专利名称：月季试管苗试管内开花及雌蕊单性开花的方法及其培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种月季试管苗试管内开花及雌蕊单性开花的方法及其培养基，属植物生物技术领域或植物遗传育种或迷你花卉生产领域。
背景技术：
月季(R.chinenSiS)，被称为花中皇后又称“月月红”，蔷薇科(Rosaceae)蔷薇亚科，蔷薇属(Rosa)。常绿或半常绿低矮灌木，四季开花，多红色，偶有白色，可作为观赏植物，可作为药用植物，也称月季花。自然花期5至11月，花大型，有香气，广泛用于园艺栽培和切花。月季花种类主要有切花月季、食用玫瑰、藤本月季、地被月季等。中国是月季的原产地之一。陕北地区野生月季一般花较小在当年6月中旬开始开花，花期随温度变化较大。月季组培和快繁报道较多，吕汰(2000)研究发现适宜丰花月季离体侧芽分花 的培养基为 MS+6-BA2. 00mg/L+NAA0. 10 O. 50mg/L,生根培养基为 1/2MS+NAA0. 30 O. 50mg/L，其生根率在95%以上；在蛭石与营养土的双层基质中，生根试管苗的移栽成活率达90%。叶贻勋(1999)研究了月季组培过程中节省成本的办法。莫磊兴(1998)通过对5个切花月季品种组培快繁技术的研究，探讨了品种、植物生长调节剂、温度和光照强度等对外植体腋芽萌发、嫩茎增殖和生根的影响。茎段腋芽诱导适宜的条件是:MS+BA3 -Omg/L+NAA0 · 15mg/L，温度 26°C左右。在 MS+BA3 · 0mg/L+IAA0 · 15mg/L 培养基上，嫩茎增殖达4倍以上。30001uX左右的自然散射光对增殖阶段形成健壮嫩芽有利。小苗移植到沙子与椰糠混合的基质上，成活率达80%以上。李启任(1997)以月季为材料，进行较大规模组培快繁技术研究，改进了表面灭菌，发现MS+BA0. 5mg/诱导腋芽萌发成枝较好；MS+BA1. Omg/L+NAA0. lmg/L用于伊丽莎白及黄和平增殖较好，MS+BA2mg/L+NAA0. lmg/L用于黄玫瑰增殖较好，萨蔓莎及维莎则用MS+BA3mg/L+NAA0. lmg/L较好；MS+BA0. lmg/L 0. 2mg/L+NAA0. Img/用于各品种月季壮苗效果都理想；1/2MS+IBA0. 2mg/L 0. 5mg/L+活性炭5g/L能较好诱导各品种试管苗生根，但黄玫瑰用ΝΑΑ0. 2代替IBA效果更理想。李海燕(2004)通过诱导芽分化和诱导愈伤两种途径，研究不同植物生长调节剂及浓度、对月季外植体萌发和生根的影响。发现，细胞分裂素6-BA分别与3种生长素NAA，IAA, IBA配合使用均能诱导月季出芽。月季开花也有报道秦贺兰(2004)报道了植物生长调节剂对露地月季盛夏开花的影响，发现激素处理可以有效促进腋芽萌发和增加萌芽数量。洪燕萍(2004)报道了月季以月季茎段在MS+NAA0. 5mg/L+BA5mg/L’中进行诱导培养在MS+NAA0. lmg/L+BA3mg/L增技培养，在培养基MS+NAA0. l/mgL+BA2mg/L，大苗开花。周俊辉(2008)用微型月季茎段诱导培养无菌不定芽苗为材料，研究生根与愈伤组织情况、不同氮磷比、不同浓度的蔗糖、2-iP、ABA等处理对离体培养下花芽诱导的影响。结果表明生根不长愈伤组织的无菌不定芽苗的花芽诱导率最低，不生根、长愈伤组织诱导率最高；不同的氮磷比对花芽的诱导率不同，高磷低氮有助于花芽的形成；55g/L的蔗糖浓度较其他浓度对花芽的诱导效果最好；外源激素处理中，2-P和ABA均不利于花芽的诱导。
目前报道的为不论是组培还是试管内开花都不是陕北月季，他们没有做到试管内二倍体和单倍体同时开花的层次。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是。本发明的技术方案如下一种月季试管苗试管内开花及雌蕊单性开花的方法，包括以下步骤(1)将适合陕北地区栽种的月季品种“月月红”当年生的茎段，经过无菌处理接入人工制作的MS培养基中，通过初代培养获得第一代无根试管苗；然后在MS培养基中加入I. 2mg/L的6-节氨基腺嘌呤(6-BA)和O. 15mg/L的3-吲哚丁酸(IBA)，在光照强度为I 5001x+2001x、相对湿度70% ±5%、温度为24°C的条件下继代培养25d ;获得繁殖系数不低于6. 8的无根试管苗； (2)将继代培养获得的无根试管苗转接在不含外源激素的培养基上培养6 8d，再转入含脱落酸和O. 02mg/L的MS培养基中；通过变温培养，培养条件为前5d在散光照射下培养，温度维持早晨8:00 14:00持续升温从18°C到26°C，26°C维持2h，然后逐步降温从16:00 19:00温度降到20°C，从19:00至晚上23:00温度降到12°C，维持12°C至次日8:00 ;在光照强度为I 5001x±3001x、相对湿度70% ±5%。从第6d开始转为8:00 20:00恒温25°C，夜间逐步降温从20:00 0:00温度降到18°C，0:00 4:00温度降到16°C，维持16°C至8:00 ;在光照强度为I 5001x±3001x、相对湿度70% ±5% ;待形成花苞后维持日夜恒温24°C培养；(3)将月季试管苗接入诱导开花的培养基中，采取变温培养，前7d散光培养在光照强度为15001x±3001x、相对湿度70% ±5% ;从第8d开始转为8:00 20:00恒温250C，夜间逐步降温从20:00 0:00温度降到18°C，0:00 4:00温度降到16°C，维持16°C至8:00 ;在光照强度为I 5001x±3001x、相对湿度70% ±5% ;待形成花苞后维持日夜恒温24°C培养；二倍体开花后重复变温培养方式8:00 20:00恒温25°C，夜间逐步降温从20:00 0:00温度降到18°C，0:00 4:00温度降到16°C，维持16°C至8:00 ;在光照强度为I 5001x±3001x、相对湿度70% 5%，约5d后由雌蕊形成单性花蕾，转为维持日夜恒温24°C培养；培养约2 5d后开放；所述诱导开花的培养基成分如下氯化钙(CaCl2 · 2H20)315mg/L,硝酸氨(NH4NO3) 1200mg/L,硝酸钾(KNO3) 1800mg/L,硫酸镁(MgSO4 · 7H20) 300mg/L,磷酸二氢钾(KH2PO4) 200mg/L,硫酸亚铁(FeSO4. 7H20) 29mg/L,己二胺四乙酸二钠(Na2EDTA) 40mg/L,硼酸(H3BO3) 20mg/L，硫酸锰(MnSO4 · H2O) 120. Omg/L，硫酸锌(ZnSO4 · 7H20) 11. Omg/L，钥酸钠(NaZMoO4 · 2H20) O. 30mg/L,硫酸铜(CuSSO4 · 5H20) O. 030mg/L,盐酸硫胺素(维生素BI) I. 2mg/L,盐酸紙卩多辛(维生素B6)0. 6mg/L,烟酸O. 6mg/L,肌醇120mg/L,氨基己酸5. Omg/L,鹿糖 25g/L,琼脂 5. 5g/L, 6-卞氨基腺嘌呤(6_BA)0. 5mg/L,脱落酸(ABA)O. OOlmg/L，3-吲哚乙酸(IBA) O. 2mg/L, pH = 5. 8 ;蔗糖25g/L，琼脂5. 5g/L，6-卞氨基腺嘌呤(6-BA) O. 5mg/L，脱落酸(ABA) O. 001mg/L，3_ 吲哚乙酸(IBA)O. 2mg/L，pH = 5. 8。与现有 MS培养基相比氯化钙、硝酸氨、硝酸钾、硫酸镁等大量元素的含量降低，微量元素和有机元素的含量增减。所述的方法,所述的月季(R.chinensis)为蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa),在陕北野生的月季花。一种月季试管苗二倍体花雌蕊诱导开花的培养基，所述培养基为氯化钙(CaCl2 · 2H20)315mg/L,硝酸氨(NH4NO3) 1200mg/L,硝酸钾(KNO3) 1800mg/L，硫酸镁(MgSO4 · 7H20) 300mg/L,磷酸二氢钾(KH2PO4) 200mg/L,硫酸亚铁(FeSO4 · 7H20) 29mg/L,己二胺四乙酸二钠(Na2EDTA) 40mg/L，硼酸(H3BO3) 20mg/L，硫酸锰(MnSO4 · H2O) 120. Omg/L,硫酸锌(ZnSO4 · 7H20) 11. Omg/L,钥酸钠(NaZMoO4 · 2H20)0. 30mg/L,硫酸铜(CuSSO4 · 5H20) O. 030mg/L,盐酸硫胺素(维生素BI) I. 2mg/L,盐酸毗哆辛(维生素B6)0. 6mg/L,烟酸 O. 6mg/L,肌醇 120mg/L,氨基己酸 5. Omg/L,鹿糖 25g/L,琼脂 5. 5g/L,6-卞氨基腺嘌呤(6-BA) O. 5mg/L，脱落酸(ABA) O. 001mg/L，3-吲哚乙酸(IBA)O. 2mg/L，pH=5. 8。该方法可使二倍体试管苗开花率达到50%左右；可使二倍体花和雌蕊单倍体花呈塔式开放并且同时存在20 35d、开花率达到30%左右。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。步骤一将月季当年生的莖短剪成长约5cm带回实验室。先在自来水下冲洗5 IOmin后，再用84消毒液15ml加蒸懼水到IOOml中浸泡6 8min。然后转入净化工作台备用。在净化工作台中，将月季茎段用75%乙醇+1滴吐温20灭菌10 15s，然后转入O. 1%氯化汞+1滴吐温20中灭菌6min，灭菌结束后用无菌水清洗3 5次。剪掉浸毒部位，余下的部分至少含一个芽体，接入准备好的MS培养基中。等接入的茎段中的液体萌发并长到3 5cm长后，将新形成的芽体取出，转接到在MS培养基中加入I. 2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)和O. 15mg/L的3-吲哚丁酸(IBA)的培养基中，在光照强度为I 5001x±2001x、相对湿度70% ±5%、温度为24°C的条件下培养25d。通过三次连续实验，第一次共接入35个液体，获得了 261个新芽体，第二次实验共接入28个芽体获得了 191个新芽体，第三次实验共接入69个芽体获得了 471个新芽体。繁殖系数均不低于6. 8。步骤二将继代培养获得的无根试管苗在不含激素的MS培养基上培养一次，培养时间为6 8d，培养结束后将植株转入含脱落酸和O. 02mg/L的MS培养基中。采用变温培养的方式培养。通过变温培养，培养条件为前5d在散光照射下培养，温度维持早晨8:00 14:00持续升温从18°C到26°C，26°C维持2h，然后逐步降温从16:00 19:00温度降到20V，从19:00至晚上23:00温度降到12°C，维持12°C至次日8:00 ;在光照强度为I 5001x±3001x、相对湿度70% ±5%。从第6d开始转为8:00 20:00恒温25°C，夜间逐步降温从20:00 0:00温度降到18°C，0:00 4:00温度降到16 °C，维持16 °C至8:00 ;在光照强度为I5001x±3001x、相对湿度70% ±5%。待形成花苞后维持日夜恒温24°C培养。一般可形成50%左右的试管花卉。第一次实验150株，获得76株开花试管苗、第二次实验230株获得109株开花试管苗、第三次300株获得157株开花试管苗。上述培养基配方为
氯化钙(CaCl2·2Η20) 315mg/L、原MS 培养基中为 440mg/L ;硝酸氨(NH4NO3) 1200mg/L,原MS培养基中为1600mg/L ;硝酸钾(KNO3) 1800mg/L、原MS培养基中为1900mg/L ;硫酸镁(MgSO4 · 7H20)300mg/L、原 MS 培养基中为 370mg/L ;磷酸二氢钾(KH2PO4) 200mg/L、原 MS培养基中为170mg/L ;硫酸亚铁(FeSO4 · 7H20) 29mg/L、原MS培养基中为27. 8mg/L ；己二胺四乙酸二钠(Na2EDTA) 40mg/L、原 MS 培养基中为 37. 3mg/L ；硼酸(H3BO3) 20mg/L、原 MS培养基中为6. 2mg/L ;硫酸锰(MnSO4. H2O) 120. Omg/L、原MS培养基中为22. 3mg/L ;硫酸锌(ZnSO4 ·7Η20) 11. Omg/L、原MS培养基中为8. 6mg/L ;，钥酸钠(NaZMoO4. 2H20)O. 30mg/L、原MS培养基中为O. 25mg/L ;硫酸铜(CuSSO4 · 5H20)O. 030mg/L、原MS培养基中为O. 025mg/L ;盐酸硫胺素(维生素BI) I. 2mg/L、原MS培养基中为O. lmg/L ;盐酸毗哆辛(维生素B6) O. 6mg/L、原MS培养基中为O. 5mg/L ;烟酸O. 6mg/L、原MS培养基中为O. 5mg/L ;肌醇120mg/L、原MS培养基中为100mg/L ;氨基己酸5. Omg/L、原MS培养基中为2. Omg/L ;蔗糖25g/L，琼脂5. 5g/L，6-卞氨基腺嘌呤(6-BA) O. 5mg/L,脱落酸(ABA) O. 001mg/L，3_ 吲哚乙酸(IBA)O. 2mg/L, pH = 5· 8ο步骤四将步骤二中获得的月季试管苗接入上述培养基中，采取变温培养，前7d散光培养在光照强度为I 5001x±3001x、相对湿度70% ±5% ;从第8d开始转为8:00 20:00恒温25 V，夜间逐步降温从20:00 0:00温度降到18°C，0:00 4:00温度降到16°C，维持16°C至8:00 ;在光照强度为I 5001x±3001x、相对湿度70% ±5%。待形成花苞后维持日夜恒温24°C培养；二倍体开花后重复变温培养方式8:00 20:00恒温25°C，夜间逐步降温从20:00 0:00温度降到18°C，0:00 4:00温度降到16°C，维持16°C至8:00 ;在光照强度为I 5001x±3001x、相对湿度70% ±5%，约5d后由雌蕊形成单性花蕾，转为维持日夜恒温24°C培养。培养约2 5d后开放。该方法可获得30%左右的双层花。第一次试验共接种122株，获得二倍体和雌蕊单倍体开花的植株43株；第二次实验共接种150株，获得二倍体和雌蕊单倍体开花的植株55株；第一次试验共接种136株，获得二倍体和雌蕊单倍体开花的植株42株。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.一种月季试管苗试管内开花及雌蕊单性开花的方法，其特征在于，包括以下步骤(I)将适合陕北地区栽种的月季品种“月月红”当年生的茎段，经过无菌处理接入人工制作的MS培养基中，通过初代培养获得第一代无根试管苗；然后在MS培养基中加入I. 2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)和O. 15mg/L的3-吲哚丁酸(IBA)，在光照强度为I 5001x±2001x、相对湿度70% ±5%、温度为24°C的条件下继代培养25d ;获得繁殖系数不低于6. 8的无根试管苗； (2)将继代培养获得的无根试管苗转接在不含外源激素的MS培养基上培养6 8d，再转入含脱落酸和O. 02mg/L的MS培养基中；通过变温培养，培养条件为前5d在散光照射下培养，温度维持早晨8:00 14:00持续升温从18°C到26°C，26°C维持2h，然后逐步降温从16:00 19:00温度降到20°C，从19:00至晚上23:00温度降到12°C，维持12°C至次日8:00 ;在光照强度为I 5001x±3001x、相对湿度70% ±5%。从第6d开始转为8:00 20:00恒温25 V，夜间逐步降温从20:00 0:00温度降到18°C，0:00 4:00温度降到16°C，维持16°C至8:00 ;在光照强度为I 5001x±3001x、相对湿度70% ±5% ;待形成花苞后维持日夜恒温24°C培养； (3)将月季试管苗接入诱导开花的培养基中，采取变温培养，前7d散光培养在光照强度为I 5001x±3001x、相对湿度70% ±5% ;从第8d开始转为8:00 20:00恒温25°C，夜间逐步降温从20:00 0:00温度降到18 °C，0:00 4:00温度降到16 °C，维持16 °C至8:00 ;在光照强度为I 5001x±3001x、相对湿度70% ±5% ;待形成花苞后维持日夜恒温24°C培养；二倍体开花后重复变温培养方式8:00 20:00恒温25°C，夜间逐步降温从20:00 0:00温度降到18°C，0:00 4:00温度降到16°C，维持16°C至8:00 ;在光照强度为I 5001x±3001x、相对湿度70% ±5%，约5d后由雌蕊形成单性花蕾，转为维持日夜恒温24°C培养；培养约2 5d后开放； 所述诱导开花的培养基成分如下氯化钙(CaCl2 · 2H20)315mg/L，硝酸氨(NH4NO3) 1200mg/L,硝酸钾(KNO3) 1800mg/L,硫酸镁(MgSO4. 7H20) 300mg/L,磷酸二氢钾(KH2PO4) 200mg/L，硫酸亚铁(FeSO4 · 7H20) 29mg/L,己二胺四乙酸二钠(Na2EDTA) 40mg/L，硼酸(H3BO3) 20mg/L，硫酸锰(MnSO4 · H2O) 120. Omg/L，硫酸锌(ZnSO4 · 7H20) 11. Omg/L，钥酸钠(NaZMoO4 · 2H20) O. 30mg/L,硫酸铜(CuSSO4 · 5H20) O. 030mg/L,盐酸硫胺素(维生素BI) I. 2mg/L,盐酸紙卩多辛(维生素B6)0. 6mg/L,烟酸O. 6mg/L,肌醇120mg/L,氨基己酸5.Omg/L,鹿糖 25g/L,琼脂 5. 5g/L, 6-卞氨基腺嘌呤(6_BA)0. 5mg/L,脱落酸(ABA)O. OOlmg/L，3-吲哚乙酸(IBA) O. 2mg/L, pH = 5. 8 ;蔗糖25g/L，琼脂5. 5g/L，6-卞氨基腺嘌呤(6-BA) O. 5mg/L，脱落酸(ABA) O. 001mg/L，3_ 吲哚乙酸(IBA)O. 2mg/L，pH = 5. 8。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的月季(R.chinensis)为蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa),在陕北野生的月季花。
3.一种月季试管苗二倍体花雌蕊诱导开花的培养基，其特征在于，所述培养基为氯化钙(CaCl2 · 2H20)315mg/L,硝酸氨(NH4NO3) 1200mg/L,硝酸钾(KNO3) 1800mg/L，硫酸镁(MgSO4 · 7H20) 300mg/L,磷酸二氢钾(KH2PO4) 200mg/L,硫酸亚铁(FeSO4 · 7H20) 29mg/L,己二胺四乙酸二钠(Na2EDTA) 40mg/L，硼酸(H3BO3) 20mg/L，硫酸锰(MnSO4 · H2O) 120. Omg/L,硫酸锌(ZnSO4 · 7H20) 11. Omg/L,钥酸钠(NaZMoO4. 2H20)0. 30mg/L,硫酸铜(CuSSO4 · 5H20) O. 030mg/L,盐酸硫胺素(维生素BI) I. 2mg/L,盐酸毗哆辛(维生素B6)0. 6mg/L,烟酸 0. 6mg/L,肌醇 120mg/L,氨基己酸 5. Omg/L,鹿糖 25g/L,琼脂 5. 5g/L,6-卞氨基腺嘌呤(6-BA) O. 5mg/L，脱落酸(ΑΒΑ) 0. 001mg/L，3-吲哚乙酸(IBA)O. 2mg/L, pH=5. 8。
全文摘要
本发明公开了一种月季试管苗试管内开花及雌蕊单性开花的方法及其培养基，包括以下步骤①继代培养获得的无根试管苗；②月季无根试管苗二倍体试管内开花；③月季试管苗二倍体花雌蕊诱导开花；该方法可使二倍体试管苗开花率达到50％左右；可使二倍体花和雌蕊单倍体花呈塔式开放并且同时存在20～35d、开花率达到30％左右。
文档编号A01H4/00GK102870681SQ20121040832
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月22日 优先权日2012年10月22日
发明者齐向英, 陈宗礼, 张向前, 陈国梁, 薛皓, 孙志宏 申请人:延安大学