专利名称：寡雄腐霉发酵液制备方法
技术领域：
本发明涉及微生物发酵技术领域，特别是涉及一种寡雄腐霉发酵液制备方法及其使用该发酵液有效控制烟草黑胫病的方法。
背景技术：
黑胚病nicotiana Breda ofe/fea/ )是我国烤烟的常见病害,发病率高，分布广泛，危害严重。除黑龙江省之外，全国各地均有发生，常年发病面积占当年烤烟种植面积的18%，严重影响烤烟的产量、质量和经济效益。目前，化学农药是防治烟草黑胫病的主要手段。黑胫病病原菌的小种甚多，对化学农药的敏感性不一样，且容易产生抗药性，多种化学药剂对黑胫病的防治效果随施药时间的延长而降低。此外，这些化学药剂的残效期长，残留量高，影响烟叶安全性。所以，在烤烟栽培中，安全、高效地防治烟草黑胫病是迫切需要解决的生产问题。 寡懺腐霉(Pythium能有效抑制番爺葡萄灰霉病、黄瓜的种腐和苗期猝倒病等多种病原真菌的生长繁殖。在欧洲发达国家，人们已制备出对人畜和环境无毒且高度安全的寡雄腐霉卵孢子制剂，广泛应用于绿色水果和蔬菜生产。但寡雄腐霉形成卵孢子，人工产孢困难，限制了寡雄腐霉的普遍应用，目前，北京比奥瑞生物科技有限公司从捷克引进了寡雄腐霉卵孢子制剂(菌株oligandrum DV 74),为寡雄腐霉防病制剂的后续开发与应用奠定了基础。众所周知，卵孢子的萌发和菌丝生长与环境条件密切相关。作为一种微生物制剂，大田应用寡雄腐霉卵孢子时，气温、湿度、光照(尤其是紫外线强度)、降雨、营养环境等均影响卵孢子的萌发和菌丝生长。此外，田间条件易于变化，难以提供寡雄腐霉卵孢子萌发和菌丝生长的合适环境，故卵孢子制剂在实际应用中稳定性极差。通过发酵工程生产其具有生防作用的次生代谢产物，在田间应用时不仅可以提高防治效果，还可克服微生物菌剂效果不稳定的常见缺点。因此，利用优良高产寡雄腐霉菌株，优化发酵条件制备生防发酵液可能更好、更可靠地防治烟草黑胫病。迄今为止，国内外尚无寡雄腐霉发酵液制备方法的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种寡雄腐霉发酵液制备方法及发酵液的施用方法，为有效控制烟草黑胫病提供技术支持。本发明选用北京比奥瑞生物科技有限公司从捷克引进的“多利维生.寡雄腐霉”卵孢子制剂(菌株oligandrum DV 74),该产品已在欧盟、美国、加拿大、巴西等国家正式登记，并于2009年在我国农业部登记(登记号LS20091213)，还获得欧洲FiBL和美国OMRI有机认证。本发明所述的一种寡雄腐霉发酵液制备方法，通过以下步骤实现
(I)寡雄腐霉菌种的获得
将“多利维生.寡雄腐霉”卵孢子制剂用无菌水稀释10，105倍，改进马丁氏(Martin)琼脂培养基100° C溶化摇匀，取5 mL培养基于25 mL试管中，121° C蒸汽灭菌30分钟，冷却至45° C，每支试管加入16.5 mL 1%孟加拉红无菌水溶液和15 mL 1%链霉素无菌水液，摇匀，倾斜放置制备斜面；接入稀释后的寡雄腐霉卵孢子，25° C暗培养1(Γ12天，挑选出寡雄腐霉菌丝，并用上述培养基和培养方法扩繁菌丝；
改进马丁氏(Martin)琼脂培养基I g KH2PO4、O. 5 g MgSO4 · 7H20、5 g 蛋白胨、10 g葡萄糖、5 g酒石酸铵、I g琥拍酸、20 g琼脂、1000ml水、ρΗ5· 5-6. O ;
(2)寡雄腐霉发酵液的制备
(2. I)培养基种子罐培养基2%玉米粉，1%葡萄糖，O. 25%酒石酸铵，O. 1%琥珀酸，余量为水，初始ΡΗ5. 5-6. O ;二级罐培养基同种子罐培养基；发酵罐培养基2%玉米粉，I. 5%葡萄糖，O. 5%酒石酸铵，O. 2%琥珀酸，余量为水，初始ρΗ5. 5-6. O ； (2. 2)液体发酵种子罐盛有121°C灭菌30min并冷却至3(T35°C的种子罐培养基，在无菌操作下，将寡雄腐霉菌丝接入种子罐，在通风量为1:0. 1，罐压O. 05Mpa，30°C 土 1°C的条件下培养48小时；二级罐盛有121°C灭菌30min并冷却至3(T35°C的二级罐培养基，将种子罐中的培养液转入二级罐中，在通风量为1:0. 25，罐压O. 05Mpa，30°C 土1°C的条件下培养24小时；发酵罐盛有121°C灭菌30min并冷却至3(T35°C的发酵罐培养基，将二级罐中的培养液转入到发酵罐中，在通风量为1:0. 5，罐压O. 05Mpa，30°C 土 1°C的条件下培养12(Tl40小时；
(2. 3)过滤浓缩发酵液放入缓存罐，用板框压滤机压滤；滤液打入另一个缓存罐，真空刮板浓缩5倍，蒸发温度4(T42°C，即得发酵液。上述方法步骤(I)中，在3-5 ° C条件下，菌丝可保存3个月，多代扩繁，长期自主保存做为菌种，在进行液体发酵时，取出扩繁用于液体发酵的菌种。本发明所得寡雄腐霉发酵液的施用方法为
在烟草黑胫病高发期前7-10天，在我国西南地区一般为71月降雨后的高温高湿期，将浓缩的寡雄腐霉发酵液兑水稀释5 10倍，灌根f 2次，每次每株烟苗50 mL,间隔1(Γ 5天。本发明所得寡雄腐霉发酵液对烟草黑胫病菌有明显的抑制作用，对黑胫病菌丝生长和孢子萌发的抑制率分别达到80. 5%和52. 9%。在离体叶片试验中，发酵液对中感红花大金元的防效高达74. 2%，对易感红花大金元防效也能达到71. 4% ；温室盆栽试验中，接种烟草黑胫病菌前24h施用发酵液防治效果为65. 1%，接种后24h施用发酵液的防治效果为60. 1% ；在田间试验中，施用发酵液防治烟草黑胫病的效果为57. 5飞6. 3%，施用孢子粉防治烟草黑胫病的效果(Γ25. 4%。本发明的优点是
I.寡雄腐霉发酵设备简单、通用，资源消耗少，工业化生产要求低，一般微生物发酵工厂即可满足生产。2.与寡雄腐霉卵孢子制剂相比，利用寡雄腐霉发酵液防治烟草黑胫病效果好而稳定，受环境条件影响小，施用方法简单，实用性强，容易推广。3.成本低廉，寡雄腐霉卵孢子制剂进口价格高昂，用本发明方法生产发酵液，施用成本仅为寡雄腐霉孢子制剂的20%。
具体实施例方式实施例I :
I、培养基种子罐培养基2%玉米粉(磨细过100目筛，下同)，1%葡萄糖，O. 25%酒石酸铵，O. 1%琥珀酸，余量为水，初始pH5. 5 ;二级罐培养基同种子罐培养基；发酵罐培养基2%玉米粉，I. 5%葡萄糖，O. 5%酒石酸铵，O. 2%琥珀酸，余量为水，初始pH5. 5。2、发酵液制备种子罐盛有121°C灭菌30min并冷却至35°C的种子罐培养基，在无菌操作下，将寡雄腐霉菌丝接入种子罐，在通风量为1:0. 1，罐压O. 05Mpa，30°C 土 1°C的条件下培养48小时；二级罐盛有121°C灭菌30min并冷却至35°C的二级罐培养基，经转移管道将种子罐中的培养液转入二级罐中，在通风量为1:0. 25，罐压O. 05Mpa，30°C 土 1°C的条件下培养24小时；发酵罐盛有121°C灭菌30min并冷却至35°C的发酵罐培养基，经转移管道将二级罐中的培养液转入到发酵罐中，在通风量为1:0. 5，罐压O. 05Mpa，30°C ±1°C的条 件下培养12(Γ140小时；发酵液经放料管道进入缓存罐，经板框压滤机进行压滤；滤液打入另一个缓存罐，再进行真空刮板浓缩5倍(蒸发温度4(T42°C)，即制备获得发酵液。3、施用在四川省某烟地于2012年8月3日和8月13日分别用兑水稀释5倍的寡雄腐霉发酵液灌根，每株50mL，防治烟草黑胫病的效果为66. 3 %，施用寡雄腐霉孢子粉各500克做为对照无防治效果。实施例2:
I、培养基种子罐培养基2%玉米粉(磨细过100目筛，下同)，1%葡萄糖，O. 25%酒石酸铵，O. 1%琥珀酸，余量为水，初始pH6. O ;二级罐培养基同种子罐培养基；发酵罐培养基2%玉米粉，I. 5%葡萄糖，O. 5%酒石酸铵，O. 2%琥珀酸，余量为水，初始pH6. O。2、发酵液制备种子罐盛有121°C灭菌30min并冷却至33°C的种子罐培养基，在无菌操作下，将寡雄腐霉菌丝接入种子罐，在通风量为1:0. 1，罐压O. 05Mpa，30°C 土1°C的条件下培养48小时；二级罐盛有121°C灭菌30min并冷却至32°C的二级罐培养基，经转移管道将种子罐中的培养液转入二级罐中，在通风量为1:0. 25，罐压O. 05Mpa，30°C 土 1°C的条件下培养24小时；发酵罐盛有121°C灭菌30min并冷却至31°C的发酵罐培养基，经转移管道将二级罐中的培养液转入到发酵罐中，在通风量为1:0. 5，罐压O. 05Mpa，30°C 土 1°C的条件下培养12(Γ140小时；发酵液经放料管道进入缓存罐，经板框压滤机进行压滤；滤液打入另一个缓存罐，再进行真空刮板浓缩5倍(蒸发温度4(T42°C)，即制备获得发酵液。3、施用在贵州省某烟地于2012年7月20日和8月4日分别用兑水稀释8倍的寡雄腐霉发酵液灌根，每株50mL，防治烟草黑胫病的效果为57. 5%，施用寡雄腐霉孢子粉各500克做为对照的防治效果为25. 4%。实施例3:
I、培养基种子罐培养基2%玉米粉(磨细过100目筛，下同)，1%葡萄糖，O. 25%酒石酸铵，O. 1%琥珀酸，余量为水，初始pH5. 7 ;二级罐培养基同种子罐培养基；发酵罐培养基2%玉米粉，I. 5%葡萄糖，O. 5%酒石酸铵，O. 2%琥珀酸，余量为水，初始pH5. 7。2、发酵液制备种子罐盛有121°C灭菌30min并冷却至30°C的种子罐培养基，在无菌操作下，将寡雄腐霉菌丝接入种子罐，在通风量为1:0. 1，罐压O. 05Mpa，30°C 土 1°C的条件下培养48小时；二级罐盛有121°C灭菌30min并冷却至30°C的二级罐培养基，经转移管道将种子罐中的培养液转入二级罐中，在通风量为1:0. 25，罐压O. 05Mpa，30°C 土 1°C的条件下培养24小时；发酵罐盛有121°C灭菌30min并冷却至30°C的发酵罐培养基，经转移管道将二级罐中的培养液转入到发酵罐中，在通风量为1:0. 5，罐压O. 05Mpa，30°C ±1°C的条件下培养12(Γ140小时；发酵液经放料管道进入缓存罐，经板框压滤机进行压滤；滤液打入另一个缓存罐，再进行真空刮板浓缩5倍(蒸发温度4(T42°C)，即制备获得发酵液。3、施用在重庆市某烟地于2012年7月25日和8月5日分别用兑水稀释10倍的寡雄腐霉发酵液灌根，每株50mL，防治烟草黑胫病的效果为59. 4%，施用寡雄腐霉孢子粉各500克做为对照的防治效果为15 . 7 %。
权利要求
1.一种寡雄腐霉发酵液制备方法，其特征在于通过以下步骤实现 (1)寡雄腐霉菌种的获得 将“多利维生.寡雄腐霉”卵孢子制剂用无菌水稀释10，105倍，改进马丁氏(Martin)琼脂培养基100° C溶化摇匀，取5 mL培养基于25 mL试管中，121° C蒸汽灭菌30分钟，冷却至45° C，每支试管加入16.5 mL 1%孟加拉红无菌水溶液和15 mL 1%链霉素无菌水液，摇匀，倾斜放置制备斜面；接入稀释后的寡雄腐霉卵孢子，25° C暗培养1(T12天，挑选出寡雄腐霉菌丝，并用上述培养基和培养方法扩繁菌丝； 改进马丁氏(Martin)琼脂培养基I g KH2PO4、0. 5 g MgSO4 7H20、5 g 蛋白胨、10 g葡萄糖、5 g酒石酸铵、I g琥拍酸、20 g琼脂、1000ml水、pH5. 5-6. 0 ; (2)寡雄腐霉发酵液的制备 (2. I)培养基种子罐培养基2%玉米粉，1%葡萄糖，0. 25%酒石酸铵，0. 1%琥珀酸，余量为水，初始PH5. 5-6. 0 ;二级罐培养基同种子罐培养基；发酵罐培养基2%玉米粉，I. 5%葡萄糖，0. 5%酒石酸铵，0. 2%琥珀酸，余量为水，初始pH5. 5-6. 0 ； (2. 2)液体发酵种子罐盛有121°C灭菌30min并冷却至3(T35°C的种子罐培养基，在无菌操作下，将寡雄腐霉菌丝接入种子罐，在通风量为1:0. 1，罐压0. 05Mpa，30°C 土 1°C的条件下培养48小时；二级罐盛有121°C灭菌30min并冷却至3(T35°C的二级罐培养基，将种子罐中的培养液转入二级罐中，在通风量为1:0. 25，罐压0. 05Mpa，30°C 土1°C的条件下培养24小时；发酵罐盛有121°C灭菌30min并冷却至3(T35°C的发酵罐培养基，将二级罐中的培养液转入到发酵罐中，在通风量为1:0. 5，罐压0. 05Mpa，30°C ± 1°C的条件下培养12(Tl40小时； (2. 3)过滤浓缩发酵液放入缓存罐，用板框压滤机压滤；滤液打入另一个缓存罐，真空刮板浓缩5倍，蒸发温度4(T42°C，即得发酵液。
全文摘要
本发明涉及一种寡雄腐霉发酵液制备方法及其使用该发酵液有效控制烟草黑胫病的方法，利用“多利维生．寡雄腐霉”卵孢子制剂(菌株PythiumoligandrumDV74)获得寡雄腐霉菌种，再经液体发酵和过滤浓缩等步骤得到。与寡雄腐霉卵孢子制剂相比，利用寡雄腐霉发酵液防治烟草黑胫病效果好而稳定，受环境条件影响小，施用方法简单，实用性强；成本低廉，施用成本仅为寡雄腐霉孢子制剂的20%；寡雄腐霉发酵设备简单、通用，资源消耗少，工业化生产要求低，一般微生物发酵工厂即可满足生产。
文档编号A01N63/04GK102796674SQ20121033261
公开日2012年11月28日 申请日期2012年9月11日 优先权日2012年9月11日
发明者黄建国, 赵建, 袁玲 申请人:西南大学