一种山葵脱毒苗的培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种山葵脱毒苗的培养方法，该方法选用无菌的山葵芽体为培养材料，经变温处理后，取其芽分生组织接入丛生芽分化培养基中，再经壮苗培养基和生根培养基的诱导培养而获得山葵脱毒苗，所培养的山葵脱毒苗具有生长速度快、有效组分含量高等优点。本发明方法为山葵优良品种的快速培育提供了一条新途径。
【专利说明】一种山葵脱毒苗的培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种山葵植物的组织培养方法，特别是涉及一种山葵脱毒苗的培养方法。
【背景技术】
[0002]山葵(Wasabi japonica Matsum)又名山箭菜、山菜，为十字花科山箭菜，属多年生半阴生草本植物。山葵中含有一种芥子苷类的物质，在植物体被磨碎时，该物质在芥子苷酶的作用下水解形成异硫氰酸酯类化合物，具有杀菌、防腐、利尿、清血、抗感染、抗癌等多种药用活性，是国际上公认的极为稀缺和珍贵的药食同源植物。
[0003]山葵植物在自然条件下生长常受到许多病虫害的危害，如在何月秋等人的研究文献《云南省山葵常见病害和症状调查》中专门报道了山葵植物有墨入病、霜霉病、白锈病、立枯病、软腐病、病毒病和根结线虫病等多种常见病害症状，其中以墨入病对山葵的叶、叶柄、根茎、根须造成的危害最大，直接造成山葵产品的质量下降和减产，严重时还会造成山葵植物全部死亡；立枯病主要危害幼苗基部，有时在种子萌发后尚未出土就变褐死亡；病毒病的患病植株表现为叶片大多叶脉间失绿，呈黄绿色相间的花叶状，有的叶片变小、畸形，叶脉对光有明脉现象，植株长势不良；软腐病主要危害根茎及叶柄，根茎危害初期，外围叶片在烈日下表现萎蔫，严重时根茎内部组织崩解，产生灰白色恶臭的菌脓，最后整株萎蔫死亡。因此，为保持山葵植物的优良品质，并提高其产量，有必要提供一种山葵植物的组织培养方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种山葵脱毒苗的培养方法。
[0005]本发明提供的山葵脱毒苗的培养方法包括如下步骤:
[0006](1)切取山葵根茎上生长的芽体的芽尖部分，将其放在超净工作台上，先用
0.1%的升汞消毒2~5分钟，再用无菌水清洗后，接种于促进芽尖快速生长的培养基MS+KT0.5 ~L 5mg.L_1+NAA0.3 ~L Omg.1 中，在 12 ~20°C、每天光照 6 ~12 小时、光照强度为1000~15001x的条件下进行培养；
[0007](2)选取步骤(1)中培养的长度在1.0cm以上的无菌芽体，转接入MS+6-BA1~
3.0mg.L_1+IAA0.5~2.0mg.L_1+脯氨酸0.5~2%+活性炭1~3%的培养基中，先在5°C的条件下培养15天，再放在培养箱中进行8~15天的变温处理；
[0008] (3)选取生长良好的芽体于解剖镜下，用解剖针小心剥去芽体外面的幼叶后，切取带有1~4个叶原基的芽分生组织，接入丛生芽分化培养基MS+6-BA1.0~3mg '+ΚΤΟ.1~0.5mg 1中，在15~22°C、每天光照10~14小时、光照强度为1000~15001x的条件下培养；
[0009](4)选取生长的山葵丛生芽，将其分割为单株后转入壮苗培养基MS+NAA0.05~
0.lmg.L ^Θ-ΒΑΟ.1 ~0.5mg.L ^KT0.05 ~0.2mg.L 1 中，在 10 ~18 °C、每天光照 10 ~16小时、光照强度为1000~15001x的条件下培养；
[0010](5)选取生长健壮的山葵无根苗接入生根培养基White+NAA0.1~1.0mg.L—1中，在15~22°C、每天光照6~10小时、光照强度为800~ΙΟΟΟΙχ的条件下诱导生根；
[0011](6)当无根苗长出3~4条以上不定根时，打开瓶盖，在室内炼苗2~4天后，将其从培养瓶中取出，用无菌水洗去不定根上的培养基后，移栽至消毒后的土壤中生长。
[0012]进一步地，步骤(1)中所述芽体的芽尖部分是指芽体上部长度为0.2~0.5cm的牙尖部分。
[0013]进一步地，步骤(2)中所述变温处理是指在8~12°C的条件下培养19小时与在30~45°C的条件下培养5小时交替进行。
[0014]进一步地，步骤(6)中所述土壤是由蛭石和全营养土按2:1配制而成，土壤消毒是指先采用0.1%多菌灵消毒6~10小时，再用0.1%高锰酸钾消毒12~24小时。
[0015]进一步地，步骤(6)中炼苗的培养条件为温度15~20°C和相对湿度80%~95%，移栽后的培养条件为培养温度12~20°C、相对湿度为70~80%、每天光照4~10小时和光照强度为800~12001x。
[0016]上述所有培养基的pH值为5.6~6.2，琼脂5.5~6.5g.?Λ蔗糖25~35g.L-1。
[0017]本发明选用无菌的山葵芽体为培养材料，经变温处理后，取其芽分生组织接入丛生芽分化培养基中，再经壮苗培养基和生根培养基的诱导培养而获得山葵脱毒苗，所培养的山葵脱毒苗具有生长速度快、有效组分含量高等优点。本发明方法为山葵优良品种的快速培育提供了一条新途径。
[0018]下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
【具体实施方式】
[0019]实施例1
[0020](1)切取山葵根茎上生长的芽体上部长度为0.2cm的芽尖部分，将其放在超净工作台上，先用0.1%的升汞消毒2分钟，再用无菌水清洗4次后，接种于促进芽尖快速生长的培养基MS+KT0.5mg.L^+NAA0.3mg.L-11中，在温度12°C、每天光照6小时、光照强度为ΙΟΟΟΙχ的条件下培养25天，长到1.0cm以上的无菌芽体有89.32% ；
[0021](2)选取步骤(1)中培养的长度在1.0cm以上的无菌芽体，转接入MS+6-BA1.0mg.L-1+IAA0.5mg.L^+脯氨酸0.5%+活性炭1.0%的培养基中，先置于5°C的冰箱中低温培养15天，再放在培养箱中进行8天的变温处理，所述变温处理是指在8°C的条件下培养19小时与在30°C的条件下培养5小时交替进行，芽体的存活率为98.68% ；
[0022](3)选取经步骤(2)处理后生长良好的芽体于解剖镜下，用解剖针小心剥去芽体外面的幼叶后，切取带有1个叶原基的芽分生组织，接入丛生芽分化培养基MS+6-BA1.0mg -'+ΚΤΟ.lmg.L—1中，在温度15°C、每天光照14小时、光照强度为ΙΟΟΟΙχ的条件下培养30天，丛生芽的诱导率为32.53%，将培育的山葵丛生芽采用双抗体夹心ELISA方法进行病毒检测，其脱毒率为96.46% ；
[0023](4)选取生长的山葵丛生芽，将其分割为单株后转入壮苗培养基MS+NAA0.05mg *L_^Θ-ΒΑΟ.lmg -L-1'+ΚΤΟ.05mg七1中，在温度10°C、每天光照10小时、光照强度为ΙΟΟΟΙχ的条件下培养25天；[0024](5)选取选取步骤(4)中培育的生长健壮的山葵无根苗接入生根培养基White+NAA0.lmg -L-1中，在温度15°C、每天光照6小时、光照强度为8001x的条件下培养30天，山葵无根苗的生根率为84.63% ；
[0025](6)当无根苗长出3条以上不定根时，打开瓶盖，先在温度为15°C和相对湿度为80%的培养室内炼苗2天，再将其从培养瓶中取出，用无菌水洗去不定根上的培养基后，移栽至由0.1%多菌灵消毒6小时和0.1%高锰酸钾消毒12小时的土壤中生长，所述土壤是由蛭石和全营养土按2:1配制而成；脱毒苗在温度12°C、相对湿度70%、每天光照4小时和光照强度为8001x的条件下生长，脱毒苗的存活率为92.62% ；
[0026]上述所有培养基的pH值为5.6，琼脂5.5g.L—1，蔗糖25g.L—1。
[0027]实施例2
[0028](1)切取山葵根茎上生长的芽体上部长度为0.3cm的芽尖部分，将其放在超净工作台上，先用0.1%的升汞消毒3分钟，再用无菌水清洗5次后，接种于促进芽尖快速生长的培养基MS+KT1.0mg.L-1+ΝΑΑΟ.5mg.L-1中，在温度18°C、每天光照8小时、光照强度为12001x的条件下进行培养25天，长到1.0cm以上的无菌芽体有92.26% ；
[0029](2)选取步骤(1)中培养的长度在1.0cm以上的无菌芽体，转接入MS+6-BA2.0mg-L-1+IAAl.5mg.L-1+脯氨酸1.2%+活性炭2.0%的培养基中，先置于5°C的冰箱中低温培养15天，再放在培养箱中进行12天的变温处理，所述变温处理是指在10°C培养19小时与在35°C培养5小时交替进行，芽体的存活率为96.57% ；
[0030](3)选取经步骤(2)处理后生长良好的芽体于解剖镜下，用解剖针小心剥去芽体外面的幼叶后，切取带有2个叶原基的芽分生组织，接入丛生芽分化培养基MS+6-BA2.0mg -L-1+ΚΤΟ.3mg -L-1中，在温度18°C、每天光照12小时、光照强度为12001x的条件下培养30天，丛生芽的诱导率为51.42% ;将培育的山葵丛生芽采用双抗体夹心ELISA方法进行病毒检测，其脱毒率为94.76% ；
[0031](4)选取生长的山葵丛生芽，将其分割为单株后转入壮苗培养基MS+NAA0.08mg-L_1+6-BA0.3mg -L-1+KT0.lmg吨―1中，在温度15°C、每天光照12小时、光照强度为12001x的条件下培养25天；
[0032](5)选取步骤(4)中培育的生长健壮的山葵无根苗接入生根培养基White+NAA0.5mg -L-1中，在温度18°C、每天光照8小时、光照强度为9001x的条件下培养30天，山葵无根苗的生根率为92.13% ；
[0033](6)当无根苗长出4条以上不定根时，打开瓶盖，先在温度为18°C和相对湿度为88%的培养室内炼苗3天，再将其从培养瓶中取出，用无菌水洗去不定根上的培养基后，移栽至由0.1%多菌灵消毒8小时和0.1%高锰酸钾消毒18小时的土壤中生长，所述土壤是由蛭石和全营养土按2:1配制而成；脱毒苗在温度16°C、相对湿度75%、每天光照6小时和光照强度为1000lx的条件下生长，脱毒苗的存活率为98.37% ；
[0034]上述所有培养基的pH值为5.8，琼脂6.0g.L-1蔗糖30g.L'
[0035]实施例3
[0036](1)切取山葵根茎上生长的芽体上部长度为0.5cm的芽尖部分，将其放在超净工作台上，先用0.1%的升汞消毒5分钟，再用无菌水清洗6次后，接种于促进芽尖快速生长的培养基MS+KT1.5mg.L1+NAAl.0mg.L—1中，在温度20°C、每天光照12小时、光照强度为15001x的条件下进行培养25天，长到1.0cm以上的无菌芽体有100% ；
[0037](2)选取步骤(1)中培养的长度在1.0cm以上的无菌芽体，转接入MS+6-BA3.0mg.L-1+ΙΑΑ2.0mg.L^+脯氨酸2%+活性炭3%的培养基中，先置于5°C的冰箱中低温培养15天，再放在培养箱中进行15天的变温处理，所述变温处理是指在12°C的条件下培养19小时与在45°C的条件下培养5小时交替进行，芽体的存活率为83.36% ；
[0038](3)选取经步骤(2)处理后生长良好的芽体于解剖镜下，用解剖针小心剥去芽体外面的幼叶后，切取带有4个叶原基的芽分生组织，接入丛生芽分化培养基MS+6-BA3.0mg -L^+KT0.5mg -L-1中，在温度22°C、每天光照14小时、光照强度为15001x的条件下培养30天，丛生芽的诱导率为76.45% ;将培育的山葵丛生芽采用双抗体夹心ELISA方法进行病毒检测，其脱毒率为73.52% ；
[0039](4)选取生长的山葵丛生芽，将其分割为单株后转入壮苗培养基MS+NAA0.lmg.Ι^+6-ΒΑ0.5mg -L^+KT0.2mg -L-1中，在温度18°C、每天光照16小时、光照强度为15001x的条件下培养25天；
[0040](5)选取步骤(4)中培育的生长健壮的山葵无根苗接入生根培养基ffhite+NAAl.0mg -L-1中，在温度22°C、每天光照10小时、光照强度为ΙΟΟΟΙχ的条件下培养30天，山葵无根苗的生根率为89.21% ；
[0041](6)当无根苗长出4条以上不定根时，打开瓶盖，先在温度为20°C和相对湿度为95%的培养室内炼苗4天，再将其从培养瓶中取出，用无菌水洗去不定根上的培养基后，移栽至由0.1%多菌灵消毒10小时和0.1%高锰酸钾消毒24小时的土壤中生长，所述土壤是由蛭石和全营养土按2:1配制而成；脱毒苗在温度20°C、相对湿度80%、每天光照10小时和光照强度为12001x的条件下生长，脱毒苗的存活率为97.16% ；
[0042]上述所有培养基的pH值为6.2，琼脂6.5g.?Λ蔗糖35g.L'
[0043]实施例4
[0044]将实施例2步骤(1)中所述促进芽尖快速生长的培养基改为MS+KT0.5mg.L-1+ΝΑΑΟ.8mg.?Λ其它步骤同实施例2，培养25天后，长到1.0cm以上的无菌芽体有90.57%。
[0045]实施例5
[0046]将实施例2步骤(2)中所述培养基改为MS+6-BA1.0mg.L-1+ΙΑΑΙ.5mg.L^+脯氨酸1.2%+活性炭2.0%，变温处理的时间改为10天，其他步骤同实施例2，芽体的存活率为94.53%。
[0047]实施例6
[0048]将实施例2步骤(2)中山葵无菌芽体的变温处理方式改为在8°C的条件下培养19h与在40°C条件下培养5h交替进行，其他步骤同实施例2，培育的山葵丛生芽用双抗体夹心ELISA方法进行病毒检测，其脱毒率为95.06%。
[0049]实施例7
[0050]将实施例2步骤(3)中所述叶原基的芽分生组织改接入MS+6-BAlmg -L-1+ΚΤΟ.5mg -L-1的丛生芽分化培养基中，在温度16°C，每天光照13小时和光照强度为ΙΟΟΟΙχ的条件下培养30天，其他步骤同实施例2，丛生芽的诱导率为49.82%。
[0051]比较实施例1[0052]将实施例2步骤(2)中所述培养基改为MS+6-BA2.0mg.1^+2.4-D2.0mg.L_1+活性炭2.0%，其他步骤同实施例2，芽体的存活率为57.86%。
[0053]比较实施例2
[0054]将实施例2步骤(2)中山葵无菌芽体的变温处理方式改为在5°C的条件下培养5h与在45°C条件下培养19h交替进行，其他步骤同实施例2，芽体的存活率为12.56%。
[0055]比较实施例3
[0056]将实施例2的步骤(2)取消，其他步骤同实施例2，培育的山葵丛生芽用双抗体夹心ELISA方法进行病毒检测，其脱毒率为31.43%。
[0057]比较实施例4
[0058]将实施例2步骤(5)中将实 施实例2中所述的生根培养基改为MS+NAA0.5mg -L-1,其他步骤同实施例2，山葵无根苗的生根率为79.73%。
【权利要求】
1.一种山葵脱毒苗的培养方法，其特征在于包括如下步骤:(1)切取山葵根茎上生长的芽体的芽尖部分，将其放在超净工作台上，先用0.1%的升汞消毒2~5分钟，再用无菌水清洗后，接种于促进芽尖快速生长的培养基MS+KT0.5~1.5mg.L_1+NAA0.3~1.0mg.I71中，在12~20 °C、每天光照6~12小时、光照强度为1000~15001x的条件下进行培养；(2)选取步骤(1)中培养的长度在1.0cm以上的无菌芽体，转接入MS+6-BA1.0~3.0mg.L_1+IAA0.5~2.0mg.L_1+脯氨酸0.5~2%+活性炭1~3%的培养基中，先在5°C的条件下培养15天，再放在培养箱中进行8~15天的变温处理；(3)选取生长良好的芽体于解剖镜下，用解剖针小心剥去芽体外面的幼叶后，切取带有1~4个叶原基的芽分生组织，接入丛生芽分化培养基MS+6-BA1~3mg.'+ΚΤΟ.1~ 0.5mg *L_1中，在15~22°C、每天光照10~14小时、光照强度为1000~15001x的条件下培养；(4)选取生长的的山葵丛生芽，将其分割为单株后转入壮苗培养基MS+NAA0.05~0.lmg.L ^Θ-ΒΑΟ.1 ~0.5mg.L ^KT0.05 ~0.2mg.L 1 中，在 10 ~18 °C、每天光照 10 ~16小时、光照强度为1000~15001x的条件下培养；(5)选取生长健壮的山葵无根苗接入生根培养基White+NAA0.1~1.0mg.1中，在15~22°C、每天光照6~10小时、光照强度为800~ΙΟΟΟΙχ的条件下诱导生根；(6)当无根苗长出3~4条以上不定根时，打开瓶盖，在室内炼苗2~4天后，将其从培养瓶中取出，用无菌水洗去不定根上的培养基后，移栽至消毒后的土壤中生长。
2.根据权利要求1所述的一种山葵脱毒苗的培养方法，其特征在于:步骤(1)中所述芽体的芽尖部分是指芽体上部长度为0.2~0.5cm的芽尖部分。
3.根据权利要求1所述的一种山葵脱毒苗的培养方法，其特征在于:步骤(2)中所述变温处理是指在8~12°C的条件下培养19小时与在30~45°C的条件下培养5小时交替进行。
4.根据权利要求1所述的一种山葵脱毒苗的培养方法，其特征在于:步骤(6)中所述土壤是由蛭石和全营养土按2:1配制而成，土壤消毒是指先采用0.1%多菌灵消毒6~10小时，再用0.1%高锰酸钾消毒12~24小时。
5.根据权利要求1所述的一种山葵脱毒苗的培养方法，其特征在于:步骤(6)中炼苗的培养条件为温度15~20°C和相对湿度80%~95%，移栽后的培养条件为培养温度12~20°C、相对湿度为70~80%、每天光照4~10小时和光照强度为800~12001x。
【文档编号】A01H4/00GK103718963SQ201310724001
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月24日 优先权日:2013年12月24日
【发明者】王跃华, 孙雁霞, 刘洪明, 段茂华, 任三军, 赵钢, 宋超, 刘银花, 唐川, 梅英, 徐恩琴, 唐凤如, 江明殊, 李睿玉, 许志强 申请人:成都大学