专利名称：基于微阀的秀丽隐杆线虫长期培养及双检测微流控芯片的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及微流控芯片，特别提供了一种基于微阀的秀丽隐杆线虫长期培养及双检测微流控芯片。
背景技术：
现有技术中，微流控芯片(microfluidic chip)又称芯片实验室(lab on achip)，指的是把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，用以取代常规生物或化学实验室的各种功能的一种技术。它的基本特征和最大优势是多种单元技术在微小平台上的灵活组合和规模集成。发展至今，微流控芯片技术已经开始在生命科学的不同领域得到应用，并已成为系统生物学研究中的重要技术平台之一。同时，秀丽隐杆线虫以其生命周期和寿命短、全身透明、全基因组测序等特征，成为生物学研究领域中常用的一种重要模式生物。最近，微流控芯片因其与秀丽隐杆线虫尺寸匹 配、环境可控、通量高、易于实现自动化、集成化等特征而成为线虫相关研究的重要平台。在很多生物研究中，人们期待或者一种单个线虫长期培养及观察的简易平台。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单、通量高的秀丽隐杆线虫单个分析的微流控芯片平台，具体说是一种基于微阀的秀丽隐杆线虫长期培养及运动成像双检测的PDMS (聚二甲基硅氧烷)微流控芯片平台。本发明提供了一种用于线虫长期培养及双检测的微流控芯片平台，基于微阀，对线虫进行操控，其特征在于该芯片由三层组成，材料均为PDMS聚合物，采用PDMS软刻蚀及不可逆封接技术构建，上层为用于线虫培养及固定的液路层，中间层为用于线虫固定的可形变PDMS膜，下层为提供用以PDMS膜形变的气压的气路控制层。其中液路层由2(T50个线虫分析功能单元组成，所有功能单元共用一个中心废液池；每个分析功能单元由虫及药品入口、进样通道、线虫固定及培养室、废液通道组成；虫及药品入口通过进样通道与线虫固定及培养室连接，然后通过废液通道连接到与其它分析功能单元共用的中心废液池；
所述气路控制层的气路通道中设有阀A和阀B，阀A位于进样通道的中间位置下方，用于控制单个虫进入培养室中；阀B在线虫固定及培养室下方，用于进行线虫固定。本发明提供的基于微阀的秀丽隐杆线虫长期培养及双检测微流控芯片，其特征在于所述线虫固定及培养室的尺寸为2 _ X 1_ X80 Pm。本发明提供的基于微阀的秀丽隐杆线虫长期培养及双检测微流控芯片，其特征在于所述阀A由真空负压驱动，阀B由气体正压驱动。本发明提供的基于微阀的秀丽隐杆线虫长期培养及双检测微流控芯片，其特征在于所述阀A宽度为250 Pm，阀B宽度为2 mm。
本发明提供的基于微阀的秀丽隐杆线虫长期培养及双检测微流控芯片，其线虫及药品进样方式为利用负压驱动的方式，将单个虫引入培养室，培养室的尺寸(2 mm X ImmX 80 )可使其自由游动；荧光成像时利用气压使PDMS膜形变，将虫体压在通道侧壁上使其固足并成像；每天进行三次物质交换，目的为添加新鲜食物，排出线虫代谢废物，方式为负压抽取。本发明提供的基于微阀的秀丽隐杆线虫长期培养及双检测微流控芯片，其阀的操控方法如下当虫进入进样通道并到达阀A处时，利用真空将阀A下的PDMS膜吸起，虫通过进样通道进入培养室后释放真空，关闭阀A，利用尺寸限制虫的运动范围，防止进入培养室中的虫游出；当成像时利用正压将阀B下的PDMS膜压下，使虫体被压在通道侧壁上，实现虫的固定并进行荧光成像，成像后释放线虫，使其恢复自由运动状态。本发明采用通道设计，操作简单，且易于实现物质交换，有利于线虫的长期培养；线虫固定方法采用膜形变的方式，对虫体安全无害，可对单个线虫进行长期培养及运动、成像双检测。
本发明有以下优点
(I)采用通道灌流的方式进行食物添加及废液排出，操作简单，效率高，有利于线虫的长期培养。(2)培养室同样作为线虫固定成像通道，且虫的固定方式对虫体无损伤，方法简
单，通量高。(3)单个培养室中培养单个线虫的设计使得每只虫的寿命、运动行为及荧光特征得到实时及长期追踪，可满足生物研究的需要。
图I芯片三层设计图，从上到下依次为液路层、PDMS膜、气路控制层；其中7为中心废液池；
图2单元放大图，I为虫及药品入口，2为进样通道，3为线虫固定及培养室，4为废液通道，5为阀A，6为阀B;
图3线虫进样录像截 图4芯片上线虫(野生型N2)的生长；
图5芯片上线虫(野生型N2)的存活率曲线；
图6芯片上线虫(野生型N2)的摆动频率曲线；
图7不同因素对线虫(突变株CL2166)寿命的影响；
图8不同因素对线虫(突变株CL2166)运动行为的影响(第3天)；
图9不同因素对线虫(突变株CL2166)运动行为的影响(第5天)；
图10不同因素对线虫(突变株CL2166)运动行为的影响(第7天)；
图11不同因素对线虫(突变株CL2166)荧光特征的影响。
具体实施例方式实验室自行设计并制作的微流控芯片制备基于微阀的秀丽隐杆线虫长期培养及运动、荧光成像双检测微流控芯片的材料为PDMS聚合物，热不可逆封接，该芯片由三层组成，上层为液路层，中间层PDMS膜，下层气路控制层(如图I所示)。
其中液路层由30个线虫分析功能单元组成，所有功能单元共用一个中心废液池7(图I);每个分析功能单元由虫及药品入口 I、进样通道2、线虫固定及培养室3 (尺寸为2mm X Imm X80 pm )、废液通道4组成(图2);虫及药品入口 I通过进样通道2与线虫固定及培养室3连接，然后通过废液通道4通向与其它分析功能单元共用的中心废液池7 ;气路控制层的气路通道中设有阀A5 (宽度为250 ^m)和阀B6 (宽度为2 mm)，阀A5位于进样通道2的中间位置下方，由真空负压驱动，用于在制单个虫进入培养室中；_B6在线虫固定及培养室3下方，由气体正压驱动，用于进行线虫固定。使用前事先灌好线虫培养液K Medium。秀丽隐杆线虫野生型虫株N2及突变型虫株CL2166琼脂板上培养至大虫后，进行bleach操作将大量卵取出，并使其孵化，长至L4期。实施例I
利用实验室自行设计并制作的微流控芯片系统，构型如图1、2所示，将L4期线虫进样到培养室中，具体过程如图3。芯片共30个单元，利用负压将虫子进样到培养室中，并且同样利用负压将多余的线虫抽出培养室。各个单元相互独立，进样互不干扰，可达到单个培养室都只有单条虫。实施例2
利用实验室自行设计并制作的微流控芯片系统，将线虫野生型N2拟合至幼虫L4期后引入芯片中培养，线虫在K Medium培养基中逐渐长大，见图4。经过培养，N2在芯片上的平均寿命为9天(图5)，摆动频率曲线见图6。线虫在芯片上寿命、运动、产卵等生理行为正常，显示该芯片微环境适于线虫长期培养，验证了该平台可行性。实施例3
利用实验室自行设计并制作的微流控芯片系统，研究不同因素对线虫寿命、运动及荧光特征的影响
采用带有氧化应激绿色荧光蛋白(GFP)表达的线虫突变型虫株CL2166进行相关实验，当外界因素致氧化应激产生时，GFP表达增强。实验中施加六种条件对照组、Cu2+、VE、VE+Cu2\PD (白藜芦醇苷)、ro+cu2+。每种试剂作用时间均为一天，观察线虫存活状态，并与对照组进行对比。实验发现虫株CL2166对照组的平均寿命为9天，在一定浓度下，Cu2+使线虫寿命 明显缩短(7天)，而VE和PD可延长线虫寿命(平均寿命分别为11天和13天)并可部分修复Cu2+带来的寿命缩短效应(平均寿命分别为8. 5天和11天)，比VE的效果更加显著(如图7所示)。研究还发现，这些因素对线虫运动频率的影响与其对寿命的影响结果相似(图8-10)。进一步的研究发现，Cu2+使线虫氧化应激显著增强即加重了线虫体内的氧化环境，而ro可减弱线虫体内的氧化水平，而相应的VE则不能在正常条件下降低氧化应激(图11)，两者均使Cu2+导致升高的体内氧化水平恢复到正常水平(图11)。
权利要求
1.基于微阀的秀丽隐杆线虫长期培养及双检测微流控芯片，其特征在于所述芯片由三层组成，上层为用于线虫培养及固定的液路层，中间层为可形变PDMS膜，下层为气路控制层； 其中液路层由2(Γ50个线虫分析功能单元组成，所有功能単元共用ー个中心废液池；每个分析功能単元由虫及药品入口、进样通道、线虫固定及培养室、废液通道组成；虫及药品入口通过进样通道与线虫固定及培养室连接，然后通过废液通道连接到与其它分析功能单元共用的中心废液池； 所述气路控制层的气路通道中设有阀A和阀B，阀A位于进样通道的中间位置下方，阀B在线虫固定及培养室下方。
2.按照权利要求I所述基于微阀的秀丽隐杆线虫长期培养及双检测微流控芯片，其特征在于所述线虫固定及培养室的尺寸为2 _ X 1_ Χ80 μιη。
3.按照权利要求I所述基于微阀的秀丽隐杆线虫长期培养及双检测微流控芯片，其特征在于所述阀A由真空负压驱动，阀B由气体正压驱动。
4.按照权利要求3所述基于微阀的秀丽隐杆线虫长期培养及双检测微流控芯片，其特征在于所述阀A宽度为250 μηι，阀B宽度为2 mm。
5.按照权利要求I所述基于微阀的秀丽隐杆线虫长期培养及双检测微流控芯片，其特征在于所述芯片的材料均为PDMS聚合物，采用PDMS软刻蚀及不可逆封接技术构建。
6.按照权利要求I所述基于微阀的秀丽隐杆线虫长期培养及双检测微流控芯片，其特征在于线虫进样及培养方法为利用负压驱动的方式，将单个虫引入培养室，培养室的尺寸可使其自由游动；荧光成像时利用气压使PDMS膜形变，将虫体压在通道侧壁上使其固定并成像。
全文摘要
本发明提供了一种基于微阀的秀丽隐杆线虫长期培养及运动、荧光成像双检测微流控芯片平台，该芯片由三层PDMS组成，上层为液路层，用于线虫长期培养及观测；下层为气路控制层，用于提供操控微阀所需气压；上下两层中间为PDMS膜，膜在气压作用下发生形变以实现线虫固定。所述的微流控芯片平台的线虫培养方法操作简单，易于实现，该芯片可以实现营养物质的交换及代谢废物的排出，有利于线虫的长期培养，并可对单个线虫进行行为及成像的长期观察。
文档编号A01K67/033GK102669058SQ20111006549
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月18日 优先权日2011年3月18日
发明者温慧, 秦建华 申请人:中国科学院大连化学物理研究所