一种预防对虾白斑病的饲料添加剂及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程，具体的说是一种预防对虾白斑病的饲料添加剂及其制备方法。以感染白斑病的凡纳滨对虾肝胰腺组织DNA为模板，采用引物VP28F（NcoI）与VP28R（NheI）进行PCR扩增，SEQ?ID?No.1所示的扩增产物经修饰后转入水稻中，携带扩增产物的转基因再生苗种植后的米糠，即为预防对虾白斑病的饲料添加剂；其中引物VP28F（NcoI）与VP28R（NheI）为：VP28F（NcoI）：CTCGCCATGGATCTTTCTTTCACTCTTT；VP28R（NheI）：GATTGCTAGCATGTTTCCCGTTCAA。本发明选择水稻作为生物反应器表达WSSV囊膜蛋白基因既保证了外源基因的准确表达，又易于大规模培养和生产。
【专利说明】一种预防对虾白斑病的饲料添加剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程，具体的说是一种预防对虾白斑病的饲料添加剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]对虾白斑综合症(WSS)是危害全球对虾养殖业的毁灭性病害，其病原为对虾白斑综合症病毒(WSSV)，该病毒毒力极强，每年因此全球养殖对虾产量减少一半，损失几百亿人民币。到目前为止，对虾白斑病尚无有效的治疗方法。
[0003]早在1999年，王雷等人从对虾免疫基础研究的角度出发，发现热灭活的WSSV、病毒结构蛋白可以刺激中国明对奸(Fenneropenaeus chinensis)血清中溶菌酶活力和超氧化物歧化酶产生显著提高，可见灭活的WSSV或者其结构蛋白都可以激活对虾的免疫系统。随后，利用囊膜蛋白刺激对虾产生抗病性的研究也在不同的实验室展开，结果都显示利用WSSV特异结构蛋白作为“疫苗”防治对虾白斑病是完全可行的。其中WSSV的囊膜蛋白VP28被证明是最有效的一种结构蛋白。多数的研究均采用原核生物——细菌作为表达载体用于WSSV囊膜蛋白的表达，而采用原核生物表达外源真核生物蛋白往往不能保持其真正的构象，因此可能丧失一部分抗原活性。由此可见，获得大量能保持免疫原性的WSSV囊膜或核衣壳蛋白是解决这一问题的关键，而选择廉价且安全的生物反应器表达囊膜或核衣壳蛋白是实现产业化应用的前提条件。
【发明内容】
[0004]本发明目的在于提供一种预防对虾白斑病的饲料添加剂及其制备方法。
[0005]为实现上述目的本发明采用的技术方案为:
[0006]一种预防对虾白斑病的饲料添加剂，以感染白斑病的凡纳滨对虾肝胰腺组织DNA为模板，采用引物VP28F (NcoI)与VP28R (NheI)进行PCR扩增，SEQ ID N0.1所示的扩增产物经修饰后转入水稻中，携带扩增产物的转基因再生苗种植后的米糠，即为预防对虾白斑病的饲料添加剂;其中引物VP28F (NcoI)与VP28R (NheI)为:VP28F (NcoI):CTCGCCATGGATCTTTCTTTCACTCTTT ；VP28R (NheI):GATTGCTAGCATGTTTCCCGTTCAA。
[0007]所述SEQ ID N0.1所示的扩增产物经如下修饰后再转入水稻中:采用NcoI和NheI双酶切的方法分别对SEQ ID N0.1所示的扩增产物和植物表达载体pCAMBIA1305.2进行处理，而后通过T4连接酶连接即得到植物表达载体pCAMBIA-VP28进而转入水稻中；具体为:
[0008]I)将SEQ ID N0.1所示的扩增产物采用PCR产物纯化试剂盒纯化后，采用NcoI和NheI进行酶切，待用；
[0009]2)采用NcoI和NheI双酶切植物表达载体pCAMBIA1305.2，电泳分离酶切产物，采用胶回收试剂盒回收电泳大片段，即为线性化的PCAMBIA1305.2空载体，待用；
[0010]3)采用T4连接酶，将步骤I)酶切的VP28基因连接入步骤2)酶切后植物表达载体pCAMBIA1305.2，得到植物表达载体pCAMBIA_VP28。[0011]预防对虾白斑病的饲料添加剂的制备，所述以携带WSSV的凡纳滨对虾肝胰腺组织DNA为模板，采用引物VP28F (NcoI)与VP28R (NheI)进行PCR扩增，SEQ ID N0.1所示的扩增产物经修饰后通过农杆菌介导法转入水稻中，携带扩增产物的转基因再生苗种植后的米糠，即为预防对虾白斑病的饲料添加剂；其中引物VP28F(NcoI)与VP28R(NheI)为:VP28F(NcoI):CTCGCCATGGATCTTTCTTTCACTCTTT ；VP28R (NheI):GATTGCTAGCATGTTTCCCGTTCAA。
[0012]所述SEQ ID N0.1所示的扩增产物经如下修饰后再转入水稻中:采用NcoI和NheI双酶切分别对SEQ ID N0.1所示的扩增产物和植物表达载体pCAMBIA1305.2进行处理，而后通过T4连接酶连接即得到植物表达载体pCAMBIA-VP28进而转入水稻中。
[0013]将所述制备所得添加剂即携带VP28的再生苗种植后所得米糠与饲料混配，能够预防对虾白斑病。
[0014]本发明所具有的优点:本发明选择水稻作为生物反应器表达WSSV囊膜蛋白基因既保证了外源基因的准确表达，又易于大规模培养和生产。而且植物细胞内表达的WSSV囊膜蛋白可以得到植物细胞壁的保护，使其在饲料加工过程中减少破坏，并有助于其安全到达肠道发挥免疫作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为本发明实施例提供的含有VP28基因的植物表达载体示意图。
[0016]图2为本发明实施例提供的转基因水稻的RT-PCR检测电泳图。
【具体实施方式】
[0017]实施例
[0018]DWSSV囊膜蛋白基因的克隆
[0019]根据GenBank中收录的WSSV序列(GenBank登录号:AF332093)合成下列引物 VP28F (NcoI) 〖CTCGCCATGGATCTTTCTTTCACTCTTT，VP28R (NheI):GATTGCTAGCATGTTTCCCGTTCAA。
[0020]取携带白斑病毒的凡纳滨对奸(Litopenaeus vannamei)作为材料,采用CTAB法提取对虾肝胰腺组织的DNA。以肝胰腺组织DNA为模板，用VP28F (NcoI)和VP28R (NheI)进行PCR扩增获得VP28基因的DNA序列，扩增程序为:94°C变性2min ;94°C变性30s，45°C退火45s，72。。延伸45s，5个循环；94°C变性30s，60。。退火45s，72。。延伸45s，30个循环；72°C延伸 lOmin。
[0021]PCR产物采用柱式PCR产物纯化试剂盒(上海生工生物技术服务有限公司)进行纯化，在T4连接酶的作用下连接入pMD 18-T载体(宝生物工程(大连)有限公司)，连接产物转入大肠杆菌DH5a感受态细胞。采用引物VP28F (NcoI)和VP28R (NheI)对大肠杆菌进行菌落PCR鉴定，选取阳性大肠杆菌克隆进行序列测定。获得VP28的基因序列，测序后序列与GenBank中收录的WSSV序列(AF332093)相似性为98%。SEQ ID N0.1序列如下，其中下划线部分为有效的编码序列，根据DNA序列推测的蛋白序列包含204个氨基酸。CTCGCCATGGATCTTTCTTTCACTCTTTCGGTCGTGTCGGCCATCCTCGCCACCACTGCTGTGATTGCTGTATTTATTGTGATTTTTAGGTATCACAACACTGT GACCAAGACCATCGAAACCCACACAGACAATATCGAGACAAACATGGATGAAAACCTCCGCATTCCTGTGACTGCTGAGGTTGGATCAGGCTACTTCAAGATGACTGATGTGTCCTTTGACAGCGACACCTTGG
【权利要求】
1.一种预防对虾白斑病的饲料添加剂，其特征在于:以感染白斑病的凡纳滨对虾肝胰腺组织DNA为模板，采用引物VP28F (NcoI)与VP28R (NheI)进行PCR扩增，SEQ ID N0.1所示的扩增产物经修饰后转入水稻中，携带扩增产物的转基因再生苗种植后的米糠，即为预防对虾白斑病的饲料添加剂；其中引物VP28F (NcoI)与VP28R (NheI)为:VP28F (NcoI):CTCGCCATGGATCTTTCTTTCACTCTTT ；VP28R (NheI):GATTGCTAGCATGTTTCCCGTTCAA。
2.按权利要求1所述的预防对虾白斑病的饲料添加剂，其特征在于:所述SEQID N0.1所示的扩增产物经如下修饰后再转入水稻中:采用NcoI和NheI双酶切的方法分别对SEQID N0.1所示的扩增产物和植物表达载体pCAMBIA1305.2进行处理，而后通过T4连接酶连接即得到植物表达载体PCAMBIA-VP28进而转入水稻中。
3.—种权利要求1所述的预防对虾白斑病的饲料添加剂的制备，其特征在于:所述以携带WSSV的凡纳滨对虾肝胰腺组织DNA为模板，采用引物VP28F (NcoI)与VP28R (NheI)进行PCR扩增，SEQ ID N0.1所示的扩增产物经修饰后通过农杆菌介导法转入水稻中，携带扩增产物的转基因再生苗种植后的米糠，即为预防对虾白斑病的饲料添加剂；其中引物VP28F (NcoI)与 VP28R (NheI)为:VP28F (NcoI):CTCGCCATGGATCTTTCTTTCACTCTTT ；VP28R(NheI):GATTGCTAGCATGTTTCCCGTTCAA。
4.按权利要求3预防对虾白斑病的饲料添加剂的制备，其特征在于:所述SEQID N0.1所示的扩增产物经如下修饰后再转入水稻中:采用NcoI和NheI双酶切的方法分别对SEQID N0.1所示的扩增产物和植物表达载体pCAMBIA1305.2进行处理，而后通过T4连接酶连接即得到植物表达载体PCAMBIA-VP28进而转入水稻中。
5.按权利要求3预防对虾白斑病的饲料添加剂的制备，其特征在于:将所述携带VP28的再生苗种植后所得米糠与饲料混配，能够预防对虾白斑病。
【文档编号】A23K1/16GK103766626SQ201210405508
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年10月22日 优先权日:2012年10月22日
【发明者】刘梅, 刘文真, 王雷, 付亚萍, 王宝杰, 胡国成, 蒋克勇 申请人:中国科学院海洋研究所