专利名称：一种见血飞的快速繁殖方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，涉及植物组织培养技术，具体地说是一种见血飞的组织培养方法。
背景技术：
植物是药物的天然宝库，人们利用药用植物的历史源远流长，全世界约有75%的人口以植物作为治疗预防疾病的药物来源(邢建民，2001)。人类已经从植物中发现了许多具有高度生理活性的药物，目前从植物来源的药物占药物总量的25%以上(郑光植，1987)。我国的传统中草药已有数千年的历史，至今仍在我国和许多国家和地区广为使用。 但由于传统的中草药获取方法是以采集和消耗大量的野生植物资源为代价的，当采集和消耗量超过自然资源的再生能力时，必然会导致物种的濒危甚至灭绝。同时随着自然生态环境的日益破坏，也进一步导致药用植物资源的匮乏。生物技术的蓬勃发展为从根本上改变传统药材的生产提供了一个崭新的方法，植物组织和细胞培养技术则是其中一个重要的手段。我国自1964年罗士韦教授首先报道了人参组织培养获得成功的研究成果以来，许多科学家先后从事了多种药用植物的组织培养研究。至今，我国药用植物的组织培养研究迅速发展。目前，世界各国对植物的药用开发和研究都十分重视，就以美国来说，其成药中有47%是以植物为原料制成的(谢启昆，1986)。为了解决药用植物的供需矛盾，人们采用人工栽培的方法扩大药源。但在人工栽培的药用植物中，有不少名贵药材等生产周期较长，如人参、黄连，如果以常规方法育种或育苗，需要花费很长的时间；另有一些药用植物如贝母、番红花等，因繁殖系数小、耗种量大，导致育种速度很慢，生产成本增加。利用植物的有性繁殖方式对其有效成分含量波动比较大，所以利用植物组织培养技术解决药用植物的植株再生与繁殖问题迫在眉睫。近年来，国内外在这方面已做了大量工作，已成功离体培养获得试管植株的药用植物至少有200种，如云南黑节草、延龄草、高山红景天、莪术、水母雪莲、星花绣线菊、溪黄草、玉叶金花、辽东榴木等；其中包括一些具有抗癌有效成分的珍稀植物，如红豆杉、艾、黄杨、大戟属植物、长春花、米仔兰、七叶一枝花、狗牙花和香榧等。见血飞，又名麻药，散血飞、黄椒、刺三加、红三百棒，属于双子叶植物芸香科。多年生藤本茎具粗壮的钩刺，刺基部膨大而成扁圆形木栓化凸起，小枝无毛，疏生黑色倒钩刺。二回羽状复叶，叶轴长20— 40厘米，无毛，具钩刺，羽片2— 5对，羽轴有钩刺，小叶大，4一5对，革质，卵圆形至长圆形，长5 —12. 5厘米，宽4一5. 5厘米，先端渐尖或锐尖，基部阔楔形或钝圆，稍不对称，无毛，叶面深绿色，有光泽，背面灰白色，小叶柄长3— 5毫米。总状花序单I或2支，或为顶生圆锥花序，长10 — 20厘米；花梗长6 —12毫米，无毛；萼片5，无毛，下方I片盔状，长9毫米，其余4枚三角状长圆形，黄色；花瓣5，黄色，不等大，4片相似，长圆形，黄色有红色斑纹，上面I片宽而短，先端2裂成鱼尾状，有短梗；雄蕊10，伸出花冠外，花丝基部稍粗，被褐色长柔毛；子房具柄，无毛，花柱细长，柱头小，截形。荚果长圆形，长8—12厘米，宽2. 5-3. 5厘米，扁平，红褐色，沿腹缝线有翅，翅宽6—7毫米，不开裂。种子I(一2)粒，位于荚果中央。花期11月至翌年2月，果期3 —10月。异叶花椒的叶，性味功能亦同根皮。多配伍外敷，用于接骨。治风寒咳嗽、治跌打损伤，风湿麻木、治刀伤出血黄椒适量，捣缄，外敷患处、治大便秘结。其根主要与淫羊霍等配合使用用于壮阳，造成对野生见血飞需求巨大，见血飞的价格也一路高升。因此，为了满足日益增大的药用需求，种子收获量小，种子繁殖出苗率极低，种子培育过程烦琐，生长速度慢，同时保护见血飞的野生资源，利用组培快繁技术，实现人工栽培是最好的解决方法。迄今为止，在国内外尚未见关于见血飞组织培养快繁成功的报道。我们通过大量试验，终于摸索出一套成熟的方法，成功实现了见血飞的组培快繁，可以快速培育出大量幼苗，为实现工业化人工栽培见血飞提供可能。见血飞的组培快繁技术方法的成功建立，可以为大规模人工栽培药用植物见血飞提供种苗，为现代科技农业提供了一种切实可行的开发项目
发明内容
本发明的目的是提供见血飞的快速繁殖方法，该方法非常适合工业化生产，配方效果佳，出芽率高，培养时间短，植株生长旺盛，可操作性强，应用价值高等优点。具有投入少，产出高的特点。本发明所述见血飞的快速繁殖方法，其具体操作步骤如下I)外植体的选取与灭菌选用见血飞的嫩茎上芽体作为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗10-30分钟后，置于75%酒精中处理10-30秒，然后再经O. 1%的升汞消毒后用无菌水冲洗，切去外植体变色的部分后备用；2)芽体的萌发将灭菌处理后的芽体接种在N6+2，4-DO. 5mg/L+6_BAl. 4mg/L+IBAO. 4mg/L培养基上，pH值为5. 8，培养温度23-27 °C，每天光照12小时，光照强度1000LX，接种后10-15天芽体的萌发，10天左右形成带叶的小苗；3)丛生芽诱导和增殖培养将小苗切下转接于N6+2，4-D0. lmg/L+6-BAl. 8mg/L+IBAO. 4mg/L培养基上，直至形成丛生芽，pH值为5. 8，培养温度23-27 °C，每天光照16小时，光照强度1000LX，25天左右为一个生长周期，以保持高速度递增，增殖系数为5以上；4)生根培养选择N6+6-BA0. 5mg/L +NAA1. 5mg / L作为生根培养基，pH值为5. 8，培养温度23-27°C，每天光照16小时，光照强度1000LX，生根率达到90%以上，只需要20天左右形成完整植株；5)试管苗的移栽选取根系生长良好的试管苗，放入清水中把根部的琼脂清洗干净，移载到沙土或富养土中，注意保水保温保湿，移载I个月后，移载成活率达到90%以上。在一个具体实施方案中，步骤I中采用O. I %升汞进行消毒，消毒时间控制优选在
9-14分钟。在另一个具体实施方案中，步骤5中大田移栽湿度控制在40-70%;温度控制在
10-30。。。技术效果(I)利用见血飞带芽根茎段为外植体，使得外植体取材较容易，一年四季均可取材，而且数量多，采用根茎芽体做外植体，保证了遗传稳定性，同时克服了组织培养中，愈伤组织在分化培养基上随着芽的分化而逐渐停止生长，失去增殖能力的弱点，可防止伤组织继代培养过程中，随着培养代数的增加，分化出来的苗出现变异的现象。(2)本发明方法利用外植体建立，增殖生根同步化这一技术路线，仅需30天左右形成完整植株，4-6个月内获得大量完整植株，实现见血飞的大规模工厂化育苗。(3)本发明方法获得的试管苗在移载时所采用的基质利用沙土，方法简单，而且大大降低了移载成本。本培养方法出芽快，增殖率高，方法简单，生产成本低，可批量生产，应用价值高。(4)见血飞的生产可以在人为控制条件下进行，不受季节、气候条件与土壤等因素的制约，可排除病虫害的侵袭和农药残留的影响，严格控制见血飞的质量。增殖速度快，生产周期短，设备简单，占地面积少，能节省人力、物力等，便于工厂化生产。(5)使用本发明提供的组培快繁技术得到的见血飞幼苗进行人工栽培，可以得到·个体差异小，品质均一的见血飞成品。(6)可以保存见血飞的种质资源，同时有利于保护见血飞野生资源，减少对自然资源的破坏。
具体实施例方式下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。实施例I取材见血飞带腋芽茎段为外植体I、外植体的选取与灭菌采自湖南慈利的见血飞鲜嫩芽茎段等幼嫩组织，作为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗10-30分钟后，置于75%酒精中处理10-30秒，然后再经O. I %的升汞消毒10分钟后用无菌水冲洗，切去外植体变色的部分后备用。2、芽体的萌发将灭菌处理后的芽体接种在N6+6-BA1. 2mg/L+NAA0. 2mg/L培养基上，pH值为5. 8，培养温度23-27°C，每天光照12小时，光照强度1000LX ;接种后6_8天芽体的萌发，10天左右形成带叶的小苗。3、丛生芽诱导和增殖培养将小苗切下转接于N6+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L培养基上，直至形成丛生芽，PH值为5.8，培养温度23-271，每天光照16小时，光照强度1000LX。30天左右为一个生长周期，以保持高速度递增，增殖系数为5以上。4、生根培养选择 N6+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L+NAA O. 5mg / L作为生根培养基，pH值为5. 8，培养温度23-27°C，每天光照16小时，光照强度1000LX，生根率达到90%以上，只需要25天左右形成完整植株。5、试管苗的移栽选取根系生长良好的试管苗，放入清水中把根部的琼脂清洗干净，移载到沙土中，湿度控制在60% ;温度控制在20°C，移载I个月后，移载成活率达到96%以上。实施例2取材见血飞带腋芽茎段为外植体I、外植体的选取与灭菌采自湖南慈利的见血飞鲜嫩芽茎段等幼嫩组织，作为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗10-30分钟后，置于75%酒精中处理10-30秒，然后再经O. I %的升汞消毒10分钟后用无菌水冲洗，切去外植体变色的部分后备用。
2、芽体的萌发将灭菌处理后的芽体接种在N6+6-BA1. 2mg/L+NAA0. 3mg/L培养基上，pH值为5. 8，培养温度23-27°C，每天光照16小时，光照强度1000LX ;接种后7_8天芽体的萌发，12天左右形成带叶的小苗。3、丛生芽诱导和增殖培养将小苗切下转接于N6+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L培养基上，直至形成丛生芽，PH值为5. 8，培养温度23-27°C，每天光照16小时，光照强度1000LX。30天左右为一个生长周期，以保持高速度递增，增殖系数为5以上。4、生根培养选择 N6+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L+NAA O. 5mg / L作为生根培养基，pH值为5. 8，培养温度23-27°C，每天光照16小时，光照强度1000LX，生根率达到90%以上，只需要25天左右形成完整植株。5、试管苗的移栽选取根系生长良好的试管苗，放入清水中把根部的琼脂清洗干净，移载到沙土中，湿度控制在50% ;温度控制在25°C，移载I个月后，移载成活率达到94%以上。 实施例3取材见血飞带腋芽茎段为外植体I、外植体的选取与灭菌采自湖南桑植的见血飞鲜嫩芽茎段等幼嫩组织，作为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗10-30分钟后，置于75%酒精中处理10-30秒，然后再经O. I %的升汞消毒10分钟后用无菌水冲洗，切去外植体变色的部分后备用。2、芽体的萌发将灭菌处理后的芽体接种在N6+6-BA1. 2mg/L+NAA0. 2mg/L培养基上，pH值为5. 8，培养温度23-27°C，每天光照16小时，光照强度1000LX ;接种后6_8天左右芽体的萌发，10天左右形成带叶的小苗。3、丛生芽诱导和增殖培养将小苗切下转接于N6+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L培养基上，直至形成丛生芽，PH值为5.8，培养温度23-271，每天光照16小时，光照强度1000LX。30天左右为一个生长周期，以保持高速度递增，增殖系数为5以上。4、生根培养选择N6+6-BA0. 5mg/L +NAA O. 5mg / L作为生根培养基，pH值为5. 8，培养温度23-27°C，每天光照16小时，光照强度1000LX，生根率达到95%以上，只需要20天左右形成完整植株。5、试管苗的移栽选取根系生长良好的试管苗，放入清水中把根部的琼脂清洗干净，移载到沙土中，湿度控制在70% ;温度控制在20°C，移载I个月后，移载成活率达到98%以上。
权利要求
1.一种见血飞的快速繁殖方法，其具体步骤包括 (1)外植体的选取与灭菌选用见血飞的嫩茎上芽体作为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗10-30分钟后，置于75%酒精中处理10-30秒，然后再经O. 1%的升汞消毒后用无菌水冲洗，切去外植体变色的部分后备用； (2)芽体的萌发将灭菌处理后的芽体接种在N6+2，4-DO.5mg/L+6-BAl. 4mg/L+IBAO. 4mg/L培养基上，pH值为5. 8，培养温度23-27 °C，每天光照12小时，光照强度1000LX，接种后10-15天芽体的萌发，10天左右形成带叶的小苗； (3)丛生芽诱导和增殖培养将小苗切下转接于N6+2，4-D0.lmg/L+6-BAl. 8mg/L+IBAO. 4mg/L培养基上，直至形成丛生芽，pH值为5. 8，培养温度23-27°C，每天光照16小时，光照强度1000LX，25天左右为一个生长周期，以保持高速度递增，增殖系数为5以上； (4)生根培养选择N6+6-BA0.5mg/L +NAA1. 5mg / L作为生根培养基，pH值为5· 8，培养温度23-27°C，每天光照16小时，光照强度1000LX，生根率达到90%以上，只需要20天左右形成完整植株； (5)试管苗的移栽选取根系生长良好的试管苗，放入清水中把根部的琼脂清洗干净，移载到沙土或富养土中，注意保水保温保湿，移载I个月后，移载成活率达到90%以上。
2.权利要求I的方法，其中步骤I中采用O.I %升汞进行消毒，消毒时间控制优选在9-14分钟。
3.权利要求2的方法，其中步骤5中大田移栽湿度控制在40-70%;温度控制在10-30。。。
全文摘要
该方法是在N6培养基上培养见血飞的茎段等组织，确切取带1-2个芽的根茎段为外植体，消毒后，接种在N6+2，4-D0.5mg/L+6-BA1.4mg/L+IBA0.4mg/L培养基中培养，接种后6-8天左右芽体的萌发，10天左右形成带叶的小苗，将小苗切下转接于N6+2，4-D0.1mg/L+6-BA1.8mg/L+IBA0.4mg/L培养基上，以保持高速度递增，增殖系数为5以上。选择择N6+6-BA0.5mg/L+NAA1.5mg／L作为生根培养基，生根率达到90%以上，只需要25天左右形成完整植株。试管苗移载到沙土中，注意保水保湿，移载1个月后，移载成活率达到90%以上，建立了一套高频稳定再生体系。本发明方法具有出芽快，增殖率高，方法简单，生产成本低，可批量生产，应用价值高。
文档编号A01H4/00GK102893863SQ201210332048
公开日2013年1月30日 申请日期2012年9月10日 优先权日2012年9月10日
发明者董爱文, 于华忠, 卜晓英 申请人:向华