专利名称：一种调节时差反应的新方法
技术领域：
本发明涉及到生理学及神经生物学领域。具体地说，本发明通过抑制Magedl分子 的活性来达到减轻时差反应，使生物体快速适应新的昼夜光照环境的目的。
背景技术：
随着现代社会生活节奏的加快，及新的交通工具的发明，人们延续了几千年的生 活方式正在发生着根本性的改变。现代的生活方式对人们生理健康的影响也逐渐显现。在人们的各种生理过程中，近日节律(即人们通常所说的生物钟)所受的冲击及 其所产生的后果尤为突出。近日节律是指生物体内自发维持的、周期接近24小时的生物节 律。它对生物体适应并预期周围环境的昼夜变化起着重要作用，并且协调着体内其他生理 过程。但是在现代社会的很多方面，昼夜节律与新的作息方式的相互冲突正在越来越明显 的困扰着人们。飞机的发明将环绕地球的时间从几个月甚至一年缩短到了两天，使得人们 短时间内穿梭于各个国家交流、活动成为了可能，但也带来了之前从未有过的时差反应。很 多工厂所采用的24小时三班倒的工作制度大大提高了工厂的生产效率，但也带来很多新 的问题，如夜班事故多发，长期从事这样工作的人身体严重受损等等。因此，研究解决如何 有效的调控昼夜节律，使其更好的服务于人们，已成为一个日趋重要的课题。
发明内容
发明目的本发明希望通过遗传学与分子生物学手段来发展一种新的可以有效调节生物钟 的方法，使得在模拟的调时差反应中，生物体可以更快的适应新的日照环境。发明概述本发明发展了一套通过抑制Magedl分子的活性，从而减小生物体内核心生物钟 振荡幅度，达到更快速的调节生物钟的目的。并在模拟的调时差反应中展示了这一方法具 有良好的效果。抑制Magedl分子的活性通过构建Magedl敲除小鼠实现，并通过分子生物 学手段在体内验证了生物钟核心分子振幅明显下降。对所构建模型在调时差反映中的表现 我们通过小鼠跑轮实验证实。
图1为Magedl敲除小鼠的基因打靶载体策略、DNA基因型鉴定及蛋白确认结果。 a，基因打靶载体构建策略；b，PCR鉴定得到的阳性克隆，左图为5’端，右图为3’端结果；c， western结果，确认Magedl已敲除。图2为Magedl敲除小鼠体内核心生物钟分子Bmall的变化情况。图3为一对代表性的Magedl敲除小鼠与野生型对照在近日节律周期测定过程中 的活动。图4为一对代表性的Magedl敲除小鼠与野生型对照在模拟的调时差反映中的活动情况。
具体实施例方式1. Magedl敲除小鼠的构建我们首先在基因打靶载体上用PGK-Neo替换Magedl外显子3_8部分，随后将改造 好的载体线形化，电转到小鼠的ES细胞中使之与ES细胞内的等位基因发生重组，用PCR和 Southern鉴定阳性克隆，然后将阳性克隆注射到假孕母鼠的囊胚中，获得嵌合鼠。将嵌合鼠 回交到C57/BL6J 10代以上进行下面的分子生物学实验及表性分析。具体敲除策略及基因 型鉴定、蛋白验证结果见图1。2. Magedl体内生物钟核心分子组件振幅下降的验证全身敲除Magedl的小鼠生长正常。我们将同窝出生的Magedl敲除与野生型对照 置于12小时光照12小时黑暗的环境中牵引一周，然后将光照条件改为持续黑暗，在持续黑 暗的第二天早8点至第三天早8点每隔4小时采集一次敲除小鼠与野生型对照的肝、肺样 本，用于提取RNA及蛋白。将连续7个时间点的样本用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取肝的总RNA，测 定OD并校正后用SuperScriptIII (Invitrogen公司)逆转录得到cDNA。将得到cDNA进行 荧光定量PCR反应，检测小鼠体内生物钟核心分子含量，并通过β-Actin进行校正。结果 见图2。图中可以明显看到，Bmall分子的表达量明显下降，峰谷值的差也大大减小。这表 明，在Magedl的敲除小鼠中，核心时钟基因的振幅是明显下降的。值得注意的是Bmall与 另一时钟蛋白CLOCK形成的复合体负责了多个时钟基因的转录。这暗示整个生物钟的稳定 性在缺乏Magedl时都受到减弱。3. Magedl敲除小鼠的昼夜节律周期变短，时差调节加快我们将Magedl敲除小鼠与同窝的野生对照置于带有轮子的饲养笼中，用计算机 记录小鼠的活动节律性。在最初的一周中，我们给小鼠12小时光照12小时黑暗的正常光照 条件对小鼠进行牵引，并让其适应跑轮环境，然后我们将小鼠完全黑暗的环境中，记录小鼠 的昼夜节律3个星期，对结果进行分析(见图3)。结果表明，相比于野生型的23. 72士0. 16 小时，Magedl敲除的小鼠近日节律周期明显变短，为23. 16士0. 19小时。同时，我们对两组小鼠进行了模拟调时差反应实验。在最初的一周中，我们将小鼠 置于每天早8点开灯，晚8点关灯的环境中牵引，并让其适应跑轮环境，然后我们将开灯时 间与关灯时间均提前4小时，也即模拟了人们乘飞机向东飞行4个时区的事件。记录的小 鼠活动表明，Magedl敲除小鼠2-3天内即可适应新的光照环境，而野生小鼠则要一周的时 间(见图4)。这说明Magedl敲除小鼠在模拟的调时差事件中反应明显更加快。
权利要求
黑色素瘤抗原家族蛋白，D，1(Melanoma Antigen，Family D，1，简称Maged1)作为一个新的调节哺乳动物昼夜节律的基因，其特征在于在Maged1敲除出的小鼠中，其昼夜节律周期变短；并且在模拟的时差反应中，对新光照条件的适应要快于野生型小鼠。
2.根据权利要求1所述的Magedl的特征，调节Magedl的表达作为一个新的治疗时差 反应的方法。Magedl作为一个新的治疗时差反应药物的靶点。
全文摘要
本发明公开了一种新的调节哺乳动物时差反应的方法，涉及到一种新的调节哺乳动物昼夜节律的蛋白Maged1，它对维持正常的生物钟功能起着重要作用。在Maged1敲出的小鼠中，核心生物钟分子振幅变小，其昼夜周期变短，在模拟的时差反应中调节速度加快。Maged1可作为治疗人的时差反应的一个药物靶点。
文档编号A01K67/027GK101899494SQ20091002730
公开日2010年12月1日 申请日期2009年5月27日 优先权日2009年5月27日
发明者唐晶, 徐璎, 王晓翰, 谷习文, 高翔 申请人:南京大学