紫海杂交扇贝恢复系的构建方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种紫海杂交扇贝恢复系的构建方法及应用。该恢复系是能使雄性不育系后代恢复雄性可育特性的海湾扇贝品系，其中紫海杂交扇贝是紫扇贝卵子与海湾扇贝精子的杂交后代。其构建方法是选择雄性不育系中的优良个体，用不同的海湾扇贝连续回交，直到后代全部为雌雄同体时，即获得该雄性不育系的恢复系。最后用恢复系与相应的雄性不育系杂交生产紫海杂交扇贝商品苗种。本发明首次在动物中建立了雄性不育系恢复系，有效克服了雌雄同体扇贝杂交中自体受精的障碍，且生产的紫海杂交扇贝当年产量比海湾扇贝提高40％以上。
【专利说明】紫海杂交扇贝恢复系的构建方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于贝类育种技术--杂交扇贝商品苗种培育方法，尤其是涉及一种紫海杂交扇贝(紫扇贝卵子与海湾扇贝精子的杂交后代)恢复系的构建方法及应用。
【背景技术】
[0002]海湾扇贝(Argopecten irradians irradians)原产于美国大西洋沿岸，于1982年引入我国。海湾扇贝生长速度快，温度适应范围广，抗逆性强，非常适合我国北方海域的养殖，目前产量和养殖面积占我国扇贝养殖的50%以上。但是由于引进后长期近交，海湾扇贝在养殖过程中种质退化严重，表现为商品贝规格越来越小，育苗养殖过程中死亡率较高，因此扇贝养殖业迫切需要对海湾扇贝进行遗传改良，其中杂交育种是最有效的种质改良方法之一。
[0003]为此，发明人自2007年首次从秘鲁引进了紫扇贝(Argopecten purpuratus)。紫扇贝是原产于南太平洋的一种速生型中型扇贝，与海湾扇贝都属于Argopecten属，染色体数相同，且都是雌雄同体，但二者在个体大小、生长和温度适应性等方面性状互补。因此发明人又通过将紫扇贝与海湾扇贝进行种间杂交，培养出正交(紫扇贝卵子和海湾扇贝精子受精)和反交(海湾扇贝卵子和紫扇贝精子受精)两种杂交子一代。杂交子一代的个体重比同期培育的海湾扇贝提高约100%，当年可长到7-8公分，而且第二年可继续养殖达到更大规格，个体重达到200克以上，其抗逆性增强，特别是在山东地区能够顺利度夏和越冬，显示出巨大的产业潜力(王春德等，2009.紫扇贝与海湾扇贝种间杂交的研究。海洋科学，33(10):84-87 ；Chunde Wang 等，2011.1ntroduct1n of the Peruvian scallop and itshybridizat1n with the bay scallop in China, Aquaculture, 2011，310:380-387)。
[0004]上述杂交子一代虽然可以产生较大的杂种优势，但是要大面积推广仍存在着较大的困难，这是因为海湾扇贝和紫扇贝都是雌雄同体的扇贝，繁殖时同时排放精子和卵子，排放的卵子容易受到同种精子的污染，难以大量获得未受精卵用于种间杂交，从而导致所获得的商品苗种中真正的杂交后代比例大大降低，因而使其产量的提高幅度大大受限。
[0005]研究发现，上述两种Argopecten扇贝的雌雄同体特性与许多农作物的雌雄同株特性相似。在雌雄同株的农作物育种中也存在着同花授粉的问题，需要人工去雄，这一点与紫扇贝与海湾扇贝杂交过程中遇到的自体受精问题相似。农业上解决这个问题的关键依赖于雄性不育植株的发现，利用雄性不育株与其父本连续回交，就可以选育出雄性不育系、保持系和恢复系，以此来构建农作物育种中的恢复系，实现杂交种的大规模生产，从而解决杂交制种难题。迄今为止，国内外已经在众多的农作物中建立了恢复系，并广泛应用于杂交种的生产中，成为大幅度提高农作物产量的主要途径。
[0006]但是在动物育种中，国内外迄今为止尚无发现雄性不育且雌性可育个体的报道，因而也无法建立类似于农作物的雄性不育系、保持系和恢复系，用于杂交育种。显然，如果在动物育种中能够构建起类似的包括雄性不育系、保持系和恢复系的恢复系，也就可以实现雌雄同体型动物的低成本、规模化种间杂交，提高杂交效率,提高育种动物的抗逆性和产量，从而实现动物育种技术的重大突破。恢复系是利用雄性不育系实现杂交扇贝苗种商品化生产所必需的父本品系。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是实现在动物育种中，具体地说是在雌雄同体型扇贝中首次构建紫海杂交扇贝恢复系，以克服现有杂交扇贝育种技术的不足。
[0008]本发明的另一目的是利用上述恢复系与相应的雄性不育系杂交，建立大规模、低成本生产紫海杂交扇贝苗种的应用方法。
[0009]上述的雄性不育系是雄性性腺发育不正常，不能产生有功能的精子，但其卵子发育正常，能接受正常精子而受精，并能将其雄性不育特性遗传给后代的品系。显然雄性不育系是三系配套体系中的核心品系，其主要作用是在杂交苗种商业化生产中提供大量的未受精卵子，同时其繁育依赖于与其配套的保持系。雄性不育系是利用偶然发现的雄性不育且卵子可育的个体与其父本连续回交建立回交家系，当回交家系的所有个体均为雄性不育且卵子可育时所获得的杂交扇贝品系。
[0010]恢复系又称雄性不育系恢复系，用它的精子给雄性不育系的卵子受精后，所产生的杂交后代雌性和雄性育性均恢复正常。恢复系是能够正常繁育的雌雄同体品系，可以通过自交繁育下一代恢复系。在动物育种中，恢复系的作用是提供精子与雄性不育系的卵子受精，以实现优良商品杂交苗种的培育。
[0011]本发明基于以下构思和实践:1)发明人研究发现了紫海杂交扇贝(紫扇贝卵子与海湾扇贝精子的杂交后代)子一代中存在5-10%的雄性不育个体，这些个体不产生有活性的精子，但其卵子可以被海湾扇贝的精子受精，且所获得的受精卵能够正常发育，即获得了回交扇贝；2)用海湾扇贝精子与紫海杂交扇贝中雄性不育个体的卵子回交所培育的回交扇贝养成后约90%个体仍表现为雌雄同体，因此可以通过建立多个回交家系并进行配合力测验的方法，选育出其后代全部为雌雄同体且性状优良的雄性不育系(母本)_海湾扇贝(父本)组合，这个组合中的海湾扇贝品系具有使雄性不育系恢复雄性育性的能力，即获得紫海杂交扇贝雄性不育系的恢复系；3)通过将这些恢复系的精子与相应的雄性不育种贝杂交，能实现方便、高效、规模化生产紫海杂交扇贝商品苗种，且所获得的杂交扇贝商品苗种在生长、个体大小和温度耐受性方面具有显著的优势。
[0012]本发明的紫海杂交扇贝恢复系的构建方法如下:
[0013]从紫海杂交扇贝雄性不育系中选择大个体扇贝，促熟产卵后分别用性状优良的不同海湾扇贝精子授精，建立大量的回交家系，同时将供精的海湾扇贝自繁建立自交家系，测量杂交后代的生长和存活情况并进行配合力测验；从第二年起每年根据配合力测验结果和性腺发育情况，选择其中性状优良且含有雌雄同体扇贝的回交家系，将与其相关的雄性不育家系种贝连续与供精的海湾扇贝杂交家系精子回交建立回交家系，直到回交家系全部为雌雄同体且性状优良，则将供精的海湾扇贝自交家系用常规的海湾扇贝育苗方法自交扩繁，即获得该雄性不育系的恢复系。恢复系的作用是提供精子与雄性不育系的卵子受精，以实现优良商品杂交苗种的培育。恢复系为雌雄同体且正常发育的海湾扇贝品系，因此通过常规的海湾扇贝群体自交方法繁育下一代恢复系。
[0014]本发明的紫海杂交扇贝恢复系的应用方法如下:
[0015]首先按照5:1的比例选择紫海杂交扇贝的雄性不育系和恢复系种贝，并按常规方法促熟后分别刺激雄性不育系种贝产卵和恢复系种贝产卵排精，再将该恢复系的精卵混合液用500目筛絹过滤即获得恢复系的精液，将恢复系的精液加入产卵池中并搅拌，且加入精子的量以每个卵子周围有5-6个精子为宜，最后按常规方法孵化后即获紫海杂交扇贝商品苗种。
[0016]本发明的恢复系构建方法也应用于海紫杂交扇贝(海湾扇贝卵子与紫扇贝精子的杂交后代)、紫墨杂交扇贝(紫扇贝卵子与墨西哥湾扇贝精子的杂交后代)和墨紫杂交扇贝(墨西哥湾扇贝卵子与紫扇贝精子的杂交后代)等Argopecten属杂交扇贝的育种实践，并且应用于建立这些杂交扇贝商品苗种的规模化生产方法。
[0017]本发明的方法同样适用于其他雌雄同体型扇贝的种间杂交育种，例如Pecten属扇贝的种间杂交，本发明的基本方法也适用于其他雌雄同体型无脊椎动物的种间杂交育种。
[0018]本发明构建的紫海杂交扇贝恢复系是首次在动物界中建立的扇贝的恢复系，应属于动物育种技术中的重大突破。本发明有效克服了雌雄同体扇贝杂交过程中自体受精的障碍，实现了低成本和规模化获得完全的杂交后代，因此可充分利用杂种优势，达到了使所培育的紫海杂交扇贝商品苗种同时具有海湾扇贝和紫扇贝的特性，在生长、个体大小和温度耐受性方面比海湾扇贝具有显著优势，因此能在北方海区如青岛、大连等海域成功养殖，且当年产量可比海湾扇贝提高40 %以上。
【具体实施方式】
[0019]本发明构建了紫海杂交扇贝的恢复系，并建立了用恢复系与相应的雄性不育系杂交生产紫海杂交扇贝商品苗种的方法，具体步骤如下:
[0020]实施例1
[0021]1)紫海杂交扇贝恢复系的选育:选择紫海杂交扇贝雄性不育系中的大个体扇贝50个，促熟产卵后分别用不同海湾扇贝的精子受精，建立至少20个回交家系，同时将供精的海湾扇贝自繁建立自交家系，测量回交后代的生长和存活情况并进行配合力测验；从第二年起每年根据配合力测验结果和性腺发育情况选择其中性状优良且含有雌雄同体扇贝的回交家系，将与其相关的雄性不育家系种贝连续与供精的海湾扇贝杂交家系精子回交建立回交家系，直到回交家系全部为雌雄同体且性状优良，则将供精的海湾扇贝家系自交扩繁，即获得该紫海杂交扇贝雄性不育系的恢复系，用于紫海杂交扇贝商品苗种的规模化生产。
[0022]2)用恢复系生产紫海杂交扇贝商品苗种的方法:春季育苗时按照5:1的比例选择雄性不育系和恢复系种贝促熟后，在产卵池中刺激雄性不育系种贝产卵，在水桶中刺激恢复系种贝排精，并用500目筛絹过滤获得不含卵子的恢复系海湾扇贝精液；将恢复系的精液均匀泼洒到产卵池中并立即搅拌，随时取样在显微镜下观察受精情况，精液加入量以每个卵子周围有5-6个精子为宜；受精卵按照常规方法孵化，发育后即获得紫海杂交扇贝商业苗种。
[0023]实施例2
[0024]2008年3月底，取性腺发育成熟的紫扇贝，经温度刺激后获得紫扇贝卵子，用海湾扇贝的精子授精后获得紫扇贝与海湾扇贝杂交子一代苗种并养成。2009年春天，将上述杂交子一代扇贝促熟后从中选择个体大且仅雌区发育的扇贝，阴干30分钟后将扇贝置于盛有23°C海水的容器中刺激产卵，以来自多个海湾扇贝的精子混合授精，培育出子一代紫海杂交扇贝与海湾扇贝的回交群体。该回交群体在2010年春季促熟后大部分表现为雌雄同体，但还有〈10%的个体仍表现为雄性不育。
[0025]继续将上述雄性不育的个体用其父本海湾扇贝自交后代的精子回交，经过一代至多代选育就可获得后代全部为雄性不育且卵子可育的雄性不育系(母本)_保持系(父本)组合，从而分别获得雄性不育系和保持系。性腺促熟后用常规海湾扇贝产卵诱导方法催产雄性不育系扇贝可获得大量未受精的卵子，将其用保持系的精子受精，就可大规模获得用于紫海杂交扇贝商品苗种生产的雄性不育系种贝。
[0026]将上述组合中的雄性不育系扇贝的卵子用不同的非相关海湾扇贝的精子受精，建立至少20个回交家系并进行配合力测验，选择后代含有雌雄同体扇贝的家系，将其母本雄性不育系种贝继续用供精的海湾扇贝自交家系的精子受精，并根据生长性状和性腺发育情况连续选育，直到回交后代全部为雌雄同体且性状优良，就获得受精后使雄性不育系后代均为雌雄同体且性状优良的恢复系海湾扇贝家系。
[0027]最后将上述获得的紫海杂交扇贝的雄性不育系种贝性腺促熟后，用常规的海湾扇贝催产方法获得大量未受精的卵子，将其用恢复系的精子受精，就可大规模生产紫海杂交扇贝商品苗种。
[0028]实施例3
[0029]2010年春天，选择2009年建立的紫扇贝卵子与海湾扇贝精子杂交子一代中雄性不育的个体，经促熟后刺激产卵，用海湾扇贝的精子受精，建立了 12个回交家系并养成。2011年春天促熟后发现，其中的11个家系大部分个体表现为雌雄同体，而其中的1个家系的大部分个体仅雌区发育，少量个体性腺不发育。
[0030]依此方法，将其中的单个雄性不育个体的卵子与单个海湾扇贝的精子回交建立若干回交家系，并将供精的海湾扇贝自交建立相应的自交家系。第二年检查回交家系的性腺发育情况，若回交家系全部为雌雄同体的扇贝，则仅需选择一代就获得了雄性不育系-恢复系组合；若回交家系仅有部分为雌雄同体，则用雄性不育扇贝继续与相应的海湾扇贝自交家系的精子回交建立回交家系，同时继续建立父本海湾扇贝的自交家系，进行下一代选育；经一代或多代选育后，当回交后代全部为雌雄同体时，就获得了该雄性不育系的恢复系。
[0031]实施例4
[0032]2012年用紫海杂交子一代家系中仅卵区发育的雄性不育个体，经刺激后其中有11个雄性不育个体产卵，将这些卵子与单个海湾扇贝的精子回交，大部分个体的卵子不能正常受精，少数虽能够受精但大部分发育不正常，仅仅发育出带纤毛的畸形胚胎。但产卵的11个个体中有1个个体的卵子能够正常发育，从而培育出回交家系并养殖到成体阶段。在2012年11月中旬收获时，与同期的海湾扇贝比较，回交家系的壳高、壳长、壳宽和体重分别提高34.1%、29.8%、23.0%和111.5%，杂种优势极其显著。2013年春季将回交扇贝促熟后，发现后代全部为雌雄同体，证明通过用海湾扇贝精子与雄性不育个体回交完全能成功选育出紫海杂交扇贝雄性不育系的恢复系。
[0033]实施例5
[0034]2013年和2014年，利用引进的紫扇贝与海湾扇贝共建立了紫扇贝卵子与海湾扇贝精子的杂交子一代家系18个，并建立了供精海湾扇贝的自交家系，按照实施例1的方法，可在1-3年内选育出紫海杂交扇贝的雄性不育家系及其相应的恢复系，实现紫海杂交扇贝苗种的商业化生产。
[0035]实施例6
[0036]本发明用于海紫杂交扇贝恢复系的构建及应用
[0037]本发明建立的恢复系的构建方法也应用于海紫杂交扇贝(海湾扇贝卵子与紫扇贝精子的杂交后代)的育种，并且应用于建立海紫杂交扇贝商品苗种的规模化生产方法。
[0038]首先选择海紫杂交扇贝雄性不育系中的若干大个体扇贝，刺激产卵后用多个非相关紫扇贝的精子受精，若回交家系全部为雌雄同体的扇贝，则仅需选择一代就获得了雄性不育系-恢复系组合；若回交家系仅有部分为雌雄同体，则用雄性不育扇贝继续与相应的紫扇贝自交家系的精子回交建立回交家系，同时继续建立父本紫扇贝的自交家系，进行下一代选育；经一代或多代选育后，当回交后代全部为雌雄同体时，就获得了海紫杂交扇贝雄性不育系的恢复系。
[0039]用上述海紫杂交扇贝的雄性不育系卵子与保持系的精子杂交，即可实现高效、方便、规模化生产海紫杂交扇贝雄性不育种贝；用海紫杂交扇贝雄性不育种贝与恢复系的精子杂交，即可实现高效、方便、规模化生产海紫杂交扇贝苗种。
[0040]实施例7
[0041 ] 本发明用于紫墨杂交扇贝恢复系的构建及应用
[0042]本发明建立的恢复系的构建方法也应用于紫墨杂交扇贝(紫扇贝卵子与墨西哥湾扇贝精子的杂交后代)育种，并且应用于建立紫墨杂交扇贝商品苗种的规模化生产方法。
[0043]首先选择紫墨杂交扇贝雄性不育系中的若干大个体扇贝，刺激产卵后用多个非相关墨西哥湾扇贝的精子受精，若回交家系全部为雌雄同体的扇贝，则仅需选择一代就获得了雄性不育系-恢复系组合；若回交家系仅有部分为雌雄同体，则用雄性不育扇贝继续与相应的墨西哥湾扇贝自交家系的精子回交建立回交家系，同时继续建立父本墨西哥湾扇贝的自交家系，进行下一代选育；经一代或多代选育后，当回交后代全部为雌雄同体时，就获得了紫墨杂交扇贝雄性不育系的恢复系。
[0044]用上述紫墨杂交扇贝的雄性不育系卵子与保持系的精子杂交，即可实现高效、方便、规模化生产紫墨杂交扇贝雄性不育种贝；用紫墨杂交扇贝雄性不育种贝与恢复系的精子杂交，即可实现高效、方便、规模化生产紫墨杂交扇贝苗种。
[0045]实施例8
[0046]本发明用于墨紫杂交扇贝恢复系的构建及应用
[0047]本发明建立的恢复系的构建方法也应用于墨紫杂交扇贝(墨西哥湾扇贝卵子与紫扇贝精子的杂交后代)育种实践，并且应用于建立墨紫杂交扇贝商品苗种的规模化生产方法。
[0048]首先选择墨紫杂交扇贝雄性不育系中的若干大个体扇贝，刺激产卵后用多个非相关紫扇贝的精子受精，若回交家系全部为雌雄同体的扇贝，则仅需选择一代就获得了雄性不育系-恢复系组合；若回交家系仅有部分为雌雄同体，则用雄性不育扇贝继续与相应的紫扇贝自交家系的精子回交建立回交家系，同时继续建立父本紫扇贝的自交家系，进行下一代选育；经一代或多代选育后，当回交后代全部为雌雄同体时，就获得了墨紫杂交扇贝雄性不育系的恢复系。
[0049]用上述墨紫杂交扇贝的雄性不育系卵子与保持系的精子杂交，即可实现高效、方便、规模化生产墨紫杂交扇贝雄性不育种贝；用墨紫杂交扇贝雄性不育种贝与恢复系的精子杂交，即可实现高效、方便、规模化生产墨紫杂交扇贝苗种。
【权利要求】
1.一种紫海杂交扇贝恢复系，其特征在于该恢复系是能使雄性不育系后代恢复雄性可育特性的海湾扇贝品系，其中紫海杂交扇贝是紫扇贝卵子与海湾扇贝精子的杂交后代。
2.权利要求1的紫海杂交扇贝恢复系的构建方法，其特征在于: 选择紫海杂交扇贝雄性不育系中的优良个体，促熟产卵后分别用来自不同个体的海湾扇贝精子授精，建立20个以上回交家系，同时将供精的海湾扇贝自繁建立自交家系，测量杂交后代的生长和存活情况并进行配合力测验；从第二年起每年根据配合力测验结果和性腺发育情况，选择其中性状优良且含有雌雄同体扇贝的回交家系，将与回交家系相关的雄性不育家系种贝连续与供精的海湾扇贝杂交家系精子回交，建立回交家系，直到回交家系全部为雌雄同体且性状优良，则将供精的海湾扇贝自交家系用常规的扇贝育苗方法自交扩繁，即获得该雄性不育系的恢复系。
3.上述权利要求1和权利要求2的紫海杂交扇贝雄性不育系恢复系应用于生产紫海杂交扇贝商品苗种，即用恢复系的精子与相应的紫海杂交扇贝雄性不育系的卵子杂交，获得紫海杂交扇贝商品苗种。
4.权利要求2建立的紫海杂交扇贝恢复系的构建方法也应用于以下各杂交扇贝的育种: (1)用海湾扇贝卵子与紫扇贝精子受精培育的海紫杂交扇贝； (2)用紫扇贝卵子与墨西哥湾扇贝精子受精培育的紫墨杂交扇贝； (3)用墨西哥湾扇贝卵子与紫扇贝精子受精培育的墨紫杂交扇贝。
5.权利要求3建立的紫海杂交扇贝雄性不育系恢复系的应用方法也应用于以下各杂交扇贝的育种: (1)用海湾扇贝卵子与紫扇贝精子受精培育的海紫杂交扇贝； (2)用紫扇贝卵子与墨西哥湾扇贝精子受精培育的紫墨杂交扇贝； (3)用墨西哥湾扇贝卵子与紫扇贝精子受精培育的墨紫杂交扇贝。
6.权利要求2建立的紫海杂交扇贝雄性不育系恢复系的构建方法也应用于其他雌雄同体型扇贝，例如Argopecten属和Pecten属扇贝的种间杂交育种。
7.权利要求3建立的紫海杂交扇贝雄性不育系恢复系应用方法也应用于其他雌雄同体型扇贝，例如Argopecten属和Pecten属扇贝的种间杂交育种。
8.权利要求2建立的紫海杂交扇贝雄性不育系恢复系的基本构建方法也应用于其他雌雄同体型无脊椎动物的种间杂交育种。
9.权利要求3建立的紫海杂交扇贝雄性不育系恢复系的应用方法也应用于其他雌雄同体型无脊椎动物的种间杂交育种。
【文档编号】A01K61/00GK104304098SQ201410429017
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年8月27日 优先权日:2014年8月27日
【发明者】王春德, 孙奎府, 马斌 申请人:青岛海弘达生物科技有限公司