专利名称：一种棉毛鹿茸草的离体培养法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种绵毛鹿茸草的离体培养方法。
背景技术：
绵毛鹿茸草属玄参科鹿茸草属，具有清热解毒、祛风行气、凉血止血、祛痰等功效， 用于治疗感冒、慢性气管炎、肺炎等，药用价值很高；其分布于江苏、浙江一带，目前国 内还没有实现人工栽培，因此野生的绵毛鹿茸草的数量越来越少。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种棉毛鹿茸草的离体培养方法，采用该方法能获 得大量的绵毛鹿茸草的种苗。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种棉毛鹿茸草的离体培养法，依次包括以下步
骤
1) 、取无病斑、生长健壮的绵毛鹿茸草嫩芽进行流水冲洗；
2) 、将上述流水冲洗后的嫩芽经常规消毒，然后切成0.8 1.2cm长的小段嫩芽I ，将 上述小段嫩芽I接种到诱导不定芽培养基上进行培养；培养条件为16小时光照，光照强 度10 30 ^imol n^.s",温度为26 28t:; 8小时暗培养，温度为20 22。C;上述光照和暗 培养交替进行；
3) 、待小段嫩芽I上长出的不定芽长至2.0 5.0cm高的小苗I时，割取小苗I ;将此 小苗I切成0.8 1.2cm长的小段嫩芽n，将上述小段嫩芽II接种到增殖培养基上进行培养；
培养条件为16小时光照，光照强度10 30pmoln^.s"，温度为26 28。C; 8小时暗培养，
温度为20 22'C;上述光照和暗培养交替进行；
4) 、待小段嫩芽n上长出的不定芽长至2.0 5.0cm高的小苗时H，割取小苗II;将此 小苗11切成0.8 1.2011长的小段嫩芽111，将上述小段嫩芽III接种到增殖培养基上进行培养;
培养条件为16小时光照，光照强度10 30^11101111-2;1，温度为26 28'C; 8小时暗培养，温度为20 22"C;上述光照和暗培养交替进行；
5) 、待小段嫩芽m上长出的不定芽长至3.o 5.ocm高的小苗m时，割取小苗in;将此 小苗m接种到生根培养基中；
6) 、待上述小苗III长出大于2cm的至少3条根时，得可出瓶种植的种苗。 作为本发明的棉毛鹿茸草的离体培养法的改进步骤2)中的诱导不定芽培养基为-
MS基本培养基十BA0.5~1.0 mg/1 +糖2 0~30 g/1 +琼脂5 ~9 g/1， pH为5.5 6.0。
诱导不定芽培养基的制作方法具体如下以MS基本培养基作为基础，分别加入6-苄基
腺嘌呤(BA)、糖和琼脂，均匀混合，利用lmol/L的KOH或lmol/L的HCl调节pH为5.5 6.0;
每1L的MS基本培养基中加0.5 1.0 mg BA、 20 30g糖和5 9g琼脂。
作为本发明的棉毛鹿茸草的离体培养法的进一步改进步骤3)和步骤4)中的增殖培
养基均为MS基本培养基十BA 0.3-0.5 mg/1 + NAA0.2 0.5 mg/1 +糖20~30 g/1 +琼脂5~9 g/1,
pH为5.5 6.0。
增殖培养基的制作方法具体如下以MS基本培养基作为基础，分别加入6-苄基腺嘌呤
(BA)和萘乙酸(NAA)、糖和琼脂，均匀混合，利用lmol/L的KOH或lmol/L的HCl调节 pH为5.5 6.0;每lL的MS基本培养基加0.3 0.5mgBA、 0.2~0.5 mg NAA、 20 30g糖禾口5 9g 琼脂。
作为本发明的棉毛鹿茸草的离体培养法的进一步改进步骤5)中的生根培养基为
l/2MS基本培养基+ NAA0.2~0.5 mg/1 +糖30 g/1 +琼脂5~9 g/1 +活性炭2§/1， pH为5.5 6.0。
生根培养基的制作方法具体如下以1/2MS基本培养基(即溶液中所有物质的含量为 MS基本培养基的一半)作为基础，分别加入萘乙酸(NAA)、糖、琼脂和活性炭，均匀混 合，利用lmol/L的KOH或lmol/L的HCl调节pH为5.5 6.0;每1L的1/2MS基本培养基加入 0.2 0.5mgNAA、 30g糖、5 9g琼脂和2g活性炭。
作为本发明的棉毛鹿茸草的离体培养法的进一步改进步骤l)为将绵毛鹿茸草嫩
芽放入烧杯中，自来水冲洗1 2小时。
本发明的绵毛鹿茸草的离体培养法，属于一种诱导绵毛鹿茸草快速繁殖的组织培养方 法。依照植物组织培养中细胞全能性的原理，可以在短时间内生产大量遗传背景相同、长 势一致的优质种苗(种子)，而且依靠实验室可以实现周年的长期提供优质种苗。在本发 明的方法中，将健壮的绵毛鹿茸草嫩芽先进行消毒，再通过合适的诱导培养基诱导获得一
定量的无菌苗。采用本发明的方法， 一般仅需60 80天即可得到可出瓶种植的种苗；因此
4绵毛鹿茸草试管苗一周年内的繁殖系数理论上为31()倍以上。本发明的绵毛鹿茸草离体培养 法，是一种不受季节等因素影响，能高效、快速提供优质绵毛鹿茸草苗的方法，可以加速 良种推广速度，提高田间品种种植产量。
本发明所得的种苗可采用以下方法进行种植:把具有至少3条长于2 cm根的种苗移出培
养瓶，洗净其根部培养基，移栽到基质(由体积比为3: 1: l的泥炭、珍珠岩和蛭石组成)
中，于人工气候箱室内培养，培养条件12小时光照，光照强度15 25 pmol m—2.3—1，温
度为23 25t:; 12小时暗培养，温度为20 22t:;上述光照和暗培养交替进行；湿度85%
卯％。 3 5周后，改成光照强度为30 40^imolm'2.8—1，其余条件同上。2个月后，存活率 达到60%以上。
而自然所得的相同根数和根长的野生苗在上述相同的环境下培养，2个月后存活率仅 为10%左右。
具体实施例方式
实施例l、 一种绵毛鹿茸草离体培养的方法，依次进行以下步骤
1) 、取无病斑、生长健壮的绵毛鹿茸草嫩芽放入烧杯中，自来水冲洗1 2小时；
2) 、将上述嫩芽经常规消毒(即O. 1% W/vHgCl2处理6 10分钟后，无菌水冲洗5 8遍，然后用无菌滤纸吸干)后，切成lcm左右的小段嫩芽I ，接种到诱导不定芽培养基上
进行培养；培养条件为16小时光照，光照强度10 30 ^imolm—2.3—1，温度为26 28'C; 8
小时暗培养，温度为20 22t:;上述光照和暗培养交替进行；
诱导不定芽培养基为MS基本培养基+ BA0.5~1.0 mg/1 +糖2 0~30 g/1 +琼脂5 ~9 g/1， pH为5.5 6.0。
3) 、待小段嫩芽I上长出的不定芽长至2.0 5.0cm高的小苗I时，割取小苗I ;将此 小苗I切成lcm左右的小段嫩芽II，将上述小段嫩芽II接种到增殖培养基上进行培养；培
养条件为16小时光照，光照强度10 30 pmol m—2.3—1，温度为26 28'C; 8小时暗培养，
温度为20 22 °C;上述光照和暗培养交替进行；
增殖培养基为MS基本培养基+ BA 0.3~0.5 mg/1 + NAA 0.2-0.5 mg/1 +糖20~30 g/1 +琼 脂5 9g/1， pH为5.5 6.0。
4) 、待小段嫩芽n上长出的不定芽长至2.o 5.ocm高的小苗时n，割取小苗n;将此
5小苗11切成0.8 1.2咖长的小段嫩芽111,将上述小段嫩芽m接种到增殖培养基上进行培养;
培养条件为16小时光照，光照强度10 30pmolm'2.^，温度为26 28t; 8小时暗培养，
温度为20 22t;上述光照和暗培养交替进行； 增殖培养基同步骤3)的增殖培养基。
5) 、待小段嫩芽in上长出的不定芽长至3.o 5.ocm高的小苗m时，割取小苗in;将此
小苗III接种到生根培养基中；培养条件为16小时光照，光照强度10 30pmolrrfls—1，温
度为26 28'C; 8小时暗培养，温度为20 22t;上述光照和暗培养交替进行；
生根培养基为1/2148基本培养基+ NAA 0.2 0.5 mg/1 +糖30 g/1 +琼脂5~9 g/1 +活性炭 2g/1， pH为5.5 6.0。
6) 、待上述小苗III长出大于2cm的至少3条根时，得可出瓶种植的种苗。 依照上述方法，只需60 80天即可获得可出瓶种植的种苗(试管苗)；因此采用本发明
的方法可以长期得到大量的试管苗。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不 限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接 导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1、一种棉毛鹿茸草的离体培养法，其特征是依次包括以下步骤1)、取无病斑、生长健壮的绵毛鹿茸草嫩芽进行流水冲洗；2)、将上述流水冲洗后的嫩芽经常规消毒，然后切成0.8～1.2cm长的小段嫩芽I，将上述小段嫩芽I接种到诱导不定芽培养基上进行培养；培养条件为16小时光照，光照强度10～30μmol m-2.s-1，温度为26～28℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；3)、待小段嫩芽I上长出的不定芽长至2.0～5.0cm高的小苗I时，割取小苗I；将此小苗I切成0.8～1.2cm长的小段嫩芽II，将上述小段嫩芽II接种到增殖培养基上进行培养；培养条件为16小时光照，光照强度10～30μmol m-2.s-1，温度为26～28℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；4)、待小段嫩芽II上长出的不定芽长至2.0～5.0cm高的小苗时II，割取小苗II；将此小苗II切成0.8～1.2cm长的小段嫩芽III，将上述小段嫩芽III接种到增殖培养基上进行培养；培养条件为16小时光照，光照强度10～30μmol m-2.s-1，温度为26～28℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；5)、待小段嫩芽III上长出的不定芽长至3.0～5.0cm高的小苗III时，割取小苗III；将此小苗III接种到生根培养基中；6)、待上述小苗III长出大于2cm的至少3条根时，得可出瓶种植的种苗。
2、 根据权利要求l所述的棉毛鹿茸草的离体培养法，其特征是步骤2)中的诱导不定芽 培养基为MS基本培养基+BA0.5 1.0mg/l+糖2 0 30g/l+琼脂5 9g/1， pH为5.5 6.0。
3、 根据权利要求2所述的棉毛鹿茸草的离体培养法，其特征是步骤3)和步骤4)中的 增殖培养基均为1^13基本培养基+ BA 0.3-0.5 mg/1 + NAA 0.2~0.5 mg/1 +糖20~30 g/1 +琼脂5~9 g/l， pH为5.5 6.0。
4、 根据权利要求3所述的棉毛鹿茸草的离体培养法，其特征是步骤5)中的生根培养基 为l/2MS基本培养基+ NAA 0.2-0.5 mg/1 +糖30 g/1 +琼脂5~9 g/1 +活性炭2§/1， pH为5.5 6.0。
5、根据权利要求4所述的棉毛鹿茸草的离体培养法，其特征是所述步骤l)为将绵 毛鹿茸草嫩芽放入烧杯中，自来水冲洗1 2小时。
全文摘要
本发明公开了一种棉毛鹿茸草的离体培养法，依次包括以下步骤1)绵毛鹿茸草嫩芽进行冲洗；2)经常规消毒后，切成小段嫩芽I接种到诱导不定芽培养基上进行培养；3)切取小段嫩芽I上长出的不定芽，将所得的小段嫩芽II接种到增殖培养基上进行培养；4)切取小段嫩芽II上长出的不定芽，将所得的小段嫩芽III接种到增殖培养基上进行培养；5)切取小段嫩芽III上长出的不定芽，将所得的小苗III接种到生根培养基中；6)待上述小苗III长出大于2cm的至少3条根时，得可出瓶种植的种苗。采用本发明的方法能获得大量的绵毛鹿茸草的种苗。
文档编号A01H4/00GK101507415SQ20091009695
公开日2009年8月19日 申请日期2009年3月26日 优先权日2009年3月26日
发明者利 冯, 张国芳, 毛碧增 申请人:浙江大学