专利名称：一种培育海水无核珍珠的方法
技术领域：
本发明涉及一种珍珠养殖技术，尤其是供应药用的海水无核珍珠养殖技术。
背景技术：
天然珍珠资源稀少，在自然环境中，每一万个母贝只能采到10余克珍珠，而且颗粒小、
形状差，加上采珠是一件非常危险而艰难的工作，随着养殖珍珠的兴起，采珠业也随之消失， 所以目前市面上销售都是养殖珍珠。
养殖珍珠与天然珍珠一样，分为海水珍珠、淡水珍珠。人工海水育珠主要集中在广西、 广东的合浦、廉江和海南岛等沿海地区，合浦珍珠含有丰富的营养成分及各类生命源物质，为 自古以来中医入药首选，为中医药界公认、首推的道地药材，是药用珍珠的主流品种，史称廉
珠、南珠；而来源于江河湖泊的淡水珍珠习称"东珠"，人工养殖淡水珍珠主要在浙江、湖南、 江苏、安徽等省。
采用珍珠贝类外套膜上皮组织、移植到育珠贝体内以培育珍珠的方法， 一直是人工培育 珍珠的基本技术。简单地说人们将珠母贝外套膜上皮组织和珠核移植入贝体内，育成人工 有核珍珠，单纯插入外套膜小片则形成人工无核珍珠。单纯插入外套膜小片养殖无核珍珠技 术在淡水珍珠的生产中巳经成功地应用，但海水养殖无核珍珠技术不成熟，至今没有在生产 中应用，其原因与海水天然环境下不能很好地施肥及控制病虫害等因素有关。由于长珠缓慢、 不但成珠率低，且质量低劣，这就失去了在生产中应用的价值，所以，我们必须探索一种适 用于海水无核珍珠的养殖技术，该项技术在药用珍珠领域具有特别重要的意义，因为人工插 核海水珍珠是不适合药用的。
我国自20世纪50年代末期开始对珍珠贝及珍珠养殖进行系统研究。主要内容集中在人 工育苗和人工插核育珠。但是，自20世纪50年代开始育珠试验至获得成功， 一直到现在， 生产海水珍珠的贝类仍然是合浦珠母贝唱主角。因此出现品种老化，种质退化和病害多，珍 珠质差等现象。其次，几十年来，插核育珠技术几乎没有多大改进，插珠贝死亡率仍然很高， 成珠率低，育出的珍珠品种单一，这是制约珍珠生产发展的关键环节。
科研工作者从生物技术领域对育珠技术进行了研究，日本学者最早提出了试管珍珠，所谓 试管珍珠，就是利用细胞培养技术，将珠核与外套膜细胞一起培养，使细胞贴在珠核上，形
3成珍珠囊，然后，植入母贝中或者直接在实验室培养形成珍珠或者不用珠核，直接进行细胞 培养，然后收集其分泌的珍珠质液。另一种方法是运用组织培养技术，将外套膜小片与珠核 一起培养，形成珍珠囊后再插人母贝生产珍珠。我国的南海水产研究所和广西海洋研究所也 开展了一些这方面的工作，学者们既往遇到的一个共同难题是，外套膜细胞培养难以形成细 胞系，后续工作无法开展[喻达辉，苏天凤.生物技术在珍珠养殖业中的应用.水产科技，2000， (1) : 13]。
王爱民等在几年的插囊育珠实验中得出的一个共同的结果用外套膜细胞形成的体外珍珠 囊用于插囊育珠无法得到珍珠，而将外套膜组织块形成的体外珍珠囊用于插囊育珠能够得到 珍珠。说明，体外细胞培养所形成的珍珠囊还不是完善的珍珠囊，而由外套膜组织块形成的 珍珠囊才具有完整的结构和功能。但用外套膜组织块形成的体外珍珠囊用于插囊育珠实验中 往往出现成珠率低、素珠多和育珠贝死亡率高。他们认为这同插核技术无不相关。切口的大 小及珠核通过切口运至预定核位的方式直接影响到体外珍珠囊的结构变化。若体外珍珠囊在 珠核上贴附不牢固、切口过小，就会造成体外珍珠囊受到破坏，使它们在到达预定核位之前 完全脱落，无法产生珍珠，只能是素珠。而保持完整结构珍珠囊的珠核最终产生珍珠。他们
在1999年的实验中，改进了插核技术，切口变大，扩大输送通道，但用组织块培养技术将外 套膜小片与珠核一起培养获得的珍珠囊应用于海水养殖，只是取得4. 05%的成功率，要应用于
生产，还有很多基础工作要做[王爱民，阎冰,苏琼，等.马氏珠母贝珍珠囊体外培养及插囊
育珠.广西科学，2000， 7(1): 70]。
针对上述相关研究现状 一是在外套膜细胞体外培养珍珠囊方面，由于目前尚无法精确
地分离外套膜组织中的各类细胞，特别是外上皮细胞、内上皮细胞和结缔组织细胞三类细胞， 因此无法按比例在体外建立珍珠囊，其结果是虽然有不少细胞粘附在珠核上，但细胞之间无 法建立应有的连接，不能形成结构完整的珍珠囊。二是用外套膜组织块贴附在珠核上进行培 养，外套膜组织建立体外珍珠囊的过程同体内建立珍珠囊的过程基本上是一致的，外上皮细 胞从外套膜组织块中迁出，沿着珠核的表面移动，逐渐包裹珠核表面。同时外套膜组织中的 结缔组织细胞再包裹在外上皮细胞表面，最终形成结构较完整的珍珠囊，这种珍珠囊是真正 意义上的珍珠囊，但用于插囊育珠成功率非常低，还需要解决体外珍珠囊在珠核上贴附不牢 固，扩大切口，对育珠贝损伤大等基础性问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种在天然海水环境下，能够促进珍珠生长，育珠成活率及成珠率 高，珍珠质量好，无污染的海水无核珍珠人工养殖方法。
所述的海水无核珍珠养殖方法，包括下述步骤(1) 首先按常规方法取出健康珠母贝外套膜上皮组织，除去裙带部分，净化处理后切成 尽可能细的小块，加入质量含量0.1-0.8%蛋白酶溶液，在20-28。C的温度下消化15 20min， 然后加入带有贝血清的培养液中止消化。
所述的蛋白酶溶液是木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶等商品酶。 所述的蛋白酶溶液的制备是按比例秤取胰蛋白酶，溶解于重蒸馏水或三蒸水中配制成
0.1-0.8%的胰蛋白酶溶液，混匀，过滤除菌，4C备用，其中的过滤除菌可以采用板框过滤器、
微孔滤膜密闭过滤等形式。
所述的带有贝血清的培养液是从珍珠贝心脏或大血管中取出血液，经离心，取上清液得
到；要求贝血清必须及时采集及时使用，如果不能及时使用，应当将贝血清于一2(TC保存，
使用前置入4'C容器融化，尽快使用。
(2) 培养液的配制贝组织液贝血清灭菌过滤的天然海水=1 1.5: 0.5 1: 8,使
用时每100ml溶液中加入100IU/ml青霉素0.5-2ml，0.1g/L链霉素0.5-2ml，或者其中的一种， 用盐酸和氢氧化钠调pH值至6.6-7.4。
(4) 将上述含有经消化的外套膜上皮细胞的培养液置20'C的恒温培养箱或20"C 25"C 的无菌环境中做细胞培养。
(5) 4—8小时后，解离的外套膜上皮细胞生长旺盛，形态正常，上皮细胞占绝对优势， 在培养后的5 30h之间，在珍珠囊形成之前，用注射器将细胞液注入育珠贝体内，然后将注 射后育珠贝在休养期7 20天后放入海水中吊养或在养殖池箱中喂养。
以上所述的采用的健康珠母贝是指珍珠养殖生产中主要的海产贝种，包括马氏珠母贝、 解氏珠母贝、白蝶珠母贝、黑氏珠母贝、企鹅珍珠贝。
以上所述的提供外套膜上皮组织以及贝血清的珠母贝是同一种属的海产贝，或者是不同 种属的，只要是贝类血清就可以了。如果以从上述同时取外套膜上皮组织的珍珠贝取贝血清， 可以大大降低成本。
以上所述的注入育珠贝体内的细胞液的量视贝体大小不同注入不同的量，以马氏珠母贝 为例， 一般每ml细胞液注射10 15只贝。所得的培养细胞液可以注射到不同品种的珠母贝。
本发明上述海水无核珍珠培育养殖方法的原理是(1)采用经初步培养的外套膜上皮细胞 悬液注射到育珠贝体内，有助于外套膜上皮细胞尽快与珠母贝建立血液循环关系，加速珍珠 囊的形成，避免了由于目前尚无法精确地分离外套膜组织中的各类细胞，特别是外上皮细胞、 内上皮细胞和结缔组织细胞三类细胞，因此在细胞培养中无法按比例在体外形成结构完整的 珍珠囊的问题；(2)采用注射器将外套膜上皮细胞注射到育珠贝体内，解决了器械直接挟持珠 核或直接挟持组织细胞植入过程对育珠贝及珍珠上皮细胞造成的伤害，对提高海水珍珠的成珠率是有帮助的。
本发明的有益效果在于
1、 被移植到育珠贝体内的是解离了的外套膜上皮细胞，而不是珠母贝外套膜组织块，也 不是在体外培育形成的珍珠囊；更区别于传统的用器械直接挟持珠核插入的方法，植入的细 胞比组织块更宜于在珠母贝体内生长，较快较好地在体内形成结构完整的珍珠囊；也避免了 既往用外套膜上皮细胞培养体外珍珠囊实验中碰到的无法在体外建立结构完整的珍珠囊的难题。
2、 成活率及成珠率高由于移植到育珠贝体内的是生长状况良好的外套膜上皮细胞悬混 液，比插入上皮组织片更迅速地与育珠贝建立血液循环关系，且采用注射的方法，对育珠贝 基本没有造成损伤，也没有对珍珠囊的损伤，故应用本发明的技术成活率及成珠率高。既往
报道用外套膜上皮组织培养的珍珠囊插囊育珠成珠率只是4.05%,据我们观察海水插片育无核 珠的成珠率只有25%左右，而用本发明技术成珠率在60%以上。
3、 适合于药用珍珠贝类是低等的无脊椎动物，实验证明采用市售的通用的培养脊椎动 物的培养基方案不能取得理想效果。本发明采用的贝类组织液及贝血清可以从取外套膜上皮 组织的同种珠贝中获取，也可以从其他海水贝类中获取，为无毒性物质，适合于药用。
4、 操作简单，减少污染机会国内养殖场普遍条件较差，手术过程很难做到无菌操作，
注射法比插入法操作方便，可以多点注射，操作人员易掌握，对珠贝损伤少，减少了感染机会。
5、 成本低供给外套膜上皮、贝组织液及贝血清的可以是同一贝体，节约了贝资源；另 外，可以在插入有核珍珠的珠贝中选取不同位置注入细胞液培养无核珍珠，可以增加珠农的 收入。
6、 上述方法能够提高珠母贝成活率及成珠率，培育过程与珠母贝生态接近，操作容易， 成本降低，便于在生产中推广，社会效益及经济效益显著。天然珍珠的价格历来比黄金贵， 本发明在海水无核珍珠(主要为药用)的生产中保证珍珠道地药材的可持续利用提供了技术 支撑，对于弘扬南珠文化，支持地方经济建设具有重要的意义。
具体实施例方式
下面结合实例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。 采用自制天然培养液培养珍珠贝外套膜上皮细胞获取海水药用无核珍珠的试验 实施例1
(1)按比例秤取木瓜蛋白酶，溶解于三蒸水中配制成质量含量0.5%的木瓜蛋白酶溶液，
混匀，采用板框过滤器过滤除菌，4'C备用。按常规方法取出l-2龄的健康马氏珠母贝外套膜上皮组织，除去裙带部分，净化处理后切成尽可能细的小块；置木瓜蛋白酶溶液中消化，温 度为摄氏2(TC-25'C。
(2) 快速从上述提供外套膜上皮组织的珠母贝体中提取贝组织液及贝血清(从珍珠贝心
脏或大血管中取血，经离心，取上清液即为珍珠贝血清)；配成比例为贝组织液贝血清
灭菌过滤海水=1 1.5: 0.5 1: 8的培养液，使用时每100ml培养液中加入100IU/ml青霉素 1.5ml,0.1g/L链霉素1.5ml，用盐酸和氢氧化钠调pH值至6.6-7.4。
(3) 将上述自配的带有贝血清的培养液加入胰蛋白消化溶液里终止消化，整个消化时间 为15-20min;并将含有经消化的外套膜上皮组织的培养液置摄氏2(TC的恒温培养箱或2(TC 25'C的无菌环境中做细胞培养。
(4) 在培养后的5 30h之间，在珍珠囊形成之前，用注射器将细胞液注入育珠贝体内， 视贝体大小不同注入不同的量，以马氏珠母贝为例， 一般每ml细胞液注射10 15只贝，同 一贝体可以只采取注射法接种外套膜上皮细胞，也可以在接受了有核珍珠插核手术的不同核 位接种外套膜上皮细胞悬液。
(5) 将注射后育珠贝放入海水中或在养殖池箱中休养，休养期一般7 20天，海水水温 15 3(TC，海水比重1.018 1.024。休养期过后即可移入大海中按常规吊养，六个月后即 可开贝采珠。
实施例2
(1) 秤取胰蛋白酶溶解于50ml的三蒸水中配制成0.3M的胰蛋白酶溶液，混匀，微孔滤 膜密闭过滤除菌，4"备用；按常规方法取出l-2龄的健康黑氏珠母贝外套膜上皮组织，除去 裙带部分，净化处理后切成尽可能细的小块；置胰蛋白酶溶液中消化，温度为摄氏20°C-25 。C。
(2) 事先从同种珠母贝制备贝血清或从其他海水贝类制备贝血清于一20'C冰箱保存。使 用前置入4'C融化，尽快使用，使用之前无需水浴灭活处理。快速从上述提供外套膜上皮组
织的珠母贝体中提取贝组织液及4'C融化的贝血清；配成比例为贝组织液贝血清灭菌
过滤海水=1 1.5:0.5 1:8的培养液,使用时每100ml溶液中加入100IU/ml青霉素2ml,0.1g/L 链霉素2ml，用盐酸和氢氧化钠调pH值至6.6-7.4。
(3) 将上述自配的带有贝血清的培养液加入胰蛋白消化溶液里终止消化，整个消化时间 为15-20min;并将含有经消化的外套膜上皮组织的培养液置摄氏2(TC的恒温培养箱或20°C 25'C的无菌环境中做细胞培养。
(4) 在培养后的5 30h之间，在珍珠囊形成之前，用注射器将细胞液注入育珠贝体内， 视贝体大小不同注入不同的量，以黑氏珠母贝为例， 一般每ml细胞液注射10 15只贝，同一贝体可以只采取注射法接种外套膜上皮细胞，也可以在接受了有核珍珠插核手术的不同核 位接种外套膜上皮细胞悬液。
(5)将注射后育珠贝放入海水中或在养殖池箱中休养，休养期一般7 20天，海水水温: 15 30°C，海水比重1.018 1.024。休养期过后即可移入大海中按常规吊养，六个月后即 可开贝采珠。
权利要求
1、一种培育海水无核珍珠的方法，其特征在于该方法包括以下步骤(1)首先按常规方法取出健康珠母贝外套膜上皮组织，除去裙带部分，净化处理后切成尽可能细的小块，加入质量含量0.1-0.8％蛋白酶溶液，在20-28℃的温度下消化15～20min，然后加入带有贝血清的培养液中止消化；(2)培养液的配制贝组织液∶贝血清∶灭菌过滤的天然海水＝1～1.5∶0.5～1∶8，使用时每100ml溶液中加入100IU/ml青霉素0.5-2ml，0.1g/L链霉素0.5-2ml，或者青霉素和链霉素的其中的一种，用盐酸和氢氧化钠调pH值至6.6-7.4；(4)将上述含有经消化的外套膜上皮细胞的培养液置20℃的恒温培养箱或20℃～25℃的无菌环境中做细胞培养；(5)4-8小时后，解离的外套膜上皮细胞生长旺盛，形态正常，上皮细胞占绝对优势，在培养后的5～30h之间，在珍珠囊形成之前，用注射器将细胞液注入育珠贝体内，然后将注射后育珠贝在休养期7～20天后放入海水中吊养或在养殖池箱中喂养。
2、 根据权利要求1所述的培育海水无核珍珠的方法，其特征在于所采用的健康珠母贝 是指珍珠养殖生产中主要的海产贝种，包括马氏珠母贝、解氏珠母贝、白蝶珠母贝、黑氏 珠母贝、企鹅珍珠贝。
3、 根据权利要求1所述的培育海水无核珍珠的方法，其特征在于所述的提供外套膜上皮组织以及贝血清的珠母贝是同一种属的海产贝，或者是不同种属的海产贝。
4、 根据权利要求1所述的培育海水无核珍珠的方法，其特征在于所述的注入育珠贝体内的细胞液的量视贝体大小不同注入不同的量。
5、 根据权利要求1所述的培育海水无核珍珠的方法，其特征在于所述的蛋白酶溶液是 木瓜蛋白酶、胰蛋白酶或菠萝蛋白酶的商品酶，蛋白酶溶液的制备是按比例秤取蛋白酶，溶解于重蒸馏水或三蒸水中配制成质量含量0.1-0.8%的蛋白酶溶液，混匀，过滤除菌，4'C备用。
6、 根据权利要求1所述的培育海水无核珍珠的方法，其特征在于所述的带有贝血清的培养液是从珍珠贝心脏或大血管中取出血液，经离心，取上清液得到。
全文摘要
本发明公开了一种海水无核珍珠人工养殖方法，是取出健康珠母贝外套膜上皮组织，除去裙带部分，将外套膜上皮组织用蛋白酶溶液消化，然后加入带有贝血清的培养液中止消化，培养液中含贝组织液，适量的青霉素和链霉素，在无菌环境中培养5-30h后将细胞悬液注射入育珠贝体内，休养期后放入海水中吊养或在养殖池箱中喂养。本发明对育珠贝损害少，成活率及成珠率高，适合于药用，操作方便，成本低。
文档编号A01K61/00GK101491228SQ20091011389
公开日2009年7月29日 申请日期2009年3月2日 优先权日2009年3月2日
发明者强 刘, 华 单, 铭 戴, 李中华, 辉 杨, 杨继峰, 江 林, 海 林, 湧 林, 林其溪, 勤 王, 王乃平, 霖 甘, 邓家刚, 陈明伟 申请人:广西中医学院;林 湧