施用治疗有效量的 根据权利要求4的一种或多种化合物。
13.治疗或预防哺乳动物真菌感染的方法，该方法包括对哺乳动物施用治疗有效量的 根据权利要求4的一种或多种化合物，以及第二种治疗剂或该第二种治疗剂的制药上可接 受的盐；其中该第二种治疗剂是选自以下物质的化合物唑类；多烯类；嘌呤嘧啶核苷酸抑制 剂；纽莫康定衍生物；棘白菌素衍生物；多氧菌素；甘露聚糖抑制剂；杀菌性/渗透性诱导 蛋白质产品；延伸因子抑制剂；和免疫调节剂。
14.控制植物致病真菌的方法，该方法包括向需要此控制的植物施用治疗有效量的权 利要求4的一种或多种化合物。
15.控制植物致病真菌的方法，该方法包括向需要此控制的植物施用治疗有效量的根 据权利要求4的一种或多种化合物，以及第二种活性成分，该第二种活性成分选自除草剂， 杀虫剂，杀菌剂，杀线虫剂，杀螺剂，生长调节剂，微量营养物，肥料和杀真菌剂。
16.以ATCC编号PAT-7894保藏在American Type CultureCollection 的赤壳属类(肉 座菌目)的生物学意义上的纯培养物。
17.制备根据权利要求2的组合物的方法，包括培养和发酵赤壳属类，ATCC编号 PAT-7894的培养物。
18.以ATCC编号PAT-7895保藏在American Type CultureCollection 的赤壳属类(肉 座菌目)的生物学意义上的纯培养物。
19.制备权利要求2的组合物的方法，包括培养和发酵赤壳属类，ATCC编号PAT-7895 的培养物。
全文摘要
新的异噁唑烷酮化合物可用于治疗和/或预防人类和动物真菌感染方面，同时可用于控制上述农作物的植物致病真菌。本发明披露了两种新的真菌菌株(ATCC编号PAT-7894和ATCC编号PAT-7895)，用以制备所述的异噁唑烷酮化合物。
文档编号A01N43/80GK101868149SQ200880111783
公开日2010年10月20日 申请日期2008年8月12日 优先权日2007年8月16日
发明者C·A·帕里什, F·佩莱斯, G·F·比尔斯, G·普拉塔斯, J·科拉多, T·勒默 申请人:默沙东公司;默沙东西班牙股份有限公司;默克弗罗斯特加拿大有限公司