专利名称：假连翘提取物、假连翘杀菌微乳剂及该微乳剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种植物提取物，尤其是假连翘提取物，还涉及该提取物的用途，以及 由此提取物为组分的微乳剂。
背景技术：
目前随着人们对植物的研究开发能力逐渐加强，从植物中寻找天然活性物质并用 于病虫害防治是目前国际上农药开发的一种研究趋势。据统计，世界上至少有50万种不同 植物，其中药用植物有11020种(含种下等级1208个)，隶属2313属，383种，目前已报道 过具有控制有害生物活性的高等植物达2400余种，其中具有杀虫活性的1000多种，抗真菌 的94种，抗细菌的11种，抗病毒的17种。假连翘(Durante repens Lirm.)为马鞭草科植物，有刺或无刺，嫩枝有毛；叶片 呈卵状椭圆形或倒卵形，长2 6. 5厘米，宽1. 5 3厘米，边缘在中部以上有锯齿；花冠 呈蓝色或淡蓝紫色；果实成熟时橘黄色，有光泽。原产中、南美洲，我国华南地区广有栽培， 由于其终年翠绿，树形美观，环境适应能力较强，近年来已成为一种重要的园林绿化植物。 有研究报道假连翘的果实中含有二萜类和黄酮类化合物，有抑制凝血酶和脯氨酸基内肽酶 (PEP)的活性。但迄今为止还未发现有以假连翘植物为原料，制造植物源杀菌剂的报道。
发明内容
本发明针对不足，提出一种假连翘的提取物，利用该提取物作为植物源杀菌剂的 主要成分；同时还提出了以该提取物为主要成分的假连翘微乳剂和水乳剂，以及上述两种 乳剂的制备工艺。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案假连翘提取物，以假连翘的 茎、叶、花或果实为原料，采用有机溶剂进行提取，对提取液进行浓缩，得假连翘提取物。本发明中采用假连翘药材的不同部位，如茎、叶、花或果实，作为提取的原料，经有 机溶剂进行浸泡或其它处理方式来提取，将原料中的有效成分萃取出来，然后对提取液浓 缩，如常压或减压蒸馏，即可得到假连翘的提取物。该假连翘提取物的原料来源广泛，提取 方式简单，适宜于广泛使用和推广。本发明还提出了假连翘提取物在制备预防和治疗胡椒瘟病菌、香蕉枯萎病菌或芒 果炭疽病菌的药物中的应用。本发明又提供了采用假连翘提取物作为主要有效成分的假连翘杀菌微乳剂，由重 量百分比如下的组分构成假连翘提取物10 30%溶剂5 20%助溶剂5 10%乳化剂10 20%余量为水；
其中，所述溶剂或助溶剂选自石油醚、乙酸乙酯、丙酮、环己酮、二甲基甲酰胺、二 甲亚砜、无水乙醇、异丙醇、甲醇中的一种或几种；所述乳化剂选自聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、失水山梨醇脂肪酸酯、二苄基联 苯基聚氧乙烯醚、苯乙樟苯酚甲醛树脂聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、十二烷基苯磺酸钙 和十二烷基苯磺酸钠中的一种或几种。在上述假连翘杀菌微乳剂的基础上，本发明还提供了该微乳剂的制备方法，包括 以下步骤a、按配方称取各组分；b、将假连翘提取物加入到溶剂和助熔剂中搅拌，制成油相液体待用；c、将乳化剂和水混合均勻，在搅拌下，将步骤b中的油相液体缓慢加入水相，常温 搅拌lh后停止，静置lh，即得假连翘杀菌微乳剂。与现有技术相比，本发明的假连翘提取物对疫霉引起的病害具有较好的保护效 果，尤其对胡椒瘟病保护效果显著。该杀菌剂中的活性化合物是天然存在的物质，来源于自 然，在长期的进化过程中已形成了其固有的参与能量与物质循环代谢途径，所以施用于环 境中或植物上，无残留，不会引起生物富集；对非把靶标生物相对安全；且制造工艺简单， 原料易得，成本低廉，符合目前农药的发展趋势，具有广阔的推广应用潜力。
具体实施例方式一种假连翘提取物，以假连翘的茎、叶、花或果实为原料，采用有机溶剂进行提取， 对提取液进行浓缩，得假连翘提取物。优选的，所述原料在室温下晾5 10天后，放入55 60°C恒温箱内烘干至含水量 小于10%，粉碎。将原料进行干燥粉化，增大了原料与有机溶剂的接触面，更有利于原料中 的有效成分被提取出来。优选的，所述提取为向原料中加入5 15倍量的有机溶剂，采用水浴加热提取。为 使原料中有效成分能充分提取，有机溶剂的用量为原料重量的5 15倍体积量；采用水浴 加热能避免局部过热现象，防止原料烧糊，影响产品最终质量。优选的。所述提取分3次进行，每次提取时间分别为72小时，48小时，24小时，合 并3次提取液。采用3次提取，能有效地将有效成分尽可能地完全提取。优选的，所述有机溶剂选自石油醚、乙酸乙酯、丙酮、无水乙醇和甲醇中的一种或 多种。上述有机溶剂由于具有微毒或无毒的特性，适宜于广泛应用。下面结合具体实施例对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释 性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。实施例1假连翘提取物的制备将采自中国热带农业科学院香料饮料研究所内的新鲜假连翘，取其茎、叶、花或果 实，在室温下晾5 10天后放入55 60°C恒温烘箱内烘干，至含水率低于10%，粉碎，过 孔径60目筛，加入约10倍量(W/V)的溶剂，重复3次提取，合并提取液，经减压干燥浓缩得 假连翘提取物浸膏。上述原料还可采用假连翘的茎、叶、花和果实中的多种进行混合，操作步骤同上。1. 1提取溶剂的选择
准确称取等重量假连翘干粉样6份，分别加入10倍量(W/V)的丙酮、乙酸乙酯、无 水乙醇、甲醇、乙酸乙酯和无水乙醇(混合I)、丙酮和甲醇(混合II)，采用水浴加热提取的 方法分别提取72h，48h，24h，合并3次提取液，减压浓缩，得假连翘不同溶剂提取物，并测定 其对胡椒瘟病菌菌丝生长的抑菌活性。表1假连翘不同溶剂提取物对胡椒瘟病菌的抑菌率 结果见表1。从表1中可以看出，在供试浓度下，乙醇提取溶剂制备的假连翘提取 物对胡椒瘟病菌的抑菌率最高，为28. 62%。因此，制备假连翘提取物的提取溶剂选择无水乙醇。1. 2提取方法的筛选准确称取等重量假连翘干粉样三份，分别加入10倍量(W/V)上述筛选的溶剂，采 用水浴加热提取、超声波浸提、冷浸提三种方法制备假连翘提取物，并测定其对胡椒瘟病菌 菌丝生长的抑菌活性。表2假连翘不同提取方法对胡椒瘟病菌的抑菌率 结果见表2。从表2中可以看出，在无水乙醇为提取溶剂下采用水浴加热提取法制 备的假连翘提取物对胡椒瘟病菌的抑菌活性较好，抑菌率达到了 91.71%。因此，制备假连 翘提取物的方法选择无水乙醇水浴加热提取法。实施例2由于提取过程不同只影响假连翘的提取程度，并不影响假连翘提取物的性能，下 面就以假连翘无水乙醇提取物对供试病原菌的抑菌活性测定。2. 1对供试病原菌菌丝生长抑制活性的测定2. 1. 1供试菌株胡椒瘟病菌(Phytophthora capsici)由中国热带农业科学院香料饮料研究所植 保中心提供；香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. cubense)由中国热带农业科学院海口 实验站提供；芒果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)由中国热带农业科学院环境 与植物保护研究所提供。2. 1. 2实验方法
采用菌丝生长速率抑制法，植物提取物重复3次。具体做法为准确称取实施例1 中制备的假连翘提取物0. 5g，先用1ml无水乙醇溶解，再用无菌蒸馏水定容至10ml，制成浓 度为50mg/ml的假连翘提取物乙醇溶液。然后将培养基融化并冷却至50°C左右时，把4ml 浓度为50mg/ml的假连翘提取物乙醇溶液与36ml/瓶的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(简称为 PDA培养基)混合，摇勻后，迅速倒入3个直径为9cm的培养皿中，待其凝固后，取菌落直径 为5mm、培养好的各供试病原菌的外层菌块放置于培养皿中央，以加入等体积无水乙醇灭菌 水的PDA培养平板为对照，每个处理做3个皿重复。接种后，在人工气候培养箱(25 28°C ) 下培养5天后，采用十字交叉法分别测量菌落直径，求其平均值，按下式计算抑菌率。菌落直径(cm)=测量菌落直径平均值
抑菌率(％)＝对照菌落生长直径-处理菌落生长直径/对照菌落生长直径xlOO结果见表3。从表3可以看出，在假连翘无水乙醇提取物浓度为5mg/ml下，对胡椒 瘟病菌菌丝生长的抑菌活性最好，抑菌率达到了 86. 87% ；对香蕉枯萎病菌和芒果炭疽病菌 抑菌活性较差，抑菌率分别为30. 04%和24. 17% ；对芒果蒂腐病菌无抑菌活性。表3假连翘提取物对供试病原菌的抑菌率测定 2. 2对供试病原菌孢子萌发抑制活性的测定2. 2. 1供试孢子悬浮液由2. 1结果可以看出假连翘无水乙醇提取物对胡椒瘟病菌菌丝生长抑菌活性较 好，因此，进一步测定其对胡椒瘟病菌孢子萌发的抑制作用。首先将胡椒瘟病菌在PDA培养基上培养5天后，取边缘菌饼转接于燕麦培养基上 使其产孢，并配置孢子悬浮液备用。2. 2. 2实验方法将实施例1中制备的假连翘提取物用灭菌水稀释至2个浓度，每浓度重复3次，具 体方法为将假连翘提取物用灭菌水稀释为100mg/ml和50mg/ml，以灭菌水为空白对照，每 处理重复3次。将孢子悬浮液与供试药剂的不同浓度按1 1的比例混合均勻后，滴加1 滴于灭菌的凹玻片上，28°C培养6 12h，当空白对照的孢子萌发率达到80%以上时，在显 微镜下检查200个孢子的萌发情况，计算各供试药剂的孢子萌发抑制率。
孢子萌发擺率=对照萌发率-处理萌发率/对照萌发率x100％ 结果见表4。表4假连翘提取物对胡椒瘟病菌孢子萌发的抑制活性测定
从表4可以看出，假连翘提取物对胡椒瘟病菌孢子萌发也具有一定的抑制活性。 在浓度为10mg/ml时对孢子萌发的抑制率达到了 50%以上，为62. 89%。2. 3对胡椒瘟病菌的室内抑菌毒力测定准确称取实施例1中制备的假连翘提取物浸膏，用无水乙醇和灭菌水一定比例配 成8、6、5、4、3、2mg/ml等6个系列浓度的药液，按上述的菌丝生长速率法进行测定。实验重 复3次，建立毒力回归方程。将抑菌率转换成几率值，浓度转换成对数，进行几率值分析，求 出假连翘无水乙醇提取物对胡椒瘟病菌的抑制中浓度(EC50)。结果见表5。表5假连翘提取物对胡椒瘟病菌的室内抑菌毒力测定 从表5可以看出，假连翘无水乙醇提取物对胡椒瘟病菌的抑菌毒力较低。在相关 系数为0. 9718时，提取物对胡椒瘟病菌的EC50为1. 4951mg/ml, EC90为6. 2522mg/ml。实施例3 20%假连翘杀菌微乳剂的制备准确称取实施例1中制备的假连翘提取物浸膏20kg，溶于15kg无水乙醇和5kg 甲醇的混合溶液中，充分搅拌，然后加入20kg的乳化剂Tween-20，搅拌均勻后，在高剪切机 的作用下，逐步加入自来水40kg，在常温搅拌一定时间后停止，静置，即得20%假连翘微乳 剂。实施例4 10%假连翘杀菌微乳剂的制备准确称取实施例1中制备的假连翘提取物浸膏10kg，溶于20kg 二甲基甲酰胺和 10kg乙酸乙酯的混合溶液中，充分搅拌，然后加入20kg的乳化剂十二烷基苯磺酸钙和十二 烷基苯磺酸钠，搅拌均勻后，在高剪切机的作用下，逐步加入自来水40kg，在常温搅拌一定 时间后停止，静置，即得10%假连翘微乳剂。实施例5 30%假连翘杀菌微乳剂的制备准确称取实施例1中制备的假连翘提取物浸膏30kg，溶于10kg石油醚和5kg 二甲 亚砜的混合溶液中，充分搅拌，然后加入15kg的乳化剂苯乙樟苯酚甲醛树脂聚氧乙烯醚， 搅拌均勻后，在高剪切机的作用下，逐步加入自来水40kg，在常温搅拌一定时间后停止，静 置，即得30%假连翘微乳剂。实施例6假连翘杀菌乳剂的保护和治疗作用测定6. 1供试药剂
实施例3 5制备的假连翘杀菌微乳剂；烯酰 锰锌WP (山东圣鹏农药有限公司生产)6. 2供试作物及防治对象供试作物胡椒(Piper nigrum Linn.)，品种为印尼大叶种；防治对象胡椒癌病(Phytophthora capsici)。6. 3试验方法保护作用测定方法采摘健康、新鲜、叶龄相同的胡椒嫩叶(直径不大于9cm)，洗 净放于吸水纸上晾干；将假连翘杀菌微乳剂分别稀释为50和100倍，烯酰 锰锌WP配制成 2000和4000倍，以及不含有效成分的空白对照。先于嫩叶上施药，晾干药液后，用接种针将 3块直径为5mm的胡椒瘟病菌菌饼等距离接在叶子正面，每皿1片嫩叶，正面朝上放于培养 皿中，然后于人工气候培养箱中培养，5天后测量各处理的病斑生长直径。按下式计算保护 效果。病斑直径=测量直径-5mm
im生丨丨安,G/、对照病斑生长直径-处理病斑生长直径inn 抑制军(%) =-^㈣…T、T+ .. ^^-xlOO
对照病斑生长直径治疗作用测定方法先于嫩叶上接种菌饼，放于人工气候培养箱中培养2 3天， 测量各嫩叶上病斑生长直径dl后施药，施药后再置于培养箱中培养。培养3天后测量各处 理的病斑生长直径d2，按下式计算治疗效果。病斑直径增长量(mm)
、卢广郑里 、对照病斑直径增长量_处理病斑直径增长量 治疗效果(％):--xlOO
对照病斑直径增长量6. 4结果与分析结果见表6;表6供试药剂对胡椒瘟病菌的保护和治疗效果
8供试药剂 实施例3 实施例4
实施例5
烯酰.锰锌
WP 溶剂对照
稀释保护作用治疗作用倍数病斑直径(cm)保护效果(；％；)病斑增长量(cm)治疗效果(％)500.5577.550.937.061001.2250.201.1122.38500.4183.270.8143.361001.0357.961.0427.27500.4880.410.8639.861001.2349.801.0824.4820000100.000.3575.5240000.2291.020.5263.64一2.45一1.43一从表6可以看出，假连翘杀菌微乳剂在稀释50倍和100倍时，对胡椒瘟病的保护 作用分别达到了 77%以上和49%以上，说明假连翘杀菌微乳剂对胡椒瘟病具有较好的保 护作用。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为 本发明的保护范围。
权利要求
一种假连翘提取物，以假连翘的茎、叶、花或果实为原料，采用有机溶剂进行提取，对提取液进行浓缩，得假连翘提取物。
2.根据权利要求1所述的假连翘提取物，其特征在于所述原料在室温下晾5 10天 后，放入55 60°C恒温箱内烘干至含水量小于10%，粉碎。
3.根据权利要求1所述的假连翘提取物，其特征在于所述提取为向原料中加入5 15倍量的有机溶剂，采用水浴加热提取。
4.根据权利要求3所述的假连翘提取物，其特征在于所述提取分3次进行，每次提取 时间分别为72小时，48小时，24小时，合并3次提取液。
5.根据权利要求1、3或4所述的假连翘提取物，其特征在于所述有机溶剂选自石油 醚、乙酸乙酯、丙酮、无水乙醇和甲醇中的一种或多种。
6.假连翘提取物在制备预防和治疗胡椒瘟病菌、香蕉枯萎病菌或芒果炭疽病菌的药物 中的应用。
7.一种假连翘杀菌微乳剂，由重量百分比如下的组分构成假连翘提取物10 30%溶剂5 20%助溶剂5 10%乳化剂10 20%余量为水。
8.根据权利要求7所述的假连翘杀菌微乳剂，其特征在于所述溶剂或助溶剂选自石 油醚、乙酸乙酯、丙酮、环己酮、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、无水乙醇、异丙醇、甲醇中的一种 或几种；
9.根据权利要求7所述的假连翘杀菌微乳剂，其特征在于所述乳化剂选自聚氧乙烯 失水山梨醇脂肪酸酯、失水山梨醇脂肪酸酯、二苄基联苯基聚氧乙烯醚、苯乙樟苯酚甲醛树 脂聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、十二烷基苯磺酸钙和十二烷基苯磺酸钠中的一种或几 种。
10.一种如权利要求7所述假连翘杀菌微乳剂的制备方法，包括以下步骤a、按配方称取各组分；b、将假连翘提取物加入到溶剂和助熔剂中搅拌，制成油相液体待用；c、将乳化剂和水混合均勻，在搅拌下，将步骤b中的油相液体缓慢加入水相，常温搅拌 1小时后停止，静置1小时，即得假连翘杀菌微乳剂。
全文摘要
本发明公开了一种假连翘提取物，以假连翘的茎、叶、花或果实为原料，采用有机溶剂进行提取，对提取液进行浓缩，得假连翘提取物。该提取物再和溶剂、农药助剂配制成假连翘杀菌微乳剂。本发明的假连翘杀菌微乳剂兑水后叶面喷雾或灌根施用，使用方便，对多种热带经济作物上主要病害有较好防治效果，尤其是对胡椒瘟病保护效果突出。该制剂的活性成分是天然存在的物质，来源于自然，对人、畜无毒，无残留，对非把靶标生物相对安全，加工工艺简单，原料易得，成本低，符合目前农药发展的方向，具有良好的开发应用潜力。
文档编号A01N25/04GK101856037SQ20101021606
公开日2010年10月13日 申请日期2010年6月30日 优先权日2010年6月30日
发明者刘爱勤, 孙世伟, 李志刚, 桑利伟, 苟亚峰, 谭乐和 申请人:中国热带农业科学院香料饮料研究所