专利名称：一种快速鉴定杨树叶片耐盐潜力的改良培养基的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术的植物检测，特别涉及一种准确鉴定杨树叶片耐盐潜力的改
良培养基。
背景技术：
盐害是影响植物生长和作物产量以及森林面积的主要因素，全世界盐碱地面积为 9. 54亿公顷，并且由于次级盐渍化，世界盐碱地面积还在进一步扩大。林木在维护和改善生 态环境及水土保持方面发挥着重要的作用，随着盐渍化问题的进一步突出，人们对林木耐 盐碱性研究的也越来越重视，希望能通过提高林木耐盐碱性来改善土壤盐渍化问题。杨树 属于杨柳科落叶乔木，是世界上广泛栽培的重要造林树种和防护林之一。杨树在缺林少木 的盐碱、干旱、贫瘠和荒漠地区栽植，可迅速恢复植被，减少风沙危害、降低地下水位、保护 农田、减少地表蒸发，增加森林覆盖率，也为纸浆用材林建设和工业商品林建设提供足够的 原材料。耐盐杨树的选育一直世界各国的研究重点，通过杂交技术、转基因技术和耐盐突变 体筛选，已经获得了许多不同耐盐性的杨树新品种。但由于耐盐能力容易受植株发育阶段、 生长状况、土壤类型和结构、降雨量和蒸发量等许多不可控因素的影响，筛选出可遗传变异 的机会极少，杨树耐盐能力的改良进程极为缓慢。如何准确地鉴别和筛选耐盐的优良基因 型，成为科学家苦苦探索的关键技术。在盐胁迫环境中，杨树逐渐出现生长缓慢、叶片失绿、叶缘褐化、枝条干稍等特点。 所以，对杨树的耐盐碱能力主要是通过比较其存活率、相对生长量、鲜干重比等进行直接的 盐碱地筛选鉴定。但是杨树生长期长，评价生长性状、物候性状、生长期等需要的时间较长， 费时费力，误差大，效率低，而且受环境因素的影响较大，准确性差。在高盐溶液环境中，杨树根系吸收的盐离子随水份运送到地上部分，首先在叶片 中进行积累，积累到一定程度后导致叶片代谢紊乱，叶片生长停止，衰老加剧，最后导致叶 片死亡。把离体叶片接种在添加GA-3的MS基本培养中，叶片明显伸长，说明离体叶片能从 MS培养基中吸收营养进行正常的代谢活动。在这种改良培养基中添加高浓度的NaCl后，叶 片细胞在吸收营养的同时也会吸收Na+，当细胞内的Na+积累到一定水平后，会使细胞生长 受阻，细胞形状发生不规则变化，叶片几乎不伸长。在相同的盐胁迫环境中，耐盐基因型的 叶片伸长情况和不耐盐的基因型应该有明显的区别。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种准确鉴定杨树叶片耐盐潜力的改良培养 基。能够准确判断基因型的耐盐潜力，省工省时，工作效率极高。本发明的技术方案是—种快速鉴定杨树叶片耐盐潜力的改良培养基，其特点在于1)在MS培养基添加赤霉素GA-3，2)在添加赤霉素GA-3的MS培养基中添加不同浓度的NaCl，
即在基本培养基MS培养基中，添加0. 8mg/L GA_3，再添加不同浓度的NaCl，不同 NaCl浓度为0. 8-1. 2%，得到不同NaCl浓度的改良培养基。本发明效果是利用一种快速鉴定杨树叶片耐盐潜力的改良培养基，能准确判断基因型的耐盐潜 力，省工省时，重复性好，对其他植物耐盐潜力的快速鉴定具有重要参考价值，具有广阔的 应用前景。本发明具有以下优点和特点1.该技术体系发明的改良培养基，以杨树叶片伸 长和叶表皮细胞形状、大小变化为依据，只需少量的杨树叶片，就能迅速地鉴定出植株的耐 盐能力，具有效率高、重复性好、费用低廉等优点。2.根据叶片伸长长度及叶表皮细胞的 形状、大小变化淘汰大量不耐盐的基因型，可以有效地压缩田间试验的规模，节约时间和人 力，大幅度提高优良耐盐基因型的筛选效率，加速耐盐植物育种的步伐。
图1是培养前和培养后107和18-1离体叶片表皮细胞的形态变化情况a 107叶片接种前的表皮细胞，b 107叶片在含0. 8% NaCl的改良MS培养基上培养6d后的变化，c 107叶片在含1. 0% NaCl的改良MS培养基上培养6d后的变化；d 18-1叶片接种前的表皮细胞，e 18-1叶片在含0. 8% NaCl的改良MS培养基上培养6d后的变化，f 18-1叶片在含1. 0% NaCl的改良MS培养基上培养6d后的变化.图2是在不同浓度NaCl的改良培养基中培养6天后杨树叶片长度的变化图片中应用改良MS培养基鉴定叶片长度的试验结果表明，将叶片接种在含1.0% NaCl的改良培养基中6天后，耐盐品种18-1杨的叶片明显伸长，而普通品种107叶片的伸 长很少，18-1杨叶表皮细胞的形状比107杨叶表皮细胞的形状更加规则，并且细胞较大； 1. 2% NaCl的改良培养基中6天后，107杨的叶片不再伸长，耐盐品种18_1杨的叶片仍能继 续伸长。说明杨树植株的耐盐能力和离体叶片以及叶表皮细胞的耐盐能力高度相关，用改 良的培养基添加不同浓度的NaCl进行处理，通过测定离体叶片伸长长度、观察叶表皮细胞 的形状大小变化，能快速、准确地筛选出耐盐杨树植株。
具体实施例方式一种快速鉴定杨树叶片耐盐潜力的改良培养基，其特点在于(1)在MS培养基添加赤霉素GA-3，(2)在添加赤霉素GA-3的MS培养基中添加不同浓度的NaCl，即在基本培养基MS培养基中，添加0. 8mg/L GA-3,再添加不同浓度的NaCl，不同 NaCl浓度为0. 8-1. 2%，得到不同NaCl浓度的改良培养基。本快速鉴定杨树叶片耐盐潜力的改良培养基的使用1)基本培养基为MS培养基，添加GA-3，离体叶片接种在此培养基中，叶片出现明 显的伸长现象。2)在改良培养基中添加不同浓度的NaCl，其叶片伸长的长度在不同的杨树基因 型中存在很大的差异。
3)将叶片接种在高盐培养基中培养一定的时间，叶表皮细胞的形状和大小发生明 显变化。以对细胞无害的0. 03%活体染料中性红为指示剂，对杨树叶表皮细胞染色15分 钟，在显微镜下观察叶表皮细胞的形状和大小变化，能够快速准确地判断基因型的耐盐能 力。本快速鉴定杨树叶片耐盐潜力的改良培养基使用操作1)将叶片接种在含NaCl的改良培养基中培养一定时间，耐盐潜力不同的基因型， 其叶片伸长长度及叶表皮细胞的大小有明显的差异。2)以杨树幼嫩叶片为外植体，沿中脉垂直的方向，将叶片剪成0. 5X2. Ocm2大小的 长方形，叶背向下平放于含有不同浓度NaCl的改良培养基中，6天后测量叶片的长度变化 并于显微镜下观察杨树表皮细胞形状和大小的变化。耐盐品种叶片长度增加明显，其叶表 皮细胞明显伸长，不耐盐品种叶片几乎不伸长，叶表皮细胞出现不规则收缩。说明利用新发 明的培养基，能够把耐盐和不耐盐的基因型鉴别出来。针对传统技术鉴定植物耐盐潜力所需时间长、所需材料多、重复性差的问题，发明 人进行了大量的研究工作，最终建立了利用改良MS培养基准确鉴定杨树耐盐潜力的新方 法。本发明旨在提供一种科学高效的耐盐性快速鉴定方法，通过该方法淘汰大量不耐盐的 基因型，实现耐盐基因和高产优质基因的结合，加速耐盐杨树新品种的选育。确定能显著提高杨树叶片生长速度的改良MS培养基MS培养基是目前使用最普遍的培养基，能够保证组织生长所需的矿质营养，但杨 树离体叶片在MS培养基上的生长速度极慢。经过长时间的摸索，发现添加一定数量的赤 霉素(GA-3)能够有效地提高杨树离体叶片的生长速度。将叶片接种在含有0.2、0.4、0.6、 0. 8,1. 0,1. 2mg/L GA-3的改良培养基中，6天后观察叶片伸长情况，发现含有0. 2,0. 4mg/ L GA-3的改良培养基对叶片伸长没有明显的促进作用；激素浓度过高也不利于叶片伸长。 0. 8mg/L GA-3的改良培养基对叶片伸长起到明显的促进作用，叶片接种6天后，其叶片长 度平均增加0. 8-1. Ocm0因此，我们把含有0. 8mg/L GA-3的改良培养基作为杨树叶片伸长 培养的最适培养基。筛选能够区分不同耐盐能力的改良培养基在改良培养基中添加不同浓度NaCl，将杨树叶片接种在含不同浓度NaCl的改良 MS培养基中，培养6d后，测量其叶片的长度变化；并用刀片轻轻刮叶片，直到刮成透明的薄 层为止，得到下表皮，用0. 03%中性红溶液染色15min，脱色后于显微镜下观察杨树叶片下 表皮细胞形状、大小的变化。当改良培养基中含有0. 2% -0. 6% NaCl时，耐盐杨树和不耐 盐杨树的叶片都能正常生长，只是耐盐杨树叶片的生长速度明显较快。在含0. 8% -1. 2% NaCl的改良培养基中，不耐盐杨树的叶片停止生长甚至缩小，耐盐杨树的叶片则继续生长。 表皮细胞的伸长程度和形态变化与离体叶片长度的变化完全一致。离体叶片伸长速度与耐盐性的相关性研究杨树离体叶片伸长及叶表皮细胞形状、大小变化的试验结果表明，随着改良培养 基中NaCl浓度的增加，107杨叶片长度的增加也明显降低；当其接种在含有1. 2% NaCl的 改良培养基时，叶片不再伸长，叶表皮细胞出现不规则伸缩。耐盐品种18-1杨叶片接种在 含有1. 2% NaCl的改良培养基6天后，叶片长度增加0. 5cm，其叶表皮细胞的形状比不耐盐 品种的更加规则，且细胞更大。说明杨树植株的耐盐能力和其叶片在含盐培养基上的生长速度高度相关，将杨树叶片接种在改良培养基中，能够快速、准确地筛选出杨树的耐盐植株 和耐盐新品种。施例1 从中科院引进的 107 号杨(PopulusXeuramericana ‘Neva，)和转 NTHKl 基因杨树18-1。欧美杨107起源于意大利，是卡萨歹 蒙费拉托杨树栽培研究所SekaWain博士于 1973年进行人工控制杂交选育出来的。107号是中国林科院承担的国家"七五"科技成 果"国外杨树引种及区域化试验"中重点推出的新品种，又名"美丽天使"杨。该项目曾 获得1991年能源部科技进步三等奖，1993年林业部科技进步二等奖，1996年国家科技进步 三等奖殊荣。经近十年的苗期、无性系对比林测试和区域化试验，欧美杨107号表现良好， 适合我国黄河流域、淮河流域及辽河以南流域广泛栽植，成为我国北方包括西北地区防护 林带、用材林的主要造林树种之一。张劲松等(1999)等从烟草中克隆了乙烯受体基因类似物NTHK1，利用pBin438载 体，构建了含有烟草乙烯受体基因NTHKl的植物表达载体，运用农杆菌法，分别将上述载体 转化受体杨树107 (Populus Xeuramericana ‘Neva’ )中，经分子鉴定后，获得转基因植株 30多株。然后，将转基因杨树和受体去叶后分别置于含0. 2%，0. 4%，0. 6%和0. 8% NaCl 中进行耐盐性测试。筛选出耐0. 8% NaCl的NTHKl (烟草乙烯受体基因)转基因杨树新品 系 18-1。取18-1和107杨相同大小枝条，在不同海盐条件下水培，通过生长表现和根系发 育状况进行了对比试验研究，18-1杨能在0. 8%海盐条件下，107杨在0. 4%条件下能正常 生长。以107和18-1 —年生扦插株系为材料，从植株顶端起，取第3、4片全展叶为外植 体，自来水冲洗30min，10%酒精消毒10s，无菌水冲洗2次，每次lmin，0. 1 % HgC12浸泡 4min，无菌水漂洗4遍，每次2min。沿叶片中脉垂直方向，将叶片剪成0. 5X2. Ocm2大小的 长方形，叶背向下平放于含有不同浓度NaCl的改良培养集中，6天后测量其叶片的长度变 化并于显微镜下观察杨树下表皮细胞形状、大小的变化。耐盐品种18-1杨叶片接种在含有 1. 2% NaCl的改良培养基6天后，叶片长度增加0. 5cm，其叶表皮细胞的形状比不耐盐品种 的更加规则，且更大；普通品种107杨叶片接种在1. 2% NaCl的改良培养基时，叶片不再伸 长，叶表皮细胞出现不规则收缩。说明用改良的培养基添加不同浓度的NaCl进行处理，通 过测定叶片伸长长度、观察叶表皮细胞的形状、大小变化，能够把耐盐基因型鉴别出来。
权利要求
一种快速鉴定杨树叶片耐盐潜力的改良培养基，其特点在于1)在MS培养基添加赤霉素GA-3，2)在添加赤霉素GA-3的MS培养基中添加不同浓度的NaCl。
2.根据权利要求1所述的一种快速鉴定杨树叶片耐盐潜力的改良培养基，其特征在 于在基本培养基MS培养基中，添加0. 8mg/L GA-3，再添加不同浓度的NaCl，不同NaCl浓 度为0. 8-1. 2%，得到不同NaCl浓度的改良培养基。
全文摘要
一种快速鉴定杨树叶片耐盐潜力的改良培养基，即在基本培养基MS培养基中，添加0.8mg/L GA-3，再添加不同浓度的NaCl，不同NaCl浓度为0.8-1.2％，得到不同NaCl浓度的改良培养基。使用它在杨树叶片接种中，叶片显著伸长。以中性红为染料指示剂，对杨树的叶表皮细胞进行染色，在显微镜下观察叶表皮细胞的形状和大小变化，进而确定杨树不同基因型的耐盐能力。在含有高盐浓度的改良培养基中，耐盐能力不同的杨树，其离体叶片的生长速度和表皮细胞伸长程度不同。利用改良培养基测定离体叶片的伸长速度及观察叶表皮细胞的形状和大小，能够准确判断基因型的耐盐潜力，省工省时，重复性好，具有广阔的应用前景。
文档编号A01H4/00GK101878735SQ20101019070
公开日2010年11月10日 申请日期2010年6月3日 优先权日2010年6月3日
发明者刘仲齐, 张颖, 杨迎霞 申请人:天津市农业生物技术研究中心