以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法
【专利摘要】本发明提供一种以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法，包括以下步骤：香樟胚培苗无性系EL6组培苗的茎切段置于不定芽诱导培养基S1上进行预培养；将预培养后的香樟茎切段作为转化受体材料置于农杆菌侵染液中进行侵染；将侵染后的外植体用无菌滤纸吸去多余菌液，转入共培养培养基中进行共培养；将茎切段转入选择培养基，进行选择培养，获得转基因阳性植物材料。本发明取材方便，材料数量充足，容易获得再生植株；香樟胚培苗无性系茎切段遗传转化，具方法简单、步骤简化、周期短等特点；高频植株再生香樟无性系材料的应用，大大提高农杆菌介导遗传转化的转基因植株获得率，缩短香樟遗传转化周期，缩短获得转基因香樟新种质的周期。
【专利说明】以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程【技术领域】，具体涉及一种以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法。
【背景技术】
[0002]香樟(Cinnamomum camphoraL.),樟科樟属植物,是亚热带常绿阔叶林的代表树种。其树形优美，枝繁叶茂，绿荫蔽日，气势雄伟，是优良的城市园林绿化常用树种。在我国的分布大体以长江以北为界，南至两广及西南，以江西，浙江、福建等东南沿海省份为多，因而在栽培范围上受到低温的限制。近年来，随着城市建设发展及园林绿化的新要求，为丰富北方园林的树种组合，改善冬季园林植物景观，不少园林工作者都在尝试引种此树，香樟被广泛引种栽植到黄河流域的一些省分，用以丰富当地绿化树种。
[0003]北方漫长而寒冷冬季往往会导致香樟正常生长受损，严重时树体甚至死亡，从而造成巨大的经济损失。因此，防治冻害就成为这一优良树种在北方城市顺利推广及应用的一个重要问题。解决这一问题的主要方法是加强栽培管理和选育抗冻新品种，而后者是根本途径。采用生物技术方法，通过转基因手段进行分子育种，是一种“定向育种”，可有效缩短育种周期。生物技术改良香樟必须以高效植株再生体系的建立为研究基础，但目前由于采用香樟胚性愈伤组织为转基因外植体材料，存在转基因胚性愈伤组织再生困难，从而难获转基因植株等问题，制约着生物技术改良香樟的进程。
[0004]目前，在转基因技术改良香樟育种中，外植体大多采用的是香樟胚性愈伤组织，胚性愈伤组织对香樟这个物种而言再生频率较低；转化外源基因后，在选择阳性转化材料时，选择配方中一定浓度的抗生素更增加诱导转基因胚性愈伤组织再生植株难度。两种不利因素叠加导致选用香樟胚性愈伤组织做为外植体进行遗传转化很难获得转基因再生植株。
[0005]南阳师范学院的专利申请“香樟胚培苗茎切段高频植株再生无性系选育方法”(受理号:201410188756.3)，提出以香樟子叶胚培养苗茎切段为外植体，通过直接器官发生途径，建立高频植株再生体系的方法，因其不具有具体遗传转化步骤，因此无法实现香樟品种改良。
[0006]目前，国内外没有关于香樟通过器官发生途径获得转基因植株的报道。
【发明内容】
[0007]为解决上述问题，本发明的目的是提供一种以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法。
[0008]本发明所采用的技术方案是，一种以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法，包含下列步骤:
[0009]步骤1、将香樟胚培苗无性系EL6组培苗的茎切段置于不定芽诱导培养基SI上进行预培养；
[0010] 步骤2、将步骤I中预培养后的香樟茎切段作为转化受体材料置于农杆菌侵染液中进行侵染，即进行遗传转化；
[0011]步骤3、将步骤2中侵染结束后的外植体用无菌滤纸吸去多余菌液，转入共培养培养基中进行共培养；
[0012]步骤4、共培养结束后，将茎切段转入选择培养基，进行选择培养，获得转基因阳性植物材料。
[0013]本发明的特点还在于，
[0014]不定芽诱导配方SI 为:MS+30g/L 鹿糖 +0.8 % 琼脂粉 +2.0mg/L6_BA+0.5mg/L2, 4_D，ρΗ6.0。
[0015]步骤I中的香樟胚培苗无性系组培苗具节茎切段取自在配方SI中增殖生长2w的香樟胚培苗无性系EL6的组培苗；完全切除组培苗枝条上顶芽、侧芽、腋芽，即所有具分生组织的器官和叶片；将余下茎段按节切段，即每个茎切段上具有I节，长为5~7_。
[0016]预培养条件是:预培养时间为2d，其培养条件均为光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为2000~3000Lx，培养温度为22°C _26°C。
[0017]农杆菌侵染液的菌液浓度为OD6tltl = 0.4~1.0 ;侵染时间为20~50min。
[0018]步骤3中的共培养条件为:共培养时间为3d，共培养培养基为不定芽诱导配方SI ；共培养条件暗培养，培养温度为28°C。
[0019]步骤4中的不定芽诱导选择培养基的配方为:含抑菌剂头孢霉素cef和筛选剂潮霉素hyg的不定芽诱导培养基SI,即:Sl+cef300mg/L+hyg25mg/L或35mg/L。
[0020]步骤4中的抗性芽的筛选方法具体按照以下步骤实施:将共培养结束后的茎切段转入含头孢霉素和潮霉素的不定芽诱导选择培养基上，光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为2000~3000Lx，培养温度为22°C -26°C，选择培养2w后，存活并诱导出不定芽的茎切段初步标记可能的阳性材料，之后将不同外植体来源的不定芽切割分离下来，继代入新的选择培养基，再培养2w后筛选即得到阳性抗性芽。
[0021]本发明的有益效果是:本方法以香樟胚培苗无性系具节茎切段为受体，通过农杆菌介导的方法，以GUS基因为报告基因，对影响香樟胚培苗茎切段遗传转化的几个因素进行系统研究，经外植体预培养、遗传转化条件优化、共培养和GUS染色最终建立香樟胚培苗茎切段遗传转化体系。本发明取材方便，材料数量充足，容易获得再生植株；香樟胚培苗无性系茎切段遗传转化，具方法简单、步骤简化、周期短等特点；高频植株再生香樟无性系材料的应用，可大大提高农杆菌介导遗传转化的转基因植株获得率，有效缩短香樟遗传转化周期，有效缩短获得转基因香樟新种质的周期；此外，通过统计GUS基因瞬间表达率对影响农杆菌介导遗传转化效率的各项因素进行优化，可有效提高香樟遗传转化效率，综上所述，选用高频植株再生香樟胚培苗无性系，通过优化后的农杆菌介导的各项因素中转化，可促进香樟农杆菌介导的基因转化的研究。本发明可在香樟遗传转化和生物技术改良中发挥重要作用，能够替代香樟胚性愈伤组织作为遗传转化的外植体。该发明填补通过器官发生途径实现香樟转基因植株的生物技术改良的空白；可用于新基因功能验证及优良转基因育种材料的获得，同时为其他园林树木的生物技术改良提供重要参考价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 1是本发明香樟胚培苗茎切段潮霉素敏感性试验图；
[0023]图2是本发明香樟胚培苗茎切段头孢霉素敏感性试验图；
[0024]图3是本发明香樟胚培苗茎切段⑶S基因表达染色反应图。
【具体实施方式】
[0025]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明进行详细说明，下列所用方法如无特别说明为常规方法。所述百分浓度如无特别说明为质量百分浓度。
[0026]本发明提供一种以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法，包含下列步骤:
[0027]步骤1、将香樟胚培苗无性系EL6组培苗的茎切段置于不定芽诱导培养基SI上进行预培养；
[0028]步骤2、将步骤I中预培养后的香樟茎切段作为转化受体材料置于农杆菌侵染液中进行侵染，即进行遗传转化；
[0029]步骤3、将步骤2中侵染结束后的外植体用无菌滤纸吸去多余菌液，转入共培养培养基中进行共培养；
[0030]步骤4、共培养结束后，将茎切段转入选择培养基，进行选择培养，获得转基因阳性植物材料。
[0031]其中，不定芽诱导配方SI为:MS+30g/L蔗糖+0.8%琼脂粉+2.0mg/L6-BA+0.5mg/L2, 4_D，ρΗ6.0。
[0032]步骤I中的香樟胚培苗无性系组培苗具节茎切段取自在配方SI中增殖生长2w的香樟胚培苗无性系EL6的组培苗；完全切除组培苗枝条上顶芽、侧芽、腋芽，即所有具分生组织的器官和叶片；将余下茎段按节切段，即每个茎切段上具有I节，长为5~7_。
[0033]预培养条件是:预培养时间为2d，其培养条件均为光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为2000~3000Lx，培养温度为22°C _26°C。
[0034]农杆菌侵染液的菌液浓度为OD6tltl = 0.4~1.0 ;侵染时间为20~50min。
[0035]步骤4中的不定芽诱导选择培养基的配方为:含抑菌剂头孢霉素cef和筛选剂潮霉素hyg的不定芽诱导培养基SI,即:Sl+cef300mg/L+hyg25mg/L或35mg/L。
[0036]步骤4中的抗性芽的筛选方法具体按照以下步骤实施:将共培养结束后的茎切段转入含头孢霉素和潮霉素的不定芽诱导选择培养基上，光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为2000~3000Lx，培养温度为22°C -26°C，选择培养2w后，存活并诱导出不定芽的茎切段初步标记可能的阳性材料，之后将不同外植体来源的不定芽切割分离下来，继代入新的选择培养基，再培养2w后筛选即得到阳性抗性芽。
[0037]1.1 材料
[0038]南阳师范学院申请“香樟胚培苗茎切段高频植株再生无性系选育方法”专利(受理号)，筛选获得具有高频植株再生能力的胚培苗无性系无菌苗作为香樟遗传转化受体材料的供体来源。不定芽诱导配方SI (MS+30g/L蔗糖+0.8%琼脂粉+2.0mg/L6-BA+0.5mg/L2，4-D，pH6.0)(参见发明专利:香樟胚培苗茎切段高频植株再生无性系选育方法，受理号:201410188756.3)作为茎切段预培养培养基、共培养培养基和不定芽诱导选择培养基(Sl+cef+hyg)。
[0039]1.2 方法
[0040]1.2.1香樟胚培苗无性系组培苗茎切段的获得
[0041]处理方式如下:茎切段取自在配方SI中增殖生长2w的香樟胚培苗无性系的组培苗；完全切除组培苗枝条上顶芽、侧芽、腋芽(即，所有具分生组织的器官)和叶片；将余下茎段按节切段(即每个茎切段上具有I节)，长约5~7mm。
[0042]1.2.2培养方法及条件
[0043]除香樟茎切段共培养为暗培养，培养温度为28°C ;其余茎切段抗生素敏感性试验、受体材料预培养、不定芽诱导选择培养等香樟培养材料培养均采用光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为2000~3000Lx ;培养温度均为24±2°C。
[0044]1.2.3香樟茎切段预培养
[0045]以香樟胚培苗无性系组培苗(见专利:201410188756.3)茎切段为外植体，将所述的外植体接种于不定芽诱导配方SI (见专利:201410188756.3)进行预处理，预处理时间为2d。
[0046]1.2.4香樟茎切段对筛选剂潮霉素和抑菌剂头孢霉素的敏感性试验
[0047]1.香樟茎切段对筛选剂潮霉素的敏感性试验
[0048]将预处理后的茎切段接种于附加不同浓度(0、5、15、25、35mg/L)潮霉素(hyg)的培养基SI上，3w后比较不同浓度抗生素对外植体生长的抑制作用，以确定合适的选择压力。试验的潮霉素浓度梯度为0、5、15、25、35mg/L。每处理试验外植体数不少于30个，接种3w后，进行数据统计。
[0049]2.香樟茎切段对抑菌剂头孢霉素的敏感性试验
[0050]将预处理后的茎切段接种于附加不同浓度头孢霉素的培养基SI上，3w后比较不同浓度抗生素对外植体不定芽生长的抑制作用，以确定合适的选择压力。所试头孢霉素(cef)浓度梯度为0、200、300、400、1000mg/L。每处理试验外植体数不少于30个，接种3w后，进行数据统计。
[0051]1.2.5农杆菌介导的遗传转化条件的优化
[0052]1.农杆菌菌液活化及侵染液制备
[0053]从-80°C冰箱中取出含质粒pCAMBIA1301的农杆菌EHA105菌种，用接种环在含有100mg/LKm(卡那霉素)和50mg/LRif (利福平)的LB固体培养基上划线，平板倒置，暗培养在28°C下直至单菌落产生；挑取单菌落接种于含有100mg/LKm的LB液体培养基中，28°C恒温摇床振荡培养(180~200r/min)过夜；后将菌液4000rpm离心10min，弃上清，用无菌液体MS培养基重悬菌体，调整至各种0D_，备用。
[0054]2.农杆菌的侵染与共培养
[0055] 将预培养2d的香樟莖切段取出，置于不同OD6tltl (0.4~1.0)农杆菌菌液中浸泡一段时间后，取出并用无菌滤纸吸去表面多余的菌液，完成侵染过程；将侵染后香樟茎切段转回原来预处理使用培养基中(即预处理培养基和共培养培养基相同)，将上述培养物置于28°C恒温培养箱，黑暗条件下培养I~4d，进行共培养；共培养结束后通常情况下，可转入选择培养基进行选择培养，如果采用报告基因优化转化条件，则共培养结束之后，直接进行报告基因瞬间表达的检测。
[0056]3.转化条件的优化
[0057]本研究试验了根癌农杆菌EHA105/pCAMBIA1301的菌液浓度(OD6tltl = 0.4,0.6、0.8、1.0)，共培养天数(l、2、3、4d)，侵染时间(10、20、30、40、5011^11)，对遗传转化的影响。
检测其中的某个因素时，其它因素采用括号中加粗标记的那个水平，共培养结束后用外植体⑶S的瞬间表达量的多少确定转化条件的适宜程度，每个处理的外植体数不少于30个，其中未侵染的材料作为阴性对照。
[0058]4.⑶S染色检测报告基因瞬时表达
[0059]I)染色:将待测样品装入EP管中，加入适量⑶S染液，完全浸没样品，将离心管置于37 °C水浴锅过夜。
[0060]2)漂洗脱色:先后用50%，70%，100%的乙醇漂洗样品(除去叶绿素)，每次摇床震荡脱色20min，直至阴性对照材料成白色为止。
[0061]3)观察:肉眼或显微镜下观察，白色背景上的兰小点即为Gus基因表达的位点。
[0062]4)统计数据:香樟茎切段反应后可直接观察，⑶S基因瞬间表达呈阳性者可在肉眼下观察到蓝色反应，然后统计⑶S基因瞬间表达率，每次反应观测外植体总数不少于30粒。
[0063]5)⑶S 染色配制:10mmol/LEDTA 二钠盐，0.1 % TritonX-100, 500 μ g/mLX-Gluc,
0.1mMK4Fe (CN)6,0.1mMMK3Fe (CN)6,100 μ g/mL氯霉素(CM)，20% 甲醇，以 50mmol/L磷酸缓冲液PH7.0配制。
[0064]1.2.6数据计算和处理
[0065]不定芽诱导率=诱导出芽的外植体数/接种外植体总数X 100% (不定芽长度大于Imm,记录一个有效芽)
[0066]分化系数=诱导出芽总数/诱导出芽的外植体总数X 100%
[0067]愈伤组织诱导率=诱导出愈伤组织的外植体数/接种外植体总数X 100%
[0068]存活率=存活外植体数/接种外植体总数X 100% (外植体全长9成变褐，记录外植体死亡)
[0069]⑶S瞬间表达率=有蓝色反应的外植体数/外植体总数X 100%
[0070]2结果与分析
[0071]2.1香樟茎切段对筛选剂潮霉素和抑菌剂头孢霉素的敏感性试验
[0072]表1不同浓度的潮霉素对香樟胚培苗茎切段生长的影响
[0073]
【权利要求】
1.一种以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法，其特征在于，包含下列步骤: 步骤1、将香樟胚培苗无性系EL6组培苗的茎切段置于不定芽诱导培养基SI上进行预培养； 步骤2、将步骤I中预培养后的香樟茎切段作为转化受体材料置于农杆菌侵染液中进行侵染，即进行遗传转化； 步骤3、将步骤2中侵染结束后的外植体用无菌滤纸吸去多余菌液，转入共培养培养基中进行共培养； 步骤4、共培养结束后，将茎切段转入选择培养基，进行选择培养，获得转基因阳性植物材料。
2.根据权利要求1所述的以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法，其特征在于，所述不定芽诱导配方SI为:MS+30g/L蔗糖+0.8 %琼脂粉+2.0mg/L6-BA+0.5mg/L2, 4-D, pH6.0。
3.根据权利要求1所述的以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤I中的香樟胚培苗无性系组培苗具节茎切段取自在配方Si中增殖生长2W的香樟胚培苗无性系EL6的组培苗；完全切除组培苗枝条上顶芽、侧芽、腋芽，即所有具分生组织的器官和叶片；将余下茎段按节切段，即每个茎切段上具有I节，长为5~7_。
4.根据权利要 求1所述的以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法，其特征在于，所述预培养条件是:预培养时间为2d，其培养条件均为光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为2000~3000Lx，培养温度为22°C _26°C。
5.根据权利要求1所述的以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法，其特征在于，所述农杆菌侵染液的菌液浓度为OD_ = 0.4~1.0 ;侵染时间为20~50min。
6.根据权利要求1所述的以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤3中的共培养条件为:共培养时间为3d，共培养培养基为不定芽诱导配方SI ;共培养条件暗培养，培养温度为28°C。
7.根据权利要求1所述的以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤4中的不定芽诱导选择培养基的配方为:含抑菌剂头孢霉素cef和筛选剂潮霉素hyg的不定芽诱导培养基SI,即:Sl+cef300mg/L+hyg25mg/L或35mg/L。
8.根据权利要求1所述的以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤4中的抗性芽的筛选方法具体按照以下步骤实施:将共培养结束后的茎切段转入含头孢霉素和潮霉素的不定芽诱导选择培养基上，光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为2000~3000Lx，培养温度为22°C -26°C，选择培养2w后，存活并诱导出不定芽的茎切段初步标记可能的阳性材料，之后将不同外植体来源的不定芽切割分离下来，继代入新的选择培养基，再培养2w后筛选即得到阳性抗性芽。
【文档编号】A01H5/00GK104131031SQ201410347163
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月21日 优先权日:2014年7月21日
【发明者】杜丽, 黄蕊, 李勇鹏, 姚瑶, 张力维 申请人:南阳师范学院