专利名称：一种与植物抗低温相关的miRNA——gma-miR169c及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种与植物抗低温相关的miRNA，尤其是一种来源于大豆的、能够调节大豆抗低温性的miRNA ；本发明还涉及此miRNA的前体及用途。
背景技术：
大豆是非常重要的、具有特殊经济价值的作物。低温等环境胁迫对大豆的生长发育具有重要影响，严重时会造成大豆大规模减产。解析大豆抵抗低温的分子机制，培育耐低温的大豆品种是目前大豆种植业的主要目标之一。目前，应用基因工程育种已经成为增强作物耐低温性的重要手段。高等植物在应答低温胁迫时启动了多种应答网络，研究表明， microRNA (miRNA)在其中也具有非常重要的作用。miRNA是近年来研究发现的一种长20 24 nt的内源性非蛋白编码RNA。miRNA 基因最初转录产生具有颈环结构的pre-miRNAs。随后pre-miRNA被转运出核，在细胞质中被Dicer酶作用，加工成成熟的miRNA。通过序列互补与特定靶基因的mRNA结合，引起mRNA 降解或抑制mRNA翻译从而对基因的表达起到负调节作用(Llave et al. , 2002; Palatnik et al. , 2003; Tang et al. , 2003)。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种与植物抗低温相关的miRNA及其前体序列， 利用此miRNA能够提高大豆的抗低温性，对提高大豆产量具有重大的意义。为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。一种与植物抗低温相关的miRNA，其具有序列表中SEQ ID NO 1所示的序列。上述与植物抗低温相关的miRNA的前体序列，其具有序列表中SEQ ID NO 2所示的序列。上述与植物抗低温相关的miRNA在培育抗低温转基因植物中的应用。作为上述应用的一种优选技术方案，所述抗低温转基因植物为大豆。作为上述应用的一种优选技术方案，在大豆中过表达SEQ ID NO :1所示的miRNA， 或抑制SEQ ID NO 1所示miRNA的表达，培育出具有高抗低温性的转基因大豆。采用上述技术方案所产生的有益效果在于本发明miRNA的表达受到低温胁迫的调节，说明其在大豆适应低温胁迫机制中起重要作用，基于此，可利用其培育具有高抗低温性的转基因大豆，对提高大豆产量具有重大的意义。
图1为gma-miR169C前体序列的茎环结构图，可见其前体序列折叠成一种稳定的茎环结构，属于miRNA前体典型的二级结构，符合miRNA前体的结构特征。图2为低温胁迫条件下gma-miR169C在根及根瘤中的表达特征的定量PCR结果。
图3为用大豆毛状根转化体系检测到的gma-miR169C在大豆根中对低温胁迫的响应。
具体实施例方式以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验， 结果取平均值。实施例1、实时荧光定量PCR分析gma-miR169C在低温胁迫下的表达特性一、胁迫处理
胁迫根瘤材料按照以下流程进行WilimaS82大豆种子用70%的洒精灭菌30 S，dH20 冲洗6遍后播种于无菌培养皿中，皿底置2张无菌滤纸，dH20浸湿，28 °C暗萌发3天。芽长至2 cm时，移至放有湿润滤纸的试管中，芽长至4 5 cm，移至活化的根瘤菌菌液中，接种30 min，低N水培，10，000 lux，温度为26 °C，相对湿度为70%，培养28天，胁迫处理，取根瘤。低温处理4°C处理24小时后取根瘤，于液氮速冻，-80°C保存备用。二、miRNA 的分离
取根瘤，用microRNA提取试剂盒(百泰克公司)(Cat # RP5301)提取小片段RNA，提取方法如下
(1)勻浆处理
根瘤用液氮内研钵快速磨碎，每50 100 mg组织加1 ml裂解液后勻浆。(2)将勻浆样品剧烈震荡混勻，在15 -30 °C条件下孵育5 min以使核蛋白体完全分解。(3)4 ！的条件下12，000 rpm离心10 min，小心取上清转入一个新的RNase free的离心管中。当样品富含蛋白质、脂肪、多糖时，可离心10 min，移除勻浆中不溶解的物质，余下的沉淀中包含有细胞外膜、多糖、以及高分子量DNA，而上层的超浮游物含有RNA。(4)每1 ml裂解液加0. 2 ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡15 s并将其在室温下孵育3min。(5)样品于4 V 12，000 rpm离心10 min，会分成三层下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加裂解液体积的60%，把水相转移到新管中，进行下一步操作。(6)加入0. 6倍体积70%乙醇，颠倒混勻(此时可能会出现沉淀)。得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中。(7)10, 000 rpm离心45 s，收集下滤液(下滤液中含有microRNA)，准确估计下滤液的体积(准确性非常重要)，加入2/3倍体积的无水乙醇，颠倒几次混勻，将混合液倒入到吸附柱RB中，10，000 rpm离心30 s弃掉废液。(8)加入700 μ 1漂洗液RW，12，000 rpm离心60 s，弃掉废液。(9)加入500 μ 1漂洗液RW，12，000 rpm离心60 s，弃掉废液。(10)将吸附柱RB放回空收集管中，12，000 rpm离心2 min，尽量除去漂洗液，以
免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
(11)取出吸附柱RB，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜中间部位加60-80 μ 1 RNase free water(事先在65-70 °C水浴中加热)，室温放置2 min， 然后12，000 rpm离心1 min。收集得到纯净microRNA保存于-80 °C冰箱。三、反转录为cDNA
用天根miRNA cDNA第一链合成试剂盒将纯化的miRNA反转录为cDNA。1.小 RNA 的 Poly (A)加尾反应液的配置
小 RNA6 μ 1
E-PAP (5U/y 1)0. 4 μ 1
10ΧΡΑΡ Buffer2 μ 1
5 XrATP solution4 μ 1
Nuclease-free Water7. 6 μ 1
总体积20 μ 1
轻轻混勻上述配制的反应液，短暂离心后，37°C反应60min。所得反应液可以直接进行下游实验，也可以放置-20°C短暂保存，如需长期保存建议存放于-80°C。2. Poly(A)修饰的miRNA进行逆转录反应反应液的配置
Poly(A)反应液2μ1
10XRT primer2μ 1
10XRT Buffer2μ 1
超纯 dNTP Mixture (2. 5Mm)1 μ 1
Rnasin (40U/μ 1)1 μ 1
Quant RTase0. 5 μ 1
RNase-free ddH201. 5μ 1
总体积20 μ 1
轻轻混勻上述配制的反应液，短暂离心后，37°C反应60min。合成的cDNA反应液放置-20°C保存，也可以直接进行下游荧光定量检测。四、实时荧光定量PCR
按如下反应体系，混好体系，然后分装入96孔光学板中，并覆盖上专用光学膜。扩增使用的仪器为ABI公司的荧光定量PCR仪。扩增程序为95"C 30s ；95 "C 5 s，60 "C 34s,45 cycles ；95 "C 15 s，60 "C 1 min,95 °C 15 s,
20 μ 1反应体系配制如下
DNA模板2 μ 1
SYBR Primix Ex taq {2X)10 μ 1
PCR Forward Primer (10 μ Μ)0. 4 μ 1
PCR Reverse Primer (10 μ Μ)0. 4 μ 1
ROX Reference Dye II (50Χ)0. 4 μ 1
ddH206 · 8 μ 1总体积20 μ 1
引物序列为正 向引物:AAGCCAAGGATGACTTGCCGA (SEQ ID NO 4) ；5. 8S rRNA-F ACGCCTGCCTGGGTGTCACAC (SEQ ID NO 5) ； AMRM :GCGAGCACAGAATTAATACGACT (SEQ ID NO: 6) ；(5. 8S rRNA为内参，AMRM为反向引物)；
结果如图2所示，其中N为对照处理根瘤，CN为4°C低温处理根瘤。结果表明，24小时显著抑制了 gma-miR169c在根瘤中的表达，从而说明gma_miR169c参与大豆根瘤对低温胁迫的响应。这样，在大豆中过表达gma-miR169c，或抑制gma_miR169c的表达，将影响大豆对低温胁迫的适应能力，培育出具有高抗低温性的转基因大豆，对提高大豆的产量具有重大的意义。实施例2、利用大豆毛状根转化系统对gma-miR169C在逆境下的表达进行分析一、gma-miR169c Pro-GUS 载体构建
所述pcambia3301-GUS-gma-miR169c为将所述gma-miR169c的启动子区域插在 pcambia3301的多克隆位点得到的重组质粒，优选为将序列表3的序列(启动子序列)3’自 5’端第1至1108位核苷酸所示的DNA片段插入pcambia3301的BamHI和NcoI酶切识别位点之间得到的重组质粒。二、材料准备及低温处理
以W82大豆品种为材料，将材料用氯气消毒10小时后，在B5培养基上萌发4天进行毛状根转化，外植体转至共培培养基上生长2天后，再转至MS/2培养基上培养，15天后，毛状根长出，选择发育阶段接近的长度约1-2厘米的毛状根分别在4°C处理24小时前后，取样进行GUS染色，染色时间限定为3小时。三、⑶S组织化学分析 (1)⑶S染液的配制
首先配制GUS反应缓冲液Tris Buffer，其中包括100 mM Tris和50 mM NaCl 以浓盐酸调PH至7. 4。然后以Tris buffer配制0.5 mM K3 [Fe (CN)6]溶液。按1 mg/ml 的浓度称取x-glu (5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖醛酸苷)，按照每mg加入10 μ 1 DMSO (二甲基亚砜)的比例溶解x-glu，加入Tris buffer配制的0.5 mM K3 [Fe (CN)6]溶液定容，可加入几滴TritonX-IOO以增强染色效果。迅速分装后于_20°C避光保存。(2)⑶S染色步骤
将待测定的毛状根取植物样品放入GUS反应缓冲液中，浸没，37°C暗中保温。每隔半小时在解剖镜下观察显色效果。染色3小时后，吸出⑶S反应缓冲液，加入70%乙醇终止反应并在37°C脱色，每隔数小时更换一次。结果如图3所示，其中A是转化gma-miR169C启动子携带⑶S报告基因的毛状根在4°C低温处理中的GUS积累表型，B是对出现GUS积累的毛状根的GUS积累量及积累模式进行的显微对比观察。从图中可以看出，gma-miR169C的表达受到了 4°C低温胁迫的显著抑制，显微观察结果表明，4°C低温处理24小时后明显降低了 gma-miR169C在大豆的毛状根中柱中的表达量，从而说明gma-miR169C参与调节大豆对低温胁迫的响应。这样，在大豆中过表达gma-miR169C，或抑制gma-miR169c的表达，将影响大豆对低温胁迫的适应能力，培育出具有高抗低温性的转基因大豆，对提高大豆的产量具有重大的意义。上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。
权利要求
1.一种与植物抗低温相关的miRNA，其特征在于其具有序列表中SEQ ID N0:1所示的序列。
2.权利要求1所述的与植物抗低温相关的miRNA的前体序列，其特征在于其具有序列表中SEQ ID NO 2所示的序列。
3.权利要求1所述的与植物抗低温相关的miRNA在培育抗低温转基因植物中的应用。
4.根据权利要求3所述的与植物抗低温相关的miRNA的用途，其特征在于所述抗低温转基因植物为大豆。
5.根据权利要求4所述的与植物抗低温相关的miRNA的用途，其特征在于在大豆中过表达SEQ ID NO :1所示的miRNA，或抑制SEQ ID NO :1所示miRNA的表达，培育出具有高抗低温性的转基因大豆。
全文摘要
本发明公开了一种与植物抗低温相关的miRNA，其具有序列表中SEQ ID NO1所示的序列；在大豆中过表达SEQ ID NO1所示的miRNA，或抑制SEQ ID NO1所示miRNA的表达，以培育出具有高抗低温性的转基因大豆，对提高大豆产量具有重大的意义。
文档编号A01H5/00GK102220329SQ201110154909
公开日2011年10月19日 申请日期2011年6月10日 优先权日2011年6月10日
发明者李东晓, 李霞, 王幼宁, 石磊, 陈亮 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所