专利名称：辐射育种高产虫草素的北冬虫夏草种源的生产方法
技术领域：
本发明涉及ー种食用菌种源的生产方法，尤其涉及一种辐射育种高产虫草素的北冬虫夏草种源的生产方法。属于食用菌药用菌遗传育种领域。
背景技术：
冬虫夏草Cordyceps sinensis是我国传统的名贵药材,分布于西藏、青海、四川、甘肃、云南等地，具有特殊的药理作用和治疗功效。也是药食调补佳品。其中虫草素是最独特而重要的药物成分。近年来由于人类活动范围的扩大，生态环境的恶化，导致野生冬虫夏草持续減少， 价格也持续飙升。到2010年优质虫草已经销售到16万元/公斤(干)。为解决冬虫夏草资源紧缺问题，人们很早就开始关注蛹虫草，从1986年起，人们把野生蛹虫草采集回来，通过组织分离获得菌种，20多年里，蛹虫草栽培获得重大技术突破。目前它已经成为冬虫夏草的最佳替代品。全世界已知虫草类有350余种，我国目前有62种，但最为昂贵的只有冬虫夏草和蛹虫草。北虫草即蛹虫草Cordycepsmilitaris (L. ) Link、又称之北冬虫夏草,它是虫草属中两个模式种之一。2007年我国正式将北虫草列为新资源食品。它被认为是目前唯一能替代冬虫夏草的虫草属真菌。北虫草在世界上广泛分布，它能够寄生在多种鳞翅目昆虫的幼虫及其蛹体上，在我国各地分布较广，主要分布剥蚀丘陵地帯、海抜50-400米之间、气候属于北温帯、半湿润大陆性气候、毎年只有林区在郁闭、避风的地段才能有北虫草集中发生，而传统的冬虫夏草主产于我国青海、云贵高原的横断山区及祁连山等海抜4500-5000 米以上的高原灌丛或草甸地带、寄生在冻土层中的蝙蝠蛾幼虫体上，遗憾的是对于这种名贵中药材至今未能实现有效的子实体人工培养及规模化生产，但是国内外对已经成为诱发虫草子实体的种类研究认为，北虫草食用和药用价值可与传统的冬虫夏草媲美，它不仅在药效成分种类上与传统冬虫夏草相近外，而且是在已报道的350余种虫草菌中唯一能大量形成虫草素的种，因此它与传统冬虫夏草一祥，能滋补人体，而且能有效地抑制肿瘤和病毒，并具有多种药理功能，是传统冬虫夏草的最理想代用品，但野生的北冬虫夏草与传统的冬虫夏草一祥，在自然界中稀少，价格昂贵，因此，人工培育具有自然形态的北冬虫夏草子实体，意义重大，经济效益显著！虫草素是虫草属药用真菌中独有的药物成分，是ー种核苷类抗生素，具有较好的抗病毒功能；能抑制枯草杆菌，鸟结核杆菌和艾氏腹水癌细胞，并对KB细胞培养和Hep#2 细胞有毒性作用，可影响mRNA的形成以至蛋白质的合成，这ー机制与虫草素抗肿瘤有夫， 1997年美国已将虫草素用于一期临床试验，治疗急性前B和前T淋巴细胞白血病患者；同时，虫草素还表现出极强的抗真菌，抗HIV-I型病毒和选择性抑制梭菌属细菌活性。经检测人工栽培的北虫草富含虫草素，其含量高于冬虫夏草。目前北虫草的人工栽培技术已经相当成熟，但在如何提高北虫草内在品质方面尚有大量工作需要去做，其中如何提高北虫草内虫草素含量就是ー个重要课题。资料显示，目前科技工作者在提高虫草素方面主要是通过向培养基中添加一定数量的蛋白源，但这种做法提高幅度有限，从2008年起，我们主要通过培育北虫草新品种来提高虫草素含量，具体做法就是对现有虫草种源进行辐射育种，再通过液相色谱检测法筛选虫草素产率高的新菌株。本专利所提及的高产虫草素北虫草新菌株ycc Gy 1016的生产方法就是在上述背景下选育而成。批量多次重复的栽培结果表明，在相同栽培培养基和管理条件下，采用ycc Gy 1016和ycc-01两个不同品种进行栽培，所获得的虫草干品中虫草素含量差异明显，与种源本身产生虫草素能力成正相关。
发明内容
本发明为了解决目前为提高北虫草的虫草素含量，所采用的通过向培养基中添加一定数量的蛋白源其提高幅度有限，效果不理想的技术问题，提供一种辐射育种高产虫草素的北冬虫夏草种源的生产方法，通过低剂量铯137放射性元素辐射后筛选获得，定名为 ycc Gy 1016 ;具体生产方法是通过下述步骤实现的I)选择目前生产中广泛使用的北虫草品种ycc-01作为辐射育种的出发菌株；2) ycc-01培养基配方葡萄糖20克、蛋白胨5克、酵母浸粉3克、磷酸ニ氢钾3克、 硫酸镁2克、复合维生素100毫克及蒸馏水1000毫升，按常规方法生产液体种源；3)按常规方法制备加富PDA培养基，取直径10厘米培养皿同步高压灭菌，倒平板、 冷却后涂布稀释1000-3000倍的含有分生孢子的液体种源菌液0. 1-0. 5毫升，均匀涂布于平板上，在18-25°C避光定植培养24-36小时，然后转入辐射处理；4)辐射源选择低剂量铯137，剂量50Gy-500Gy，距离30cm，照射2_300s，照射后在 20°C暗培养2-7天，然后转入光照培养，光照强度4000-6000勒克斯，培养时间2_4天，然后根据菌落生长形态进行菌落筛选；5)菌落筛选，在宏观层面，选择菌落生长正常，边缘整齐、菌丝不徒长，菌丝转色深的菌落；在微观层面通过显微镜进行观察，选择菌丝粗细均匀、细胞核数量多、菌丝分枝适度、分生孢子着生呈念珠状态，选择符合上述要求的菌落挑取保存；6)将挑取菌落进行编号，按常规方法扩繁母种和液体菌种，并进行栽培对出草正常，子实体形态正常、产量高的菌落制备液体菌种，培养基配方为葡萄糖20克，蛋白胨5 克，酵母浸粉3克，磷酸ニ氢钾3克，硫酸镁2克，蒸馏水1000毫升，以出发菌株ycc-01为对照，常规培养后测定菌丝体中虫草素含量和液体培养基中虫草素含量；7)经过检测，对虫草素含量高菌落进行提纯、复壮；按常规制备液体菌种，按每瓶鲜蚕蛹10个、干小麦20克、饮用水30毫升，灭菌后接种，按常规培养，待出草后选子实体形态好的，进行组织分离获取种源；8)对选择出的产生虫草素高的组织分离种源进行遗传稳定性评价实验，最后筛选得到一株高产虫草素的新菌株，定名为ycc Gy 1016新菌株。本发明的特点及有益效果ycc Gy 1016菌株与出发菌株ycc-01相比,在出草方面形态正常，产量性状在0. 05水平比较差异不显著，虫草素产率在0. 05水平比较，差异达到显著水平。经检测菌株ycc Gy 1016产生虫草素能力是出发菌株ycc-01的3. 8倍。这一成果对于人工生产功能性北虫草具有重要价值，应用前景广阔。具体結果ycc Gy 1016菌株生物转化率为5. 62克(干)/45克小麦，出发菌株ycc-01生物转化率为5. 68克(干)/45克小麦；yCC Gy 1016菌株虫草素产率481. 6毫克 /公斤，ycc-01菌株虫草素产率126. 3毫克/公斤。
图lyCCGyl016和YCC-01菌种转代次数对子实体产量的影响曲线2虫草素标准曲线3转代次数对yCCGyl016和YCC-Ol菌种虫草素含量曲线图
具体实施例方式辐射育种高产虫草素的北冬虫夏草种源的生产方法，通过低剂量铯137放射性元素辐射后筛选获得，定名为..ice Gy 1016 ;具体生产方法是通过下述步骤实现的I)选择目前生产中广泛使用的北虫草品种ycc-01作为辐射育种的出发菌株；2) ycc-01培养基配方葡萄糖20克、蛋白胨5克、酵母浸粉3克、磷酸ニ氢钾3克、 硫酸镁2克、复合维生素100毫克及蒸馏水1000毫升，按常规方法生产液体种源；3)按常规方法制备加富PDA培养基，取直径10厘米培养皿同步高压灭菌，倒平板、 冷却后涂布稀释1000-3000倍的含有分生孢子的液体种源菌液0. 1-0. 5毫升，均匀涂布于平板上，在18-25°C避光定植培养24-36小时，然后转入辐射处理；4)辐射源选择低剂量铯137，剂量50Gy_500Gy，距离30cm，照射2_300s，照射后在 20°C暗培养2-7天，然后转入光照培养，光照强度4000-6000勒克斯，培养时间2_4天，选择菌落生长正常，菌丝不徒长，菌丝转色深的菌落，挑取保存；5)菌落筛选，在宏观层面，选择菌落生长正常，边缘整齐、菌丝不徒长，菌丝转色深的菌落；在微观层面通过显微镜进行观察，选择菌丝粗细均匀、细胞核数量多、菌丝分枝适度、分生孢子着生呈念珠状态，选择符合上述要求的菌落挑取保存；6)将挑取菌落进行编号，按常规方法扩繁母种和液体菌种，并进行栽培对出草正常，子实体形态正常、产量高的菌落制备液体菌种，培养基配方为葡萄糖20克，蛋白胨5 克，酵母浸粉3克，磷酸ニ氢钾3克，硫酸镁2克，蒸馏水1000毫升，以出发菌株ycc-01为对照，常规培养后测定菌丝体中虫草素含量和液体培养基中虫草素含量；7)经过检测，对虫草素含量高菌落进行提纯、复壮；按常规制备液体菌种，按每瓶鲜蚕蛹10个、干小麦20克、饮用水30毫升，灭菌后接种，按常规培养，待出草后选子实体形态好的，进行组织分离获取种源；8)对选择出的产生虫草素高的组织分离种源进行遗传稳定性评价实验，最后筛选得到一株高产虫草素的新菌株，定名为ycc Gy 1016新菌株。其中所述遗传稳定性评价实验，指按如下步骤程序操作，至少连续栽培3个批次，来确认种源种性的稳定性。 I)采用马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨3g，酵母膏2g，磷酸ニ氢钾2g，硫酸镁lg， 水IOOOmL配方按常规繁育生产用液体菌种。2)采用750毫升的玻璃罐头瓶为容器，每瓶45克小麦，加水70毫升，I. 05公斤/ 平方厘米压カ灭菌60分钟，冷却接种。3)菌瓶先放于20°C避光培养6天，然后转入光暗交叉培养，每天白天以4000勒克斯强度光照，晚上暗培养，环境湿度85%，每天通风3次。4)整个生产周期60天，子实体长度控制在8-12厘米，其它按常规操作，每批采用后抽样测定产量和虫草素含量。实施例I本专利申请保护的是ー株能够提高虫草素含量的北虫草新品种的生产方法。该品种是通过低剂量铯137放射性元素辐射后筛选获得，定名为yCC Gyl016。具体实现步骤是首先选择目前生产中广泛使用的北虫草品种ycc-01作为辐射育种的出发菌株；将ycc-01利用如下培养基配方葡萄糖20克、蛋白胨5克、酵母浸粉3克、磷酸 ニ氢钾3克、硫酸镁2克、复合维生素100毫克及蒸馏水1000毫升，按常规方法生产液体种源；再按常规方法制备加富PDA培养基，取直径10厘米培养皿同步高压灭菌，倒平板、 冷却后涂布稀释2500倍的含有分生孢子的液体种源菌液0. 3毫升，均匀涂布于平板上，在 18-25°C避光定植培养24-36小时，然后转入辐射处理；辐射源选择低剂量铯137，剂量50Gy，距离30cm，照射300s，照射后在20°C暗培养 7天，然后转入光照培养，光照強度4000勒克斯，培养时间4天，选择菌落生长正常，菌丝不徒长，菌丝转色深的菌落，挑取保存；进行菌落筛选，在宏观层面，选择菌落生长正常，边缘整齐、菌丝不徒长，菌丝转色深的菌落；在微观层面通过显微镜进行观察，选择菌丝粗细均匀、细胞核数量多、菌丝分枝适度、分生孢子着生呈念珠状态，选择符合上述要求的菌落挑取保存；将挑取菌落进行编号，按常规方法扩繁母种和液体菌种，并进行栽培对出草正常， 子实体形态正常、产量高的菌落制备液体菌种，培养基配方为葡萄糖20克，蛋白胨5克，酵母浸粉3克，磷酸ニ氢钾3克，硫酸镁2克，蒸馏水1000毫升，以出发菌株ycc-01为对照， 常规培养后測定菌丝体中虫草素含量和液体培养基中虫草素含量；其虫草素測定方法采用高效液相色谱法。经过检测，对虫草素含量高菌落进行提纯、复壮；按常规制备液体菌种，按每瓶鲜蚕蛹10个、干小麦20克、饮用水30毫升，灭菌后接种，按常规培养，待出草后选子实体形态好的，进行组织分离获取种源。对选择出的产生虫草素高的组织分离种源进行遗传稳定性评价实验，最后筛选得到一株高产虫草素的新菌株，定名为ycc Gy 1016新菌株。所述遗传稳定性评价实验，指按如下步骤程序操作，至少连续栽培3个批次，来确认种源种性的稳定性。I)采用马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨3g，酵母膏2g，磷酸ニ氢钾2g，硫酸镁lg， 水IOOOmL配方按常规繁育生产用液体菌种。2)采用750毫升的玻璃罐头瓶为容器，每瓶45克小麦，加水70毫升，I. 05公斤/ 平方厘米压カ灭菌60分钟，冷却接种。3)菌瓶先放于20°C避光培养6天，然后转入光暗交叉培养，每天白天以4000勒克斯强度光照，晚上暗培养，环境湿度85%，每天通风3次。4)整个生产周期60天，子实体长度控制在8-12厘米，其它按常规操作，每批采用后抽样测定产量和虫草素含量。经检测ycc Gy 1016菌株与出发菌株ycc-01相比，在出草方面形态正常，产量性状在0. 05水平比较差异不显著，虫草素产率在0. 05水平比较，差异达到显著水平。具体结果yCC Gy 1016菌株生物转化率为5. 62克(干)/45克小麦，出发菌株ycc-01生物转化率为5. 68克(干)/45克小麦；ycc Gy 1016菌株虫草素产率481. 6毫克/公斤，ycc-01菌株虫草素产率126. 3晕克/公斤。实施例2辐射育种高产虫草素的北冬虫夏草种源的生产方法，首先选择目前生产中广泛使用的北虫草品种ycc-01作为辐射育种的出发菌株；将ycc-01利用如下培养基配方葡萄糖20克、蛋白胨5克、酵母浸粉3克、磷酸 ニ氢钾3克、硫酸镁2克、复合维生素100毫克及蒸馏水1000毫升，按常规方法生产液体种源；再按常规方法制备加富PDA培养基，取直径10厘米培养皿同步高压灭菌，倒平板、 冷却后涂布稀释3000倍的含有分生孢子的液体种源菌液0. 3毫升，均匀涂布于平板上，在 18-25°C避光定植培养24-36小时，然后转入辐射处理；辐射源选择低剂量铯137，剂量500Gy，距离30cm，照射2s，照射后在20°C暗培养6 天，然后转入光照培养，光照強度5000勒克斯，培养时间3天，选择菌落生长正常，菌丝不徒长，菌丝转色深的菌落，挑取保存；其他同实施例I实施例3辐射育种高产虫草素的北冬虫夏草种源的生产方法，首先选择目前生产中广泛使用的北虫草品种ycc-01作为辐射育种的出发菌株；将ycc-01利用如下培养基配方葡萄糖20克、蛋白胨5克、酵母浸粉3克、磷酸 ニ氢钾3克、硫酸镁2克、复合维生素100毫克及蒸馏水1000毫升，按常规方法生产液体种源； 再按常规方法制备加富PDA培养基，取直径10厘米培养皿同步高压灭菌，倒平板、 冷却后涂布稀释3000倍的含有分生孢子的液体种源菌液0. 3毫升，均匀涂布于平板上，在 18-25°C避光定植培养24-36小时，然后转入辐射处理；辐射源选择低剂量铯137，剂量200Gy，距离30cm，照射200s，照射后在20°C暗培养 5天，然后转入光照培养，光照強度6000勒克斯，培养时间2天，选择菌落生长正常，菌丝不徒长，菌丝转色深的菌落，挑取保存；其他同实施例I。下面的实验是对北虫草诱变菌株yCCGyl016遗传稳定性及产生虫草素能力的评价实验ー北虫草诱变菌株ycc Gy 1016遗传稳定性评价I. I遗传稳定性试验由于诱变菌株在连续继代培养时的性状常常不稳定，所以要对钴60辐射诱变处理后得到的菌株进行遗传稳定性试验。将诱变菌株yccGyl016和对照原始菌株YCC-Ol — 起在PDA斜面上连续转接10代，每代均进行栽培试验，结果见表I、表2。
权利要求
1.辐射育种高产虫草素的北冬虫夏草种源的生产方法，通过低剂量铯137放射性元素辐射后筛选获得，定名为ycc Gy 1016 ;具体生产方法是通过下述步骤实现的1)选择目前生产中广泛使用的北虫草品种ycc-01作为辐射育种的出发菌株；2)ycc-01培养基配方葡萄糖20克、蛋白胨5克、酵母浸粉3克、磷酸ニ氢钾3克、硫酸镁2克、复合维生素100毫克及蒸馏水1000毫升，按常规方法生产液体种源；3)按常规方法制备加富PDA培养基，其配方为马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蛋白胨3g，酵母膏2g，磷酸ニ氢钾2g，硫酸镁lg，水IOOOmL ;取直径10厘米培养皿同步高压灭菌，倒平板、冷却后涂布稀释1000-3000倍的含有分生孢子的液体种源菌液0. 1-0. 5毫升， 均匀涂布于平板上，在18-25°C避光定植培养24-36小时，然后转入辐射处理；4)辐射源选择低剂量铯137，剂量50Gy-500Gy，距离30cm，照射2_300s，照射后在20°C 暗培养2-7天，然后转入光照培养，光照强度4000-6000勒克斯，培养时间2_4天，然后根据菌落生长形态进行菌落筛选；5)菌落筛选，在宏观层面，选择菌落生长正常，边缘整齐、菌丝不徒长，菌丝转色深的菌落；在微观层面通过显微镜进行观察，选择菌丝粗细均匀、细胞核数量多、菌丝分枝适度、分生孢子着生呈念珠状态，选择符合上述要求的菌落挑取保存；6)将挑取菌落进行编号，按常规方法扩繁母种和液体菌种，并进行栽培，对出草正常， 子实体形态正常、产量高的菌落制备液体菌种，培养基配方为葡萄糖20克，蛋白胨5克，酵母浸粉3克，磷酸ニ氢钾3克，硫酸镁2克，蒸馏水1000毫升，以出发菌株ycc-01为对照， 常规培养后測定菌丝体中虫草素含量和液体培养基中虫草素含量；7)经过检测，对虫草素含量高菌落进行提纯、复壮；按常规制备液体菌种，按每瓶鲜蚕蛹10个、干小麦20克、饮用水30毫升，灭菌后接种，按常规培养，待出草后选子实体形态好的，进行组织分离获取种源；8)对选择出的产生虫草素高的组织分离种源进行遗传稳定性评价实验，最后筛选得到一株高产虫草素的新菌株，定名为ycc Gy 1016新菌株。
2.根据权利要求I所述的辐射育种高产虫草素的北冬虫夏草种源的生产方法，其特征在于所述遗传稳定性评价实验，指按如下步骤程序操作，至少连续栽培3个批次，来确认种源种性的稳定性；1)采用马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨3g，酵母膏2g，磷酸ニ氢钾2g，硫酸镁化，水 IOOOmL配方按常规繁育生产用液体菌种；2)采用750毫升的玻璃罐头瓶为容器，每瓶45克小麦，加水70毫升，I.05公斤/平方厘米压カ灭菌60分钟，冷却接种；3)菌瓶先放于20°C避光培养6天，然后转入光暗交叉培养，每天白天以4000勒克斯强度光照，晚上暗培养，环境湿度85%，每天通风3次；4)整个生产周期60天，子实体长度控制在8-12厘米，其它按常规操作，每批采用后抽样测定产量和虫草素含量。
全文摘要
辐射育种高产虫草素的北冬虫夏草种源的生产方法，是为了解决目前为提高北虫草的虫草素含量，所采用的通过向培养基中添加一定数量的蛋白源其提高幅度有限，效果不理想的技术问题而设计的。该方法通过辐射、诱变和筛选实现培育目标菌株的目的。目标菌株yccGy1016是通过对出发菌株ycc-01进行特点参数的辐射处理和对变异菌落的筛选纯化，以及对产生虫草素指标的科学检测和栽培稳定性的评价，最后获得该专利所提及的高产虫草素北虫草新菌株的生产方法。经检测菌株ycc Gy 1016产生虫草素能力是出发菌株ycc-01的3.8倍。这一成果对于人工生产功能性北虫草具有重要价值，应用前景广阔。
文档编号A01G1/04GK102599005SQ20111002281
公开日2012年7月25日 申请日期2011年1月20日 优先权日2011年1月20日
发明者刘诗扬, 徐方旭, 李锋, 王俊伟, 王升厚, 董忠生 申请人:沈阳师范大学