一种霍山石斛的快速繁殖方法
【专利摘要】一种霍山石斛的快速繁殖方法，取石斛果实内种子或茎尖或带腋芽的幼茎，果在纯乙醇中浸一下，然后在酒精灯火焰上燃烧，然后用于接种；茎尖或幼茎经清水冲洗后，分别用75％酒精、0.2％氯化汞(升汞)溶液进行表面消毒，无菌水冲洗3-4次，置于灭菌后的滤纸上吸干水分，于无菌条件下，将茎段剪成0.5-1.5cm的带节小段，接种在培养基中，待种子萌发或茎尖和幼茎长成拟原球茎，进行继代培养大量增殖，然后将原球茎放在分化芽的培养基上，待芽条高2-3cm时转入生根培养基，待试管苗具4-5片伸展叶，根系正常，高度达6cm及以上时，出瓶移栽。
【专利说明】一种霍山石斛的快速繁殖方法
[0001]所属领域:本发明涉及生物【技术领域】，具体地，涉及霍山石斛的快速繁殖方法。
[0002]【背景技术】:霍山石斛是兰科石解属药用植物，在自然条件下，种子需与真菌共生才能萌发，发芽率极低。极低的繁殖率和人们长期无节制的采挖使野生铁皮石斛资源日渐枯竭，市场急缺。解决霍山石斛市场需求问题的有效途径就是要扩大种植面积和种植地域，因此种苗来源尤其是优质种苗的筛选成为函待解决的问题。最有效的方法就是通过植物组织培养技术进行人工快速繁优良种苗。
[0003]
【发明内容】
:本发明的目的在于提供一种石斛种苗快速繁殖方法，以挽救濒危的石斛类物种，使之成为可再生药源，并为石斛类GAP种植提供技术参考和实用价值。为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案:
[0004]霍山石斛的快速繁殖方法:取石斛果实内种子或茎尖或带腋芽的幼茎，果在纯乙醇中浸一下，然后在酒精灯火焰上燃烧，然后用于接种；茎尖或幼茎经清水冲洗后，分别用75%酒精、0.2%氯化汞(升汞)溶液进行表面消毒，无菌水冲洗3-4次，置于灭菌后的滤纸上吸干水分，于无菌条件下，将茎段剪成0.5-1.5cm的带节小段，接种在培养基中，待种子萌发或茎尖和幼茎长成拟原球茎，进行继代培养大量增殖，然后将原球茎放在分化芽的培养基上，待芽条高2-3cm时转入生根培养基，待试管苗具4-5片伸展叶，根系正常，高度达6cm及以上时，出瓶移栽。 [0005]具体地，取野外采集或杂交授粉所结的果实，在酒精灯燃烧灭菌后，在无菌条件下将果皮打开，将种子播种在花宝I号(N: P: K = 7: 6: 19)3g/L的琼脂培养基上；而开裂果用尼龙布包裹散落种子，在0.2% HgCl2中消毒6-8min，无菌水冲洗干净后播种在花宝I号(N:P:K = 7:6: 19) 3g/L的琼脂培养基上；未成熟的果内种子可播种在花宝I号3g/L+NAAlmg/L的琼脂培养基上，培养室温度25±2°C，光照强度为1500-2000Lx，光照12h/d，培养基PH为5，培养8-12天种子由黄色转绿，呈球形增大，基部有丝状毛的原球茎，继代培养在1/2MS+NAA1+土豆泥3% +香蕉泥15%的琼脂培养基上，30天后，分化出Icm小芽和0.5cm丛芽，又经过1-2个月的培养可得到高约2-3cm芽条，转入1/2MS+NAA1+土豆泥3% +香蕉泥15%的生根壮苗培养基培养I个月后加强光照至4000LX，培养一个月，当试管苗具4-5片伸展叶，根系正常，高度达6cm时，即可出瓶供移栽，出瓶时清除根系上的琼脂，
3-5株一丛种植，种植基质有锯末、树皮、苔薛和陶粒等，基质要用20: I的水:甲醛密封消毒24h或用热蒸汽消毒，栽后放在荫蔽度70%大棚内，棚内温度控制在20°C -28°C，注意保湿和排水，8-16天用1/10MS液喷施一次，待试管苗长出新根或新叶后便可定植。
[0006]具体地，将野外采集到的石斛茎尖或带腋芽的幼茎切段灭菌后接种在l/2MS+NAAlmg/L+土豆泥3%十香蕉泥15%的琼脂培养基上，培养室温度保持为25±2°C，光照强度为1500-2000LX，光照12h/d，培养基PH为5，培养30-60天，腋芽处可抽生新枝，新枝可切割重复培养，茎尖抽生新枝短呈丛芽状，在上述培养基上继续培养，长成完整试管苗供移栽，出瓶时清除根系上的琼脂，3-5株一丛种植，种植基质有锯末、树皮、苔鲜和陶粒等，基质要用20: I的水:甲醛密封消毒24h或用热蒸汽消毒，栽后放在大棚内荫蔽度70%，棚内温度控制在20°C _28°C，注意保湿和排水，8-16天用1/10MS液喷施一次。【具体实施方式】:
[0007]实施例1:
[0008]I材料与方法
[0009]1.1供试材料
[0010]霍山石斛:选自广南、思茅、浙江、盈江
[0011]1.2 方法
[0012]培养室温度25±2°C，保存室温度15-20°C，光照强度为1500-2000Lx，光照12h/d。培养基随培养目的和不同发育阶段有所不同。培养基PH为5。
[0013]外植体来源于石斛属各种的果实内种子或茎尖，果在纯乙醇中浸一下，然后在酒精灯火焰上燃烧，然 后用于接种；茎尖或幼茎经清水冲洗后，分别用75%酒精、0.2%氯化汞(升汞)溶液进行表面消毒，无菌水冲洗3-4次，置于灭菌后的滤纸上吸干水分，于无菌条件下，将茎段剪成0.5-1.5cm的带节小段，接种在培养基中。
[0014]2 结果
[0015]2.1组织培养和快速繁殖技术
[0016]本发明为了保持遗传性稳定和规模化生产目的，采用了种子无菌培养和茎尖、茎节分生组织培养两种方式。
[0017]2.1.1种子无菌培养
[0018]种子来源于野外采集和自己杂交授粉所结的果实。野外采集的开裂果，收集种子用尼龙布包裹，在0.2%氯化汞中消毒7min，无菌水冲洗干净后播种在花宝I号(N: P: K= 7:6: 19)3g/L的琼脂培养基上。完整的果实在酒精灯燃烧灭菌后即可将果皮打开，将种子播种在上述培养基上。石斛属种子大多呈黄色，培养约10天左右即可转绿，增大，继而长成顶端有叶尖或冒出的芽，基部有丝状毛的原球茎，显示种子萌发且萌发率较高(达95%以上)。
[0019]2.1.2分生组织培养
[0020]将野外采集到的石解属茎尖或带腋芽的幼茎切段灭菌后接种在l/2MS+NAAlmg/L+土豆泥3% +香蕉泥15%的琼脂培养基上，培养30天左右，腋芽处可抽生新枝，新枝可切割重复培养，茎尖抽生新枝短呈丛芽状。在此培养基上，它们可长成完整试管苗，供移栽。如果把茎尖和幼茎接种在1/2MS或1/2MS+BA0.5+NAA0.2的琼脂培养基上，外植体基部可分化出大量拟原球茎。拟原球茎在1/2MS+NAA1+ 土豆泥3% +香蕉泥15%的琼脂培养基上，也可以长成大苗供移栽。
[0021]2.1.3继代繁殖
[0022]石斛属原球莖增殖速度25天至50天(依种量)平均可达1: 5_10倍。上一步骤原球茎和拟原球茎培养基培养30天左右，可得到10% Icm小芽和10% 0.5cm丛芽，又经过1-2个月的培养可得到高约2-3cm芽条(占50%左右)，转入生根壮苗培养基(1/2MS十NAAl+土豆泥3%+香蕉泥15%)培养I个月后加强光照(4000LX及以上)，培养一个月左右，试管苗可达到移苗标准。整个生产周期月4.5个月到6个月。
[0023]2.1.4试管苗移栽
[0024]当试管苗至少4-5片伸展叶根系正常，健康，高度达6cm左右时，即可出瓶供移栽，出瓶时要小心不能折伤叶片和根尖，清除根系上的琼脂，3-5株一丛种植，种植基质有锯末、树皮、苔鲜和陶粒等，基质要用20: I的水:甲醛密封消毒2411或用热蒸汽消毒。栽后放在大棚内荫蔽度约70%，棚内温度控制在20°C -28°C，注意保湿和排水。待试管苗长出新根或新叶后，8-16天用1 /10MS液，喷施一次，促进幼苗生长。
【权利要求】
1.一种霍山石斛的快速繁殖方法，其特征在于取石斛果实内种子或茎尖或带腋芽的幼茎，果在纯乙醇中浸一下，然后在酒精灯火焰上燃烧，然后用于接种；茎尖或幼茎经清水冲洗后，分别用75%酒精、0.2%氯化汞(升汞)溶液进行表面消毒，无菌水冲洗3-4次，置于灭菌后的滤纸上吸干水分，于无菌条件下，将茎段剪成0.5-1.5cm的带节小段，接种在培养基中，待种子萌发或茎尖和幼茎长成拟原球茎，进行继代培养大量增殖，然后将原球茎放在分化芽的培养基上，待芽条高2-3cm时转入生根培养基，待试管苗具4-5片伸展叶，根系正常，高度达6cm及以上时，出瓶移栽。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于取野外采集或杂交授粉所结的果实，完整的果实在酒精灯燃烧灭菌后，在无菌条件下将果皮打开，将种子播种在花宝I号((N: P: K= 7:6: 19) 3g/L的琼脂培养基上；开裂果，用尼龙布包裹散落种子，在0.2% HgCl2中消毒6-8min，无菌水冲洗干净后播种在花宝I号(N: P: K = 7: 6: 19)3g/L的琼脂培养基上；未成熟的果内种子可播种在花宝I号3g/L+NAAlmg/L的琼脂培养基上，培养室温度25±2°C，光照强度为1500-2000LX，光照12h/d，培养基PH为5，培养8_12天种子由黄色转绿，呈球形增大，基部有丝状毛的原球茎，继代培养在1/2MS+NAA1+土豆泥3% +香蕉泥15%的琼脂培养基上，30天后，分化出Icm小芽和0.5cm丛芽，又经过1_2个月的培养可得到高约2-3cm芽条，转入1/2MS+NAA1+土豆泥3% +香蕉泥15 %的生根壮苗培养基培养I个月后加强光照至4000LX培养一个月，当试管苗具4-S片伸展叶，根系正常，高度达6cm时，即可出瓶供移栽，出瓶时清除根系上的琼脂，3-5株一丛种植，种植基质有锯末、树皮、苔鲜和陶粒等，基质要用20: I的水:甲醛密封消毒24h或用热蒸汽消毒，栽后放在荫蔽度70%大棚内，棚内温度控制在20°C _28°C，注意保湿和排水，8-16天用1/10MS液喷施一次，待试管苗长出新根或新叶后便可定植。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于将野外采集到的石斛茎尖或带腋芽的幼茎切段灭菌后接种在l/2MS+NAAlmg/L+ 土豆泥3% +香蕉泥15%的琼脂培养基上，培养室温度保持为25±2°C，光 照强度为1500-2000LX，光照12h/d，培养基PH为5，培养30-60天，腋芽处可抽生新枝，新枝可切割重复培养，茎尖抽生新枝短呈丛芽状，在上述培养基上继续培养，长成完整试管苗供移栽；也可接种在1/2MS或1/2MS+BA0.5+NAA0.2的琼脂培养基上，外植体基部可分化出大量拟原球茎，拟原球茎在1/2MS+NAA1+土豆泥3% +香蕉泥15%的琼脂培养基上培养30天后，分化出Icm小芽和0.5cm丛芽，又经过1_2个月的培养可得到高2-3cm芽条，再转入1/2MS+NAA1+ 土豆泥3% +香蕉泥15%的生根壮苗培养基培养I个月，此时光照加强至4000LX，当试管苗具4-5片伸展叶，根系正常，高度达6em时，即可出瓶供移栽，出瓶时清除根系上的琼脂，3-5株一丛种植，种植基质有锯末、树皮、苔醉和陶粒等，基质要用20: I的水:甲醛密封消毒24h或用热蒸汽消毒，栽后放在大棚内荫蔽度70%，棚内温度控制在20°C _28°C，注意保湿和排水，8-16天用1/10MS液喷施一次。
【文档编号】A01H4/00GK104012401SQ201310061665
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2013年2月28日 优先权日:2013年2月28日
【发明者】毛健, 姬中伟, 张敏, 牟穰, 阳志锐, 郭燕飞, 黎卫, 冯东阳, 巩丹, 刘芸雅 申请人:江南大学