一种复合益菌肽及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种复合益菌肽及其制备方法和应用，它由菌酶复配发酵剂添加到豆粕中发酵而成，所述菌酶复配发酵剂由四种益生菌、四种蛋白酶和碳源复合而成，四种益生菌分别为丁酸梭菌、短小芽孢杆菌S3、植物乳杆菌和布拉酵母菌；四种蛋白酶分别为酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和多肽蛋白酶。并提供了复合益菌肽的具体制备方法和在用于制备乳仔猪饲料添加剂中的应用。所述复合益菌肽产品，富含多种益生菌，可有效降解抗原蛋白产生多肽、氨基酸等小分子物质，并在发酵过程中产生了多种益生性有机酸、生物素等风味性、拮抗性物质，不仅增加了适口性、安全性，且显著提高了豆粕利用率和饲料营养价值，还可显著降低乳仔猪腹泻率。
CGMCC No. 9161
2014.05.13
【专利说明】一种复合益菌肽及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物酶解与发酵领域，涉及肽的制备方法，具体涉及一种复合益菌肽 及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 豆柏作为一种重要的植物蛋白源，有着重要的应用和研究价值。但大豆中的蛋白 酶抑制剂、植物凝集素、大豆抗原蛋白、脲酶、植酸、大豆低聚糖等抗营养物质的存在，不但 极大地阻碍动物对营养成分的消化、吸收和利用，而且严重地危害动物的健康和生长发育。 大豆抗原蛋白是大豆加工制品中残留量最高，抗营养作用最强的一种大豆抗营养因子，可 引起婴幼儿以及小鼠、仔猪、犊牛等动物发生肠道及其它器官的过敏反应，并导致肠黏膜损 伤，小肠形态结构发生损伤性变化，进而引起腹泻、生产性能下降甚至死亡，是世界公认的 八大食物过敏原之一。大豆抗原蛋白主要包括Iis大豆球蛋白和7S0-大豆伴球蛋白，两 者占大?蛋白含量的70 %左右。
[0003] 目前的豆柏的生物处理方法中，微生物发酵法与酶处理法已经较为普遍，本发明 将四种菌、四种酶与碳源结合起来，将豆柏作为一种培养微生物的基质，促进四种益生菌大 量繁殖，并在生物处理过程中，有效降解并利用豆柏大分子抗原蛋白，几乎将其完全降解为 多肽、氨基酸等小分子物质，易于动物吸收，并产生了多种益生性有机酸等风味性物质，生 物素、酪酸梭菌素等拮抗性物质，在增加了适口性、安全性的同时，还显著提高了豆柏的蛋 白利用率和营养价值，并可降低乳仔猪腹泻率，具备了一定的功能性。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种复合益菌肽及其制备方法和应用，所述复合益菌肽可以满足乳 仔猪对豆柏原料的特殊营养需求。
[0005] 为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
[0006] -种复合益菌肽，它由菌酶复配发酵剂添加到豆柏中发酵而成，所述菌酶复配发 酵剂由四种益生菌、四种蛋白酶和碳源复合而成，所述四种益生菌分别为丁酸梭菌、短小 芽孢杆菌S3、植物乳杆菌和布拉酵母菌；所述四种蛋白酶分别为酸性蛋白酶、中性蛋白酶、 碱性蛋白酶和多肽蛋白酶；所述短小芽孢杆菌S3的分类命名为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus)，其保藏编号为：CGMCC No. 9161。
[0007] 对上述技术方案的进一步改进：所述四种益生菌在菌酶复配发酵剂中的含菌量分 别是：丁酸梭菌：不低于IX l〇6CFU/g ;短小芽孢杆菌S3 :不低于IX 106CFU/g ;植物乳杆菌： 不低于IX l〇6CFU/g ;布拉酵母菌：不低于IX 105CFU/g。
[0008] 对上述技术方案的进一步改进：所述四种蛋白酶在菌酶复配发酵剂中的含量分别 是：酸性蛋白酶：不低于500U/g ;中性蛋白酶：不低于1000U/g ;碱性蛋白酶：不低于4000U/ g ;多肽蛋白酶：不低于4500U/g。
[0009] 对上述技术方案的进一步改进：所述碳源为占菌酶复配发酵剂质量9% -10%的 葡萄糖。
[0010] 本发明还提供了所述的复合益菌肽的制备方法，它包括如下步骤：
[0011] (1)在豆柏中添加占豆柏质量50-60%的水形成发酵底料，接种占豆柏质量10% 的所述菌酶复配发酵剂，混合均匀形成发酵物料；
[0012] (2)将所述发酵物料储存于锡箔密封袋内，于200°C封口，置于37°C恒温培养箱 内，发酵72h ;
[0013] (3)发酵完成后，低温烘干，粉碎过筛，形成所述复合益菌肽。
[0014] 对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（3)中发酵物料于40°C低温烘干，粉碎 过60目筛。
[0015] 本发明进一步提供了所述的复合益菌肽在制备用于饲喂乳仔猪的饲料添加剂中 的应用。
[0016] 所述复合益菌肽以占饲料质量比为5-15%的比例添加到饲料中，所述复合益菌肽 拮抗猪粪大肠菌群。
[0017] 与现有技术相比，本发明方法的优点和技术效果是：
[0018] 1、本发明所用的菌酶复配发酵剂，是在生物酶解发酵理论基础上，结合多年实践 经验，针对生产常用豆柏原料特点，自行配制的专一性发酵剂；采用所述的专一性菌酶复配 发酵剂，生物处理豆柏来制备复合益菌肽产品。
[0019] 2、本发明所制备的复合益菌肽产品，富含多种益生菌，包括丁酸梭菌，短小芽孢杆 菌S3,植物乳杆菌，布拉酵母菌。在其酶解发酵过程中，可有效降解豆柏中抗原蛋白产生多 肽、氨基酸等小分子物质，并产生多种益生性有机酸、生物素等风味性、拮抗性物质，不仅增 加了适口性、安全性，且芽孢类益生菌具有很好的保存稳定性。
[0020] 3、本发明所制备的复合益菌肽产品，可显著提高豆柏利用率和饲料营养价值，具 有猪粪大肠菌群抗性，还可显著降低仔猪腹泻率。
[0021] 4、本发明所涉及菌、酶等，都属于饲料添加剂范畴，来源广泛，安全易得，成本低 廉。
[0022] 5、本发明所述方法步骤简单合理，操作快捷，具有良好的工业化实施前景。
[0023] 结合附图阅读本发明的【具体实施方式】后，本发明的其他优点将变得更加清楚。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1表明1号豆柏经生物处理后制备的复合益菌肽-益生菌菌量组成与半年稳定 性。
[0025] 图2表明2号豆柏经生物处理后制备的复合益菌肽-益生菌菌量组成与半年稳定 性。
[0026] 图3表明豆柏原料经生物处理后制备为复合益菌肽的抗原蛋白SDS-PAGE电泳图。
[0027] 图4表明豆柏原料经生物处理后制备为复合益菌肽富含益生性有机酸。
[0028] 图5表明豆柏原料经生物处理后制备为复合益菌肽可拮抗猪粪大肠菌群。
[0029] 图6表明豆柏原料经生物处理后制备为复合益菌肽可显著降低乳仔猪腹泻率。 图7为短小芽孢杆菌S3的生产工艺流程图。
【具体实施方式】
[0030] 为更好地了解该复合益菌肽产品的功能，下面结合附图和具体实施例对本发明的 产品引用特点做进一步详细的说明。
[0031] 实施例1
[0032] 一、短小芽孢杆菌S3的分离筛选
[0033] 2013年5月至2013年9月，从胶州沿海多处采集虾养殖区域的水样、底泥、对虾肠 道粪便。底泥、对虾肠道粪便样品分别于无菌生理盐水中10倍稀释，充分研磨，取上清为样 品液；水样直接作为样品液；样品液分别接种于2216E液体培养基中30°C富集培养48h后 稀释，涂布于2216E平板中进行菌株的分离、纯化，共筛选出26株纯菌。
[0034] 已纯化单菌株采用平板点种法筛选颉颃菌。以副溶血弧菌为指示菌，将副溶血弧 菌接种于2216E液体培养基中培养18h，稀释制备成105-106CFU/mL的菌悬液，取0. ImL涂布 2216E平板，备用。用无菌牙签挑取待筛选的菌株，点接于含菌平板中，25°C恒温培养24h， 观察点接菌落周围是否出现明显的抑菌圈或覆盖区。
[0035] 对分离到的26株细菌采用点种法筛选到3株对副溶血弧菌具有颉颃作用的菌株， 其中S3对副溶血弧菌具有较强的颉颃作用，能明显抑制病原菌的生长，在病原菌周围产生 明显清晰的抑菌圈。
[0036] 经细菌生理生化方法初步鉴定，菌株S3为芽孢杆菌属，其生物学特性：革兰氏染 色阳性，在营养琼脂平板上形成的菌落直径约2mm，边缘整齐光滑，中间褶皱，乳白色。菌体 形态呈杆状，芽孢椭圆形，中生。
[0037] 二、短小芽孢杆菌的分子遗传学分类鉴定
[0038] 首先提取菌株S3的DNA，以该DNA为模板，16S rRNA通用引物为引物，对16SrRNA 片段进行扩增，扩增片段进行序列测定。测序结果用Blast软件与GenBank中相关属种的 16S rRNA序列进行比对，结果显示该菌株16S rRNA序列与GenBank基因库中芽孢杆菌属 中的Bacillus pumilus的16s rRNA序列同源度最高，同源率达到99%。通过DNAMAN6.0 对Genbank中已有的芽孢杆菌属的16S rRNA序列进行遗传进化分析，结果显示，菌株S316S rRNA与Bacillus pumilus同源性最高，判定该菌株为芽孢杆菌属的短小芽孢杆菌。
[0039] 将筛选到的菌株S3进行菌种保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心（CGMCC);地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究 所；保藏日期=2014年5月13日；短小芽孢杆菌Bacillus pumilus的保藏编号为CGMCC No. 9161。
[0040] 三、复合益菌肽的组成
[0041] 本发明所述复合益菌肽由菌酶复配发酵剂添加到豆柏中发酵而成，所述菌酶复配 发酵剂由四种益生菌、四种蛋白酶和碳源复合而成，所述四种益生菌分别为丁酸梭菌，短小 芽孢杆菌S3,植物乳杆菌，布拉酵母菌；所述四种蛋白酶分别为酸性蛋白酶，中性蛋白酶， 碱性蛋白酶，多肽蛋白酶；所述短小芽孢杆菌S3的分类命名为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus)，其保藏编号为：CGMCC No. 9161。所述碳源为占菌酶复配发酵剂质量9%-10%的 葡萄糖，添加的葡萄糖作物载体与碳源，以满足各种菌的生长需求，并促进乳酸、乙酸、丁酸 等益生性有机酸的产生。
[0042] 所述四种益生菌在菌酶复配发酵剂中的含菌量分别是：丁酸梭菌：不低于 I X 106CFU/g ;短小芽孢杆菌S3 :不低于I X 106CFU/g ;植物乳杆菌：不低于I X 106CFU/g ;布 拉酵母菌：不低于lX105CFU/g。所述四种蛋白酶在菌酶复配发酵剂中的含量分别是：酸性 蛋白酶：不低于500U/g冲性蛋白酶：不低于1000U/g ;碱性蛋白酶：不低于4000U/g ;多肽 蛋白酶：不低于4500U/g。
[0043] 本发明所使用的丁酸梭菌、植物乳杆菌和布拉酵母菌均为市售商品化的菌粉，所 使用的酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和多肽蛋白酶均为市售商品化的酶制剂，而所 述短小芽孢杆菌S3是自行筛选并保存的，其生产工艺流程如图7所示。
[0044] 四、本发明所述的复合益菌肽的制备方法包括如下步骤：
[0045]
[0046]
[0047] (1)在豆柏中添加占豆柏质量50-60 %的水形成发酵底料，接种占豆柏质量10% 的所述菌酶复配发酵剂，混合均匀形成发酵物料；
[0048] (2)将所述发酵物料储存于锡箔密封袋内，于200°C封口，置于37°C恒温培养箱 内，发酵72h。
[0049] 所述步骤（2)中发酵物料处于完全密封环境中，前24h内，物料中仍残存有氧气， 好氧的短小芽孢杆菌S3与兼性好氧的布拉酵母菌迅速生长；24h-48h时，随着氧气的不断 消耗与其他气体的逐渐产生，兼性厌氧的植物乳杆菌逐渐占据优势，酵母菌菌也逐渐进入 发酵模式，此间可产生乳酸、乙酸等多种益生性有机酸；48h-72h时，当氧气完全耗尽后，完 全厌氧菌丁酸梭菌逐渐占据优势，并分泌丁酸，有利于改善动物肠道。在完全密封的环境 下，72h内实现了四种特性益生菌的接力生长，可产生多种益生性物质。
[0050] 所述步骤（2)中发酵物料处于完全密封环境中，不同时间段内不同的菌优势生 长，造成环境PH也是逐渐变化的，基本为降低的趋势。前期pH高于5时，碱性蛋白酶与多 肽蛋白酶可发挥一定酶解作用，后期PH低于5后，主要由中性蛋白酶与酸性蛋白酶发挥生 物降解功能。四种酶的酶切位点各不相同，可有效降解抗原蛋白，大幅提高酸溶蛋白、碱解 蛋白比例，增加游离氨基酸含量，提高产品的体外蛋白消化率。
[0051] 所述步骤（2)中发酵物料处于完全密封环境中，pH逐渐降低，四种酶交替起作用， 且酶切位点各不相同，可有效降解抗原蛋白，大幅提高酸溶蛋白、碱解蛋白比例，增加游离 氨基酸含量，提高产品的体外蛋白消化率。
[0052] (3)发酵完成后，于40°C低温烘干，粉碎过60目筛，形成复合益菌肽产品；
[0053] 所述步骤（3)中，低温烘干处理前后，最终的复合益菌肽产品与发酵湿料相比，丁 酸梭菌、短小芽孢杆菌S3、植物乳杆菌、布拉酵母菌等都有一定比例的存活，芽孢菌存活率 高于89 %，且半年内室温条件下活菌存活率高于90 %。
[0054] 所述复合益菌肽产品富含益生菌、有机酸等，并具有杂菌抗性，用于乳仔猪饲料配 制，以5-15%比例添加，可显著降低仔猪腹泻率。
[0055] 所述复合益菌肽产品，具备一定的猪粪大肠菌群抗性。
[0056] 以本发明所述方法，对1号与2号两种豆柏原料（均为市售的常见豆柏原料）进 行生物处理，得到1号与2号两种复合益菌肽。
[0057] 实施例2
[0058] 分别测定发酵72h时发酵终点湿料、低温烘干后的所述复合益菌肽产品、室温存 放6月后的复合益菌肽产品中四种菌的含量。利用胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸培养基，采 用夹层培养法，测定丁酸梭菌菌量；利用营养琼脂培养基，采用稀释涂布法，测定短小芽孢 杆菌S3菌量；利用MRS培养基，采用倾注培养法，测定植物乳杆菌菌量；利用YH)培养基，采 用稀释涂布法，测定布拉酵母菌菌量。鉴于四种菌菌量差异较大，以log CFU/g表示菌量。
[0059] 图1展示了 1号豆柏经生物处理后制备的复合益菌肽-益生菌菌量组成与半年 稳定性，图2展示了 2号豆柏经生物处理后制备的复合益菌肽-益生菌菌量组成与半年 稳定性。低温烘干处理前后，最终的复合益菌肽产品与发酵湿料中各菌都有一定比例的存 活，其中芽孢菌烘干存活率高于89%，且室温条件下存放半年后，活菌存活率高于90%。 1号复合益菌肽的发酵湿料中，丁酸梭菌菌量达I. 08X 106CFU/g，低温烘干后，含丁酸梭 菌9. 7 X 105CFU/g，烘干存活率达89. 81 %，且半年后菌量仍保持8. 8 X 105CFU/g，存活率达 90. 72%，说明该产品中丁酸梭菌耐热性强，稳定性好，这极大地提高了该菌在动物体内发 挥作用的可能性；短小芽孢杆菌S3与丁酸梭菌类似，发酵湿料中菌量达4. 5X 107CFU/g， 低温烘干后菌量达4. 2 X 107CFU/g，烘干后存活率达93. 34 %，室温存放半年后菌量仍保持 4X 107CFU/g，活菌存活率达95. 24%，说明其孢子经过烘干过程有所选择，耐受性更强，具 有较好的稳定性，可增强该产品的应用潜力；1号复合益菌肽的发酵湿料中，植物乳杆菌菌 量达3. 3X 107CFU/g，在烘干过程中下降1个数量级，菌量为3. 83X 106CFU/g，室温存放半 年后，仍保持I. 96X 106CFU/g，活菌菌量数量级未变，存活率达51. 17%，说明复合益菌肽 产品中含有较多植物乳杆菌，虽有损失但能耐受一定时间的存储；1号复合益菌肽的发酵 湿料中，布拉酵母菌量可达7. 5X105CFU/g，但其耐受性较差，低温烘干粉碎产品中菌量达 3. 5X 104CFU/g，室温存放半年后酵母菌仅达4. I X 103CFU/g。2号复合益菌肽中各菌的含 量与比例、烘干前后存活率、室温存放半年前后活菌存活率等指标，与1号复合益菌肽中类 似，但其植物乳杆菌菌量略高，其他菌菌量略低。
[0060] 实施例3
[0061] 利用SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳）定性确定抗原蛋白的降解情况，利用 ELISA(酶联免疫吸附测定法）试剂盒定量测定抗原蛋白的去除率。利用TCA(三氯乙酸浸 提法）测定酸溶蛋白（占粗蛋白，％ );参考GB/T19541-2004饲料用大豆柏，利用0.2% KOH测定KOH溶解度，参考国标GBT-8314-2002游离氨基酸总量测定，测定游离氨基酸含量； 利用中国农科院北京畜牧兽医研究所研发的SDS- II单胃动物仿生消化系统，模拟测定体 外蛋白消化率。
[0062] 抗原蛋白的SDS-PAGE定性测定结果如图3所示，ELISA定量测定结果如表1所示。 1号与2号豆柏原料不同蛋白亚基的条带深浅略有差异，大豆球蛋白、β-大豆伴球蛋白、抗 原蛋白的具体测定值也略有不同，但豆柏原料与生物处理后的复合益菌肽产品之间的对比 趋势是类似的：经生物处理后，复合益菌肽的大分子抗原蛋白几乎完全降解为小分子蛋白 (蛋白分子量低于HKDa)，从1号与2号豆柏原料到复合益菌肽产品，ELISA试剂盒测定的 抗原蛋白去除率也分别达到91. 98%与93. 21%。
[0063] 表2显示了两种豆柏经处理制备为复合益菌肽产品后，酸溶蛋白（占粗蛋白，％ )、 KOH溶解度、游离氨基酸、单胃动物体外仿生消化率等指标的变化。从1号与2号豆柏原料 到复合益菌肽产品，酸溶蛋白/cp的增幅分别为27. 64%与29. 15%，KOH溶解度的增幅分 别为14. 13%与16. 81%，游离氨基酸的增幅分别为9. 34%与9. 26%，体外蛋白消化率的增 幅分别为13. 82%与13. 51%。这些指标的变化，主要得益于专一性菌酶复配发酵剂对豆柏 的生物酶解与发酵处理，也与之前的大分子蛋白几乎完全降解为小分子蛋白试验结果相对 应。该复合益菌肽产品用于乳仔猪料的制备，更加有利于蛋白类营养的吸收与消化，并可有 效避免大分子抗原蛋白引起的应激性反应。
[0064] 表1表明豆柏原料经生物处理后制备为复合益菌肽的抗原蛋白ELISA试剂盒测 定结果
【权利要求】
1. 一种复合益菌肽，其特征在于它由菌酶复配发酵剂添加到豆柏中发酵而成，所述菌 酶复配发酵剂由四种益生菌、四种蛋白酶和碳源复合而成，所述四种益生菌分别为丁酸梭 菌、短小芽孢杆菌S3、植物乳杆菌和布拉酵母菌；所述四种蛋白酶分别为酸性蛋白酶、中 性蛋白酶、碱性蛋白酶和多肽蛋白酶；所述短小芽孢杆菌S3的分类命名为短小芽孢杆菌 應其保藏编号为：CGMCC No. 9161。
2. 根据权利要求1所述的复合益菌肽，其特征在于：所述四种益生菌在菌酶复配发酵 剂中的含菌量分别是：丁酸梭菌：不低于IX 1〇6 CFU/g ;短小芽孢杆菌S3 :不低于IX 106 CFU/g ;植物乳杆菌：不低于1 X 106 CFU/g ;布拉酵母菌：不低于1 X 105 CFU/g。
3. 根据权利要求1所述的复合益菌肽，其特征在于：所述四种蛋白酶在菌酶复配发酵 剂中的含量分别是：酸性蛋白酶：不低于500U/g ;中性蛋白酶：不低于1000U/g ;碱性蛋白 酶：不低于4000U/g ;多肽蛋白酶：不低于4500U/g。
4. 根据权利要求1所述的复合益菌肽，其特征在于：所述碳源为占菌酶复配发酵剂质 量9% -10%的葡萄糖。
5. 权利要求1-4任一项所述的复合益菌肽的制备方法，其特征在于它包括如下步骤： (1) 在豆柏中添加占豆柏质量50-60%的水形成发酵底料，接种占豆柏质量10%的所述 菌酶复配发酵剂，混合均匀形成发酵物料； (2) 将所述发酵物料储存于锡箔密封袋内，于200°C封口，置于37°C恒温培养箱内，发 酵 72h ; (3) 发酵完成后，低温烘干，粉碎过筛，形成所述复合益菌肽。
6. 根据权利要求5所述的复合益菌肽的制备方法，其特征在于：所述步骤（3)中发酵 物料于40°C低温烘干，粉碎过60目筛。
7. 权利要求1-4任一项所述的复合益菌肽在制备用于饲喂乳仔猪的饲料添加剂中的 应用。
8. 根据权利要求7所述的复合益菌肽在制备用于饲喂乳仔猪的饲料添加剂中的应用， 其特征在于：所述复合益菌肽以占饲料质量比为5-15%的比例添加到饲料中。
9. 根据权利要求7所述的复合益菌肽在制备用于饲喂乳仔猪的饲料添加剂中的应用， 其特征在于：所述复合益菌肽拮抗猪粪大肠菌群。
【文档编号】A23K1/14GK104222493SQ201410360547
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年7月25日 优先权日:2014年7月25日
【发明者】李慧芬, 张大伟, 马成 申请人:青岛尚德生物技术有限公司