专利名称：：防治蔬菜土传病害的复合生防菌剂ps合剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及防治蔬菜土传病害的复合生防菌剂，属于农作物防病治病
技术领域：
，专用于多种蔬菜土传病害的无公害防治。二
背景技术：
：植物土传病害的病原物多为土壤习居菌，如引起茄科作物青枯病的青枯劳尔氏菌ia/Wom'aso/wxacearaOT,弓l起多禾中植物枯、黄萎病的尖孢镰刀菌Fraan'ww。ww/ww，大丽轮枝菌d"/z/ae/，以及近年来在各地危害越来越严重的根结线虫Me/o/cfogy脱spp.等。茄科作物青枯病属世界性病害，病原细菌可侵染50多科200多种植物，全球范围内造成的经济损失多达120亿美元；辣椒疫霉P/^o;/z"&orac/n7/在我国蔬菜生产上常年造成巨大损失；根结线虫(Me/o/c/ogy"espp.)侵染保护地蔬菜，致使寄主常年减产15-25%，有时达70%以上，严重地制约了蔬菜的生产和出口创汇。而生产上，这些病害往往同时发生，如番茄大棚中根结线虫、细菌性青枯和真菌性枯黄萎常同时发生，形成复合侵染，造成的损失非常严重。这些土传病害都有寄主范围广、抗逆性强、难以根除等特点，对复合侵染防治尤其困难。生产中往往既缺乏优良的抗病品种，又缺乏有效的化学防治药剂。而过多施用化学农药会带来一系列生态和社会问题，如病虫草产生的抗性，对非靶标生物的直接危害，对土壤、水、大气的污染，生物富集作用对人健康的影响，国际贸易对农药残留农产品的限制等。早在1992年世界环境与发展大会就要求"在全球范围内控制化学农药的销售和使用"，不能过分依赖化学农药已成为人类的共识。随着经济的发展，人们生活水平的提高，人们越来越注重食品安全问题，绿色蔬菜、有机农产品等也越来越受人青睐。无公害蔬菜早己成为世界蔬菜生产的主流。我国无公害蔬菜的研究和生产始于1982年，该年召开全国生物防治会议，江苏省率先提出用生物防治代替化学农药防治。1983年，在全国植保总站的大力支持下，全国23个省、市开展了无公害蔬菜的研究、示范与推广工作。社会对安全、健康食品的需求促进了利用无公害方法来控制有害生物的研究。生防菌株通过空间位点竞争和营养的竞争，直接分泌胞外酶降解作用，产生抗生素抑制病原，诱导植物产生抗病性等机制，既可以减少化学农药使用带来的环境污染，提高农产品的价值，又可以改善土壤微生态环境，压低有害生物的种群数量，利于农作物的可持续生产，为我国无公害绿色蔬菜的生产提供有力保障。通过几年的研究实践，人们探索出一套综合防治病虫害、减少农药污染的无公害蔬菜生产术，也开发了一些生物杀菌剂，如农用链霉素、井岗霉素，前者可以配成200mg/L液灌根防治蔬菜软腐病、青枯病，后者配成1000-1500倍液防治蔬菜炭疽病、霜霉病。但目前尚未有能同时防治多种土传病害的生防制剂产品。现有技术中按照本实验室的菌体保藏液专利(公开专利号CN1358838，公开日2002年7月17日)方法，菌体可室温保存23年。三
发明内容技术问题本发明的目的是针对当前防治植物土传病害使用的化学农药污染严重、使用成本过高的缺陷，且对蔬菜多种土传病害混发没有较高防效的生防菌制剂现状，开发一种防治蔬菜多种土传病害的复合菌剂，专用于防治蔬菜青枯病、疫病、根结线虫病等，菌剂的防效高，并且有增产功能。技术方案本发明为一种防治多种蔬菜土传病害的复合生防菌剂PS合剂，含两种细菌成分PX35和SM21。PX35和SM21，两个菌株均为芽孢杆菌属(5ac/〃iwspp.)，均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，PX35菌种保藏号为CGMCCNO.1930，SM21菌种保藏号分别为CGMCCN0.2058。该生防制剂的制备方法为1)同时将两菌分别接种到PM培养液中，37t:i80rpm下培养24小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零；2)将两菌培养至OD值均在O.1—1之间时，开始混菌取0D值最大的菌1毫升，则另一个菌的量(ml)=最大0D值X该菌与最大0D值菌的配比值/该菌的0D值；3)将两菌混合后加到250mlPDA培养液中30°C180rpm摇36小时，然后4000g离心，每1000ml培养液获得13—16g湿菌，每克湿菌含4X1(T—10'5个菌体。4)取湿菌与菌体保藏液按l:40(g/ml)配成菌剂，再按l:l比例混匀。即得复合生防菌剂PS合剂，成品中活菌总浓度为lX109—lX1014Cfu/ml，用于防治蔬菜土传病害。菌体保藏液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液，还含有浓度为0.001mol/L的Tween20(非离子型表面活性剂)。其中所用PDA培养液配制方法为用200克土豆削皮后切成小块放入水中，沸腾后至少煮20分钟以上，用四层医用纱布过滤，滤液加20克普通蔗糖，定容至1000毫升，PH值调至7.2-7.4，然后12rC15个大气压灭菌20分钟。有益效果本发明的优点和积极效果表现在本发明是专门针对蔬菜土传病害混合发生而开发的生防制剂，在防治蔬菜土传病害方面与目前其他抗菌谱单一的生物杀菌剂相比防治效果显著提高。由于是生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于蔬菜的无公害生产，农民可以不用或减少化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于蔬菜的出口。同时，该菌剂还有增产功能，可为农民增加收入。该菌剂用湿菌与菌体保藏液按1:40(g/ml)配成菌剂，可室温保存23年。菌体保藏液为0.Olmol/L磷酸盐缓冲液，还含有非离子型表面活性剂浓度为0.001mol/L的Tween20。该菌剂可以在温室移栽前倒入有机肥中制成堆肥或于移栽前喷在有有机肥的田块，然后随肥料在整地过程中埋到土里，也可以在移栽时灌根使用。栽苗后，制剂通过多种生防机制起作用，从而达到防治青枯病土传病害的效果。试验表明，在温室中使用PS复合菌剂对不同土传病害(主要是青枯、疫病和根结线虫)均有防治效果(58~77%不等)且其促生作用也能达到50%以上，均要优于单剂和化学药剂；田间施用PS复合菌剂对混合发生的两或三种土传病害防效达60%86%，病田增产53%81%。四具体实施例方式PS复合菌剂制备一种防治蔬菜土传病害的复合菌剂，成分为菌株PX35和SM21，两个菌株均为芽孢杆菌属(5^///^spp.)，均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。PX35菌种保藏号为CGMCCNO.1930，保藏日期2007年1月26日；SM21菌种保藏号为CGMCCNO.2058,保藏日期2007年5月24日。该菌剂采用常规细菌培养法获得，用PDA培养液30°C180rpm摇36小时，然后4000g离心，每1000ml培养液获得13—16g湿菌，每克湿菌含4X101()—1015个菌体。取湿菌与菌体保藏液按l:40(g/ml)配成菌剂，成品中活菌总浓度为1X109—1X1014cfu/ml。菌体保藏液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液(称取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HP04和0.24gKH2P04,溶于800ml蒸馏水中，用HC1调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。在151bf/in2(1034xl05Pa)高压下蒸气灭菌至少20分钟，保存存于室温或4。C冰箱中)，还含有浓度为0.001mol/L的Tween20(非离子型表面活性剂)。将菌接种到PDA培养液中分别培养3(TC180rpm，约24小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的0D值，测定过程中以未接菌的培养液来调零。当有0D值不在0.1一l之间时将各菌继续培养，每隔3小时测一次，直到各OD值均在此范围内。实施效果(一)温室试验辣椒种子播种于育苗盘中，播种后21d进行移栽，每盆1株，每处理共24株盆栽辣椒，3次重复。栽培土为育苗基质(淮安柴米河基质肥有限公司生产)，无任何病原。移栽辣椒苗的同时每盆浇108CFU/ml的菌液40ml，温室条件为28-32。C，40%湿度，自然光照。1、对辣椒青枯病的温室防治试验辣椒苗移栽36h后按2x105CFU/g土的浓度浇4xl05CFU/ml青枯菌JS55的菌液(实际每盆80g土，浇4xl05CFU/ml的青枯病菌JS55的菌液40ml);对照1先用清水处理，后浇青枯菌液；对照2用50ml/株的200ppm的农用链霉素(产自华北制药公司，石家庄)处理，36h后浇青枯菌菌液，浓度同上。辣椒移栽35d后统计病害严重度与防效。青枯病病情指数(diseaseindex)0-4级分级依据KempeandSequeira(1983)。青枯病病害严重度[DiseaseseverityofRalstoniawilt(DSR)]=[Z(各病级株数x青枯病各病情指数y(调査总株数x青枯病最高病情指数)]xioo%2、对辣椒疫病的温室防治试验辣椒苗移栽3d后按每盆2><105孢子的量浇40ml的5xl03CFU/ml的疫霉菌孢子悬浮液；对照1在移栽时用清水处理，3d后浇同样量的疫霉菌孢子悬浮液；对照2用40ml58。/。的甲霜灵锰锌可湿性粉剂(产自宝应化工厂，江苏宝应)600倍液处理，3d后浇疫霉菌孢子悬浮液，用量同上。辣椒移栽7d后重复处理l次。移栽35d后统计病害严重度与防效。辣椒疫病病情指数(diseaseindex)0-5级分级依据Rajkumaretal(2005)。疫病病害严重度[DiseaseseverityofPhytophthomblight(DSP)]=[Z(各病级株数x疫病各病情指数y(调査总株数x疫病最高病情指数)]xioo%3、对根结线虫病的温室防治试验辣椒苗移栽48h后按每盆2000条2龄幼虫接种；对照l在移栽时用清水处理，48h后接种线虫，浓度同上；对照2按100ml/株的用量用2000倍的1.8。/。阿维菌素(产自华北制药公司，石家庄)处理，48h后接种线虫，浓度同上。10d后重复处理l次。移栽55d后统计病害严重度与防效。根结线虫病情指数依据(diseaseindex)Daulton和Nusbaum(1961)的10级标准分类。根结线虫病害严重度[DiseaseseverityofMeloidegyneroot-knot(dsm)]=[2X各病级株数x根结线虫各病情指数y(调査总株数x根结线虫最高病情指数)]xlOO%4、促生效果实验200各拮抗菌菌悬液浓度均为108CFU/ml。每处理种植于一个50孔育苗穴盘(规格为4.8x4.8x6.0cm)中，每处理3次重复，计150株苗。栽培土为育苗基质(淮安柴米河基质肥有限公司生产)，无任何病原。温室条件为28-32°C，40%湿度，自然光照。辣椒播种后立即按每穴10ml的量浇拮抗菌菌液，对照浇10ml清水。35d后统计地上部鲜重与根重。总鲜重=根鲜重+地上部鲜重促生效果=[(处理平均鲜重-对照平均鲜重)/对照平均鲜重]><100%试验结果用SPSS13.0软件统计结果，计算平均值与标准差；作单因素方差分析，经Doncan(户=0.05)检验差异显著与否。温室实验表明，PS合剂在温室内对青枯病防效为67.40%(表l)，对辣椒疫病的防效达77.32%(表2)，对根结线虫防效也能达到58.59%(表3);对植株的促生作用明显，辣椒苗的鲜重增加52.80%(表4)。表lPS复合菌剂对辣椒细菌性青枯病防治作用温室实验<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>—*Control1:用农用链霉素200ppm灌根.**Control2:清水处理表2PS复合菌剂对辣椒疫病防治作用温室实验<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>Control2**89.31±l,01a*Control:阿维菌素50ppm灌根两次，间隔10天."Control2:清水对照表4PS复合菌剂对辣椒促生作用温室实验处理鲜重(g)鲜重增加(％)PX35+SM213.287±0.11c52,90PX352.910±0.17b35,36SM212.798±0.03b30.14Control1*2.150士0.14a—-*Control1:清水对照(二)田间试验PS复合菌剂在2007、2008年在江苏淮安和河北藁城进行田间多种土传病害防效试验示范。在作物移栽前喷雾使用，也可以做成堆肥使用，或稀释后在移栽时灌根使用。病害调査与温室试验相同。总病害严重度=青枯病病害严重度+疫病病害严重度+根结线虫病害严重度防治效果=[(总对照组病害严重度-总处理组病害严重度)/总对照组病害严重度]xl00%增产效果=[(各处理组平均产量一对照平均产量)/对照平均产量]xioo%田间实验结果表明，PS合剂对多种土传病害复合侵染的田块起到了很好地抗病增产效果。两年两地的结果显示，在河北藁城对春季辣椒混合病害(疫病和根结线虫)防效达61.77%，同时产量增加55%(表5)，在秋季辣椒上对两种病害防效为77.07%，产量增加79.15%(表6)，明显优于化学农药和单剂的防效。在江苏淮安，对春季辣椒混合病害(青枯、疫病和根结线虫)的防效是67.33%，产量增加54%(表7);秋季对以上三种病害的防效为86.27%，防效稳定，产量平均增加81.39%(表8)，大大优于单剂和化学农药组合。表52007年秋季PS合剂及化学农药对河北藁城辣椒产量及土传病害防效的影响处理产量(Kg/plot)增产率(％)混合病害发病率(％)防效(％)PX35+SM2121,02土1.98c55.377.40土1.66c61.77PX3519.46士l,79bc43.848.97士1.99c53.65SM2118.32士2.32b35.3910.02士2.84bc48.24甲霜灵猛锌+阿维菌素17.22士2.04b27,2611.98土2.43b38.12对照13.53土1.98a—19.36士255a—表62008年春季PS合剂及化学农药对河北藁城辣椒产量及土传病害防效的影响处理产量(Kg/plot)增产率(％)混合病害发病率(％)防效(％)PX35+SM2120.37士2.64c79.156.13土2.14d77.07PX3516.98士2.33bc49.3810.67士1.95c60.09SM2115.91士2.58b39.9711,95土2.58c55.30甲霜灵锰锌+阿维菌素15.26±2.58b34.2015.39士2,45b42.46对照11.37士2.91a——26.74土2.59a—-表72007年秋季PS合剂及化学农药对江苏淮安辣椒产量及土传病害防效的影响处理产量(Kg/plot)增产率C5/。)混合病害发病率(％)防效(％)PX35+SM2122.07士2.13d53.476.06士1.48c67.33PX3520.22士1.69c40.618.52士1.81bc54.07SM2119.07土1.69bc32.599.65士2.43bc47，94农用链霉素+甲霜灵锰锌+阿维菌素17.95士2.69b24.8311.46士1.64b38.19对照14.38士2.40a——18.54士2.94a—表82008年春季PS合剂及化学农药对江苏淮安辣椒产量及土传病害防效的影响处理产量(Kg/plot)增产率(％)混合病害发病率(％)防效(％)PX35+SM2122.98土1.79d81.393.39±2.33d86.27PX3520.64士2.04c62.898.41士1.78c65.92SM2119.06士1.98c50.4110.39土2.33bc57.90农用链霉素+甲霜灵锰锌+阿维菌素16.81士2.43b32.7013,85士2.72b43.92对照12.67士2.83a—-24.69±3.80a——数据用SPSS统计软件在LSDtest(尸=0.05)水平上检测差异显著性.所有处理都是4次重复，表中数据取4次重复的平均值和标准偏差权利要求1、一种防治多种蔬菜土传病害的复合生防菌剂PS合剂，含两种细菌成分PX35和SM21，两个菌株均为芽孢杆菌属(Bacillusspp.)，均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，PX35菌种保藏号为CGMCCNO.1930，保藏日期2007年1月26日；SM21菌种保藏号为CGMCCNO.2058，保藏日期2007年5月24日。2、权利要求1所述的一种防治多种蔬菜土传病害的复合生防菌剂PS合剂的制备方法，其特征在于，1)分别将权利要求1所述两菌株接种到PDA培养液中分别培养37。C180rpm，16_20小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零；所用PDA培养液配制方法为用200克土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后至少煮20分钟以上，接着用四层医用纱布过滤，滤液加20克普通蔗糖，定容至1000毫升，pH值调至7.2-7.4，然后121。C灭菌20分钟；2)当培养至0D值在0.5—0.8之间时，将种子菌液以l:IOO体积比加入PDA培养液中，30°C180rpm振荡培养20—24小时，然后4000g离心10min，每1000ml培养液获得13—16g湿菌，每克湿菌含4X10"—10"个菌体；3)分别取湿菌与菌体保藏液按1g:40ml配成菌剂，菌体保藏液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液，还含有浓度为0.001mol/L的Tween20;再将权利要求1所述两菌株菌剂按体积比l:l混合均匀，得复合生防菌剂PS合剂，成品中活菌总浓度为1X109—1X1012cfu/ml，3、权利要求1或2所述一种防治多种蔬菜土传病害的复合生防菌剂PS合剂在防治温室及大田蔬菜青枯病、疫病、和根结线虫土传病害方面的应用。全文摘要一种防治多种蔬菜土传病害的生防复合菌剂PS合剂，属于农作物防病治病
技术领域：
。PS复合菌剂由两种生防细菌组成，分别是PX35和SM21。两种细菌分别在PDA培养液37℃180rpm振荡培养20～24小时，然后4000g离心10min，取湿菌菌体保藏液按1∶40配成菌剂，再按1∶1比例混匀，成品中活菌总浓度为1×10<sup>9</sup>～1×10<sup>12</sup>cfu/ml。在温室条件下，PS合剂对茄科作物青枯病防效为67.40％，对茄科作物疫病防效为77％以上，对蔬菜根结线虫病的防效为58.59％，促生作用明显；在田间，防效稳定，增产可达50％～80％；同时还可以改善土壤板结现象。文档编号A01P5/00GK101595892SQ20091002686公开日2009年12月9日申请日期2009年5月27日优先权日2009年5月27日发明者徐刘平,李师默,薛庆云,郭坚华申请人:南京农业大学